免疫細(xì)胞分離及檢測技術(shù)

1、第十三章免疫細(xì)胞分離及檢測技術(shù)-4-JH本早考點(diǎn)1. 免疫細(xì)胞的分離2. 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測3. 淋巴細(xì)胞功能檢測技術(shù)4. 免疫細(xì)胞檢測的臨床意義第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離一、外周血單個核細(xì)胞的分離1. 原理：外周血中單個核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)的比重與紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞及血小板不同，介于1.0751.090之間，紅細(xì)胞及粒細(xì)胞在1.092左右，血小板在 1.0301.035之間。因而可利用一種比重介于1.0751.092之間，而近于等滲的溶液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布 而加以分離。2. 試劑：常用的分層液有Ficoll與Percoll兩種(1) Ficoll分層液法

2、：主要用于分離外周血中單個核細(xì)胞，是一種單次密度梯度離心分離法，其分布 由上到下依次為：稀釋的血漿層，單個核細(xì)胞層，粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。Ficoll分層液即聚蔗糖-泛影葡胺, 是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特 點(diǎn)。操作時，將分層液置于試管下層，然后將肝素化的全血或白細(xì)胞懸液以Hanks或PBS液稀釋后，輕輕鋪于分層液面上，經(jīng) 2000rpm15-20min離心后，紅細(xì)胞與粒細(xì)胞因比重大于分層液，故較快沉于管底。血 小板則比重小于分層液而懸浮于血漿中。唯有與分層液比重相當(dāng)?shù)膯魏思?xì)胞和淋巴細(xì)胞密集于血漿層和分 層液的界面中。其分布由上到下

3、依次為：稀釋的血漿層，單個核細(xì)胞層，粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。見下圖。圖聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法外周血小分布示意圖引自陶義訓(xùn)主編：免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)，人民衛(wèi)生出版社1995年9月第1版第4次印刷*雋出倒血衆(zhòng)孫詡糾卻個核拓記離心厲(2) Percoll分層液法：是一種連續(xù)密度梯度離心分離法，其分布由上至下依次為：死細(xì)胞層，富含 單核細(xì)胞組分層，富含淋巴細(xì)胞的組分層及紅細(xì)胞與粒細(xì)胞組分層。圖連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖引自陶義訓(xùn)主編：免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)，人民衛(wèi)生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴細(xì)胞的分離1. 純淋巴細(xì)胞群的采集：利用單核細(xì)胞在37C和C

4、aT存在時，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，從單個核細(xì)胞懸液中除去單核細(xì)胞，從而獲得純淋巴細(xì)胞群。主要的方法有：粘附貼壁法；吸附柱過濾法；磁鐵吸引法。2. 淋巴細(xì)胞亞群的分離原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化。根據(jù)細(xì)胞的特性和 標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法是陽性選擇法，而選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞為陰性選擇。 常用的方法包括：E花環(huán)沉降法；尼龍毛柱分離法；親和板結(jié)合分離法；磁性微球分離法及熒光激 活細(xì)胞分離儀分離法。三、淋巴細(xì)胞的保存與活力測定1. 淋巴細(xì)胞的保存技術(shù)(1) 短期保存技術(shù)：將分離的細(xì)胞用適量含10%20%滅活小牛血清的 Ha

5、nks、Tc-199、RPMII640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。短期保存可置于4C保存。(2) 長期保存技術(shù)：液氮深低溫(-196C)環(huán)境保存細(xì)胞，加入二甲亞砜作為保護(hù)劑。2. 活力測定：最簡便常用的為臺盼藍(lán)染色法 。臺盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，這種染料不能 透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故 活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色，通過死亡細(xì)胞與活細(xì)胞的百分比可反映細(xì)胞活力。第二節(jié) 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測1. 特異性抗原檢測：用單克隆抗體檢測 T 細(xì)胞表面抗原的方法有兩大類：一類是用標(biāo)記抗體染色，如免疫熒光法、酶免疫

6、法、ABC法及免疫金銀染色法；另一類用抗體致敏的紅細(xì)胞作花環(huán)試驗(yàn)。2. 特異性受體的檢測原理： T細(xì)胞表面有特異性綿羊紅細(xì)胞（E）受體，當(dāng)人的T細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞懸液按一定比例混合后，置 4C至少2小時或過夜，T細(xì)胞表面的E受體可與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合形成玫瑰花樣的 花環(huán)，稱為活性 E （Ea）花環(huán)。檢測Ea花環(huán)形成細(xì)胞可反映受檢者的細(xì)胞免疫水平。3. T 細(xì)胞亞群檢測：見第二十二章流式細(xì)胞儀分析技術(shù)。二、B 細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測B細(xì)胞具有多種特異性抗原和受體，據(jù)此建立了相應(yīng)的檢測方法，一般用以研究B細(xì)胞各分化發(fā)育階段的特性，也可藉以鑒定和計(jì)數(shù)各階段B細(xì)胞在人外周血和淋巴樣組織的分布以及疾病時的變化動態(tài)

7、，為臨床提供診治相關(guān)疾病的有用信息。1. B細(xì)胞表面抗原的檢測： B細(xì)胞表面有CD19 CD20 CD21 CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全 部B細(xì)胞所共有，而有些僅活化B細(xì)胞所特有，據(jù)此可用相應(yīng)的 CD系列單克隆抗體，通過間接熒光免疫法、 酶免疫組化或ABC法加以檢測。2.Smlg的檢測：大多米用間接熒光免疫法或包括ABC法在內(nèi)的酶免疫組化法，關(guān)鍵是選用高效價、高特異性和高親和力的熒光或酶標(biāo)記的多價抗人 Ig 抗體， 也可分別用各種類型的 Ig ，即 IgM、IgG、IgA、IgE 等抗血清，檢測帶有各種類型lg的B細(xì)胞，在人外周血中以帶有SmlgM的細(xì)胞數(shù)為最多。B細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記

8、的抗 lg 抗體染色，細(xì)胞膜表面呈現(xiàn)的熒光著色可有不同的形式，開始均勻分布呈環(huán)狀，其后集中在某些 部位呈斑點(diǎn)狀，然后又可集在一個部位呈帽狀，最后可被吞飲入胞漿直至熒光消失。這一現(xiàn)象是由于淋巴 細(xì)胞膜由雙層類脂組成， 上嵌有蛋白分子， 在體溫條件下， 膜呈半液體狀， 而鑲嵌物能在其中移動。 當(dāng) Smlg 抗體發(fā)生結(jié)合時，由于抗血清為雙價，使Smlg出現(xiàn)交聯(lián)現(xiàn)象，這種抗原與抗體結(jié)合物可連成斑點(diǎn)和帽狀，時間過長，帽狀結(jié)合物可脫落或被吞飲而消失，因此染色后，觀察時間不能超過30mi n,或在染色時加疊氮鈉防止帽狀物形成或被吞飲。三、自然殺傷細(xì)胞（NK）及功能的檢測NK細(xì)胞表面至少存在 CD2 CD11

9、b CD11c CD16、CD56和 CD69等多種抗原，但均非 NK細(xì)胞所特有， 因此極少以CD系列抗原為指標(biāo)鑒定和計(jì)數(shù)NK細(xì)胞，現(xiàn)多檢測NK細(xì)胞活性，因NK細(xì)胞具有細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，它能直接殺傷靶細(xì)胞。測定人NK細(xì)胞活性多以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，而測小鼠NK細(xì)胞活性則用YAC細(xì)胞株，檢測方法多種多樣。1. 形態(tài)法：將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育，繼用臺盼藍(lán)或伊紅Y等活細(xì)胞拒染的染料處理，然后分別計(jì)數(shù)著染的死細(xì)胞和不著染的活細(xì)胞，推算NK細(xì)胞活性。2. 酶釋放法：將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育,離心沉淀,取上清液檢測靶細(xì)胞遭破壞后釋 放出的酶含量。3. 熒光法：用熒光素標(biāo)

10、記靶細(xì)胞,經(jīng)與效應(yīng)細(xì)胞共溫后,離心去上清,用熒光計(jì)檢測剩余的活靶細(xì)胞 的熒光。4. 核素法：將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合共溫后,離心檢測上清液或剩余靶細(xì)胞放射性的量, 間接反映其活性。方法有靶細(xì)胞胞漿釋放法和胞核釋放法兩種。2- -5. 化學(xué)發(fā)光法：當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸時，效應(yīng)細(xì)胞呼吸暴發(fā)， 生成極不穩(wěn)定的 0-及0H，放出光子，在發(fā)光劑存在條件下，可被光電倍增管接受和計(jì)數(shù)，發(fā)光量與NK細(xì)胞殺傷能力相關(guān)。第三節(jié) 淋巴細(xì)胞功能檢測技術(shù)、 T 細(xì)胞功能的檢測1. T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：又稱 T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。T細(xì)胞在體外經(jīng)某種物質(zhì)刺激，細(xì)胞代謝和形態(tài)相繼發(fā)生變 化，在2448h內(nèi)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的

11、合成增加，產(chǎn)生一系列增殖的變化，如細(xì)胞變大、細(xì)胞漿擴(kuò)大、 出現(xiàn)空泡、核仁明顯、核染色質(zhì)疏松等，由淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞。因此，這種淋巴細(xì)胞增殖又稱為 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。據(jù)此可判斷出淋巴細(xì)胞對有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)。（1）非抗原性刺激物：如植物血凝素（ PHA、刀豆素A （Co nA、美洲商陸（PWM、脂多糖（LPS）, 通稱促有絲分裂原。其中 LPS刺激B細(xì)胞，PWM可刺激T和B類細(xì)胞，PHA和ConA刺激T細(xì)胞增殖。（ 2）抗原性刺激物：如結(jié)核菌素、葡萄球菌毒素、破傷風(fēng)類毒素、鏈球菌激酶、腫瘤抗原、同種異型 組織抗原等 。2. T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)類型（1）形態(tài)法：其原則是將外周血液或分離的單

12、個細(xì)胞與適量的植物血凝素（PHA混合，置37C培養(yǎng)72h,取培養(yǎng)細(xì)胞作涂片染色鏡檢。據(jù)細(xì)胞的大小、核與胞漿的比例、胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及有無核仁 等特征，分別計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞、過渡性母細(xì)胞和核有絲分裂相以及成熟的小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì) 胞，每份標(biāo)本計(jì)數(shù) 200 個細(xì)胞，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。（2） 核素法：絕大多數(shù)外周血 T細(xì)胞通常處于細(xì)胞周期的G0期，受特異性抗原或促有絲分裂原激活后，從G0期進(jìn)入G期，開始合成蛋白質(zhì)、 RNA和DNA前體物質(zhì)等，為 DNA復(fù)制準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)，然后進(jìn)入 S期， 細(xì)胞合成DNA量倍增，此時若在培養(yǎng)液中加入3H標(biāo)記的TdR后者摻入新合成的 DNA中，據(jù)摻入的多少推測細(xì)胞

13、增殖程度。3. T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)： T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特性，凡致敏 T細(xì)胞再次遇相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，可表現(xiàn)出破壞和溶解靶細(xì)胞，它是評價機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種常用指標(biāo)。該試驗(yàn)原則 是選用適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞（常用可傳代的已建株的人腫瘤細(xì)胞如人肝癌、食管癌、胃癌等細(xì)胞株），經(jīng)培養(yǎng)后 制成一定濃度的細(xì)胞懸液，按一定比例與待檢的淋巴細(xì)胞混合，共溫育一定時間，觀察腫瘤細(xì)胞殺傷的情況。二、 B 細(xì)胞功能的檢測1. B細(xì)胞早期活性指標(biāo)的測定：B細(xì)胞經(jīng)不同抗原激發(fā)即開始分化增殖，初期表現(xiàn)為體積增大，可用儀器加以檢測。激活的B細(xì)胞表面MHO!類抗原的表達(dá)增多， 可用相應(yīng)的單克隆抗體通過熒光免疫或

14、ABC法檢測。2. 溶血空斑形成試驗(yàn)：經(jīng)典的溶血斑試驗(yàn)用于檢測實(shí)驗(yàn)動物抗體形成細(xì)胞的功能，其原理是將綿羊紅細(xì)胞（SRBC免疫小鼠，4天后取出脾細(xì)胞，加入 SRBC及補(bǔ)體，混合在溫?zé)岬沫傊芤褐?，澆在平皿?nèi)或 玻片上，使成一蒲層，置 37C溫育。由于脾細(xì)胞內(nèi)的抗體生成細(xì)胞可釋放抗SRBC抗體，使其周圍的 SRBC致敏，在補(bǔ)體參與下導(dǎo)致 SRBC溶血，形成一個肉眼可見的圓形透明溶血區(qū)而成為溶血空斑（plaque ）。每一個空斑表示一個抗體形成細(xì)胞，空斑大小表示抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。這種直接法所測的細(xì)胞為 IgM 生成細(xì)胞，其他類型 Ig 由于溶血效應(yīng)較低，不能直接檢測，可用間接檢測法，即在小

15、鼠脾細(xì)胞和SRBC混合時，再加抗鼠 Ig 抗體（如兔抗鼠 Ig ），使抗體生成細(xì)胞所產(chǎn)生的 IgG 或 IgA 與抗 Ig 抗體結(jié)合成復(fù)合 物，此時能活化補(bǔ)體導(dǎo)致溶血，稱間接空斑試驗(yàn)。但是上述直接和間接空斑形成試驗(yàn)都只能檢測抗紅細(xì)胞 抗體的產(chǎn)生細(xì)胞，而且需要事先免疫，難以檢測人類的抗體產(chǎn)生情況。如果用一定方法將SRBC用其它抗原包被，則可檢查與該抗原相應(yīng)的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，這種非紅細(xì)胞抗體溶血空斑試驗(yàn)稱為空斑形成試驗(yàn)，它的 應(yīng)用范圍較大?，F(xiàn)在常用的為 SPA-SRB（溶血空斑試驗(yàn)。SBA能與人及多數(shù)哺乳動物IgG的Fc段呈非特異性結(jié)合， 利用 這一特征，首先將 SPA包被SRBC然后進(jìn)行溶血空斑測

16、定，可提高敏感度和應(yīng)用范圍。在該測試系統(tǒng)中， 加入抗人lg抗體，可與受檢細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物上的Fc段可與連接在SRBC上的SPA結(jié)合，同時激活補(bǔ)體，使 SRBC溶解形成空斑。此法可用于檢測人類外周血中的IgG產(chǎn)生細(xì)胞，與抗 體的特異性無關(guān)。用抗IgA、IgG或IgM抗體包被SRBC可測定相應(yīng)免疫球蛋白的產(chǎn)生細(xì)胞，這種試驗(yàn)稱為 反相空斑形成試驗(yàn)。3. B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)（1）不同刺激物誘發(fā)增殖試驗(yàn)：抗IgM抗體和細(xì)菌脂多糖均能刺激B細(xì)胞增殖，培養(yǎng)13天以后，加3h-tdr，與淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)一樣，檢測細(xì)胞內(nèi)cpm,計(jì)算促有絲分裂原對淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)。也可用臺盼藍(lán)法計(jì)細(xì)

17、胞增殖或用DNA特異性染色觀察胞內(nèi) DNA或 RNA的分化程度。（2）葡萄球菌誘導(dǎo)試驗(yàn)：葡萄球菌coweni株（SAC）表面富含SPA該試驗(yàn)不依賴T細(xì)胞的參與，操作原則是將SAC與淋巴細(xì)胞按一定比例混合，按增殖試驗(yàn)法同樣操作和計(jì)數(shù)cmp值。葡萄球菌表面 SPA含量與激發(fā)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力成正比。溶血空斑形成試驗(yàn)可用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響，或評價免疫治療或免疫重 建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的功能。第四節(jié)免疫細(xì)胞檢測的臨床意義T細(xì)胞功能檢測主要用于判斷細(xì)胞免疫功能，B細(xì)胞功能檢測主要了解體液免疫功能。在淋巴細(xì)胞中，有一類細(xì)胞無需有抗體存在或預(yù)先加以致敏就有殺傷作用，這種作用是天然的，這一類淋

18、巴細(xì)胞為自然殺 傷細(xì)胞（NK，它的生物學(xué)活性有細(xì)胞毒作用、分泌細(xì)胞因子以及粘附功能，從而賦予NK細(xì)胞抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)控造血細(xì)胞分化等免疫功能。尤其在抗腫瘤的免疫監(jiān)視作用中處于第一道防線，腫瘤 病人NK細(xì)胞活性降低，在有免疫抑制情況時NK細(xì)胞活性也可降低，動態(tài)觀察有助于判定免疫增強(qiáng)類藥物的療效。習(xí)題68用Ficoll分層液分離外周血細(xì)胞，由上到下的依次是A. 稀釋的血漿層、粒細(xì)胞層、紅細(xì)胞層和單個核細(xì)胞層B. 稀釋的血漿層、單個核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層C. 稀釋的血漿層、紅細(xì)胞層、單個核細(xì)胞層和粒細(xì)胞層D. 稀釋的血漿層、紅細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和單個核細(xì)胞層E. 紅細(xì)胞層、單個核細(xì)胞

19、層、粒細(xì)胞層O答疑編號 500734130101正確答案B答案解析Ficoll分層液法：主要用于分離外周血中單個核細(xì)胞，是一種單次密度梯度離心分離法，其 分布由上到下依次為：稀釋的血漿層，單個核細(xì)胞層，粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。習(xí)題69 T、B細(xì)胞分離不能使用A. 花環(huán)沉降分離法B. 自然沉降法C尼龍纖維分離法D. 親和板結(jié)合法E. 流式細(xì)胞儀分離法*答疑編號 500734130102正確答案B答案解析常用的方法包括：E花環(huán)沉降法；尼龍毛柱分離法；親和板結(jié)合分離法；磁性微球分離法及熒光激活細(xì)胞分離儀分離法（即流式細(xì)胞儀分離法）。習(xí)題70 B淋巴細(xì)胞形成 EA花環(huán)是因?yàn)锽淋巴細(xì)胞表面有A. IgG的F

20、c受體B. 補(bǔ)體受體C. 綿羊紅細(xì)胞受體D. 絲裂原受體E. 病毒受體O答疑編號 500734130103正確答案 A答案解析EA花環(huán)試驗(yàn)是檢測細(xì)胞表面IgG的Fc受體的陽性細(xì)胞。（71-72共用題干）A. B淋巴細(xì)胞B. T淋巴細(xì)胞C. NK細(xì)胞D. K細(xì)胞E. 巨噬細(xì)胞習(xí)題71 LPS主要激發(fā)以下哪類細(xì)胞轉(zhuǎn)化O答疑編號 500734130104正確答案 A習(xí)題72 PHA主要激發(fā)以下哪類細(xì)胞轉(zhuǎn)化O答疑編號 500734130105正確答案B答案解析非抗原性刺激物：其中LPS刺激B細(xì)胞，PWM可刺激T和B類細(xì)胞，PHA和ConA刺激T細(xì)胞增殖。習(xí)題73用PHA激發(fā)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一般正常人外

21、周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為A. 30%-50%B. 50%-70%C. 60%-80%D. 70%-90%E. 90%-100%0答疑編號 500734130106正確答案C習(xí)題74 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)常用的檢測方法有A. 流式細(xì)胞儀法B. 形態(tài)學(xué)方法C. 51Cr釋放法D. MTT檢測法E. 3H-TdR摻入法O答疑編號 500734130107正確答案 B D E習(xí)題75在進(jìn)行受者血清中細(xì)胞毒預(yù)存抗體測定時，運(yùn)用臺盼藍(lán)染色法，下列敘述正確的是A. 著色者為死細(xì)胞，有細(xì)胞毒性預(yù)存抗體存在B. 著色者為活細(xì)胞，有細(xì)胞毒性預(yù)存抗體存在C. 著色者為死細(xì)胞，無細(xì)胞毒性預(yù)存抗體存在D. 不著色者為死細(xì)胞，

22、無細(xì)胞毒性預(yù)存抗體存在E. 不著色者為死細(xì)胞，有細(xì)胞毒性預(yù)存抗體存在Q答疑編號 500734130108正確答案 A答案解析活力測定：最簡便常用的為臺盼藍(lán)染色法。臺盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，這種染 料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過 細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色，通過死亡細(xì)胞與活細(xì)胞的百分比可反映細(xì)胞活力。習(xí)題76關(guān)于溶血空斑試驗(yàn)，錯誤的是A. 需要有綿羊紅細(xì)胞和補(bǔ)體參與B. 每個空斑表示多個抗體生成細(xì)胞C. 利用SPA與人IgG的Fc段結(jié)合D. 可檢測IgG、IGM IgA生成細(xì)胞E. 可用于機(jī)體體液免疫功能O答疑編號

23、 500734130109正確答案B習(xí)題77利用間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)行B細(xì)胞計(jì)數(shù)，是利用 B細(xì)胞表面的A. 補(bǔ)體受體B. EB病毒受體C. SmIgD. Fc受體E. 小鼠紅細(xì)胞受體O答疑編號 500734130110正確答案C習(xí)題78測定B淋巴細(xì)胞SmIg的常用方法有A. 免疫比濁法B. 酶免疫技術(shù)C. 免疫熒光法D. 放射免疫法E. 沉淀反應(yīng)O答疑編號 500734130500734正確答案 B C第十四章吞噬細(xì)胞功能檢測及應(yīng)用（略）第十五章細(xì)胞因子測定及應(yīng)用本早考點(diǎn)1. 細(xì)胞因子的概述2. 測定方法及應(yīng)用細(xì)胞因子在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程中起重要作用。檢測這類因子

24、不 僅是基礎(chǔ)免疫研究的有較手段，亦是臨床上探索疾病發(fā)病機(jī)制、判斷預(yù)后和考核療效的指標(biāo)。第一節(jié)細(xì)胞因子的概述（一）概念細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一大類能在細(xì)胞問傳遞信息，具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分 子多肽。（二）共同特性（1）化學(xué)性質(zhì)大都為糖蛋白。（2）細(xì)胞因子可以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用。（3）一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，不同類型的細(xì)胞可產(chǎn)生一種或幾種相同的細(xì)胞因子。（三）類型 細(xì)胞因子分類按其作用大致可分為免疫調(diào)節(jié)因子和免疫調(diào)控因子兩大類。主要的細(xì)胞因子有：白細(xì)胞 介素、干擾素、生長因子、趨化因子家族、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、轉(zhuǎn)化因子家族以及其他細(xì)胞因 子等。1.

25、白細(xì)胞介素：白細(xì)胞介素（ IL ）是指免疫應(yīng)答過程中白細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞因子，名稱后加阿拉 伯?dāng)?shù)字以示區(qū)別?，F(xiàn)在已取得克隆化的基因、明確產(chǎn)物性質(zhì)和活性的白細(xì)胞介素成員有 15 個 IL 在免疫細(xì) 胞的成熟、活化、增生和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)生重要作用，此外 IL 還參與機(jī)體的多種生理及病理 反應(yīng)。（1） IL-1 、IL-2 的性質(zhì)及生物活性1） IL-1 的性質(zhì)： IL-1 的產(chǎn)生細(xì)胞：幾乎所有的有核細(xì)胞均可產(chǎn)生 IL-1 ，主要以巨噬細(xì)胞為主， IL-1 分子有IL-1 a和IL-1 3兩種不同分子形式。所有的有核細(xì)胞表面， 都有IL-1受體（IL-1R ），也分為IL-1R 和 I

26、L-2R 兩類。IL-1的生物活性：局部免疫調(diào)節(jié)作用：與抗原協(xié)同作用；促進(jìn)B細(xì)胞生長和分化及抗體形成；促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞等APC的抗原遞呈能力；與IL-2或干擾素協(xié)同增強(qiáng) NK細(xì)胞活性；吸引中性粒細(xì)胞， 引起炎癥介質(zhì)釋放；刺激多種不同的間質(zhì)細(xì)胞釋放蛋白分解酶并產(chǎn)生一些效應(yīng)。全身性作用：有較強(qiáng) 的致熱源作用；對IL-1的生成具有反饋調(diào)節(jié)作用；合成和分泌大量的急性蛋白；使骨髓細(xì)胞庫的中 性粒細(xì)胞的釋放和活化；與CFS協(xié)同促進(jìn)骨髓造血祖細(xì)胞的增殖能力。2）IL-2的性質(zhì)：IL-2的產(chǎn)生細(xì)胞：IL-2主要由T細(xì)胞（CD4）受抗原或絲裂原刺激后合成。IL-2分子量為15KD，是含有113個氨基酸殘基的糖

27、蛋白，具有一定的種屬特異性。IL-2受體：T細(xì)胞，NK細(xì)胞，B細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞表面均可表達(dá)IL-2R。IL-2的生物活性：刺激 T細(xì)胞生長；誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用；促進(jìn)B細(xì)胞生長分化；增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗原遞呈能力、殺菌力及細(xì)胞毒性。2. 干擾素（1）性質(zhì)與類型：干擾素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白，根據(jù)其產(chǎn)生細(xì)胞的不同分為3類：a型、3型、丫型，根據(jù)干擾素的產(chǎn)生細(xì)胞、受體和活性等綜合因素分為2種類型：i型和n型。I型干擾素又稱抗病毒干擾素，其生物活性以抗病毒為主；n型干擾素又稱免疫干擾素或IFN Y ,主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，主要活性是參與免疫調(diào)節(jié)，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)

28、因子。（2）誘發(fā)機(jī)制：正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素作用下才能誘使細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。I型干擾素的主要誘生劑是病毒及人工合成雙鏈RNA某些細(xì)菌和原蟲感染及某些細(xì)胞因子也能誘導(dǎo)產(chǎn)生。n型干擾素在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后由cd8t細(xì)胞和cd4t細(xì)胞產(chǎn)生，nk細(xì)胞亦可合成少量IFN 丫。（ 3）生物學(xué)活性：干擾素的生物活性有較嚴(yán)格的種屬特異性，即某一種屬細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素，只能作 用于相同種屬的細(xì)胞。主要有抗病毒作用、抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用。3. 腫瘤壞死因子（1）性質(zhì)和類型：人腫瘤壞死因子（TNF）有兩種分子形式，即 TNFa和TNF3。TNFa由細(xì)菌脂多糖活化的單核巨噬

29、細(xì)胞產(chǎn)生，可引起腫瘤組織出血壞死，也稱惡病質(zhì)素；TNF3 由抗原或絲裂原刺激的淋巴細(xì) 胞產(chǎn)生，具有腫瘤殺傷及免疫調(diào)節(jié)功能，又稱淋巴毒素。（2） 生物效應(yīng)：TNF對多種腫瘤細(xì)胞均有殺傷或抑制作用，敏感性因腫瘤細(xì)胞類型而異；TNF呈劑量依賴性地抑制病毒介導(dǎo)的細(xì)胞病變的發(fā)展，對RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用；TNF能夠增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生以IL-2為主的淋巴因子，提高 IL-2R的表達(dá)水平，促進(jìn) T細(xì)胞增殖；還能促進(jìn) B細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生抗 體；TNF有中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化作用，并使之活化和脫顆粒，釋放炎癥介質(zhì)；TNF可刺激成骨細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)、使軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨更新

30、，抑制軟骨形成。（3） 應(yīng)用研究：由于 TNF的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，TNF療法的研究已被許多國家開展。動物實(shí)驗(yàn)和 臨床經(jīng)驗(yàn)表明，TNF對某些腫瘤具有明顯的抑制作用，但副作用大，建立合理的用藥方案及治療措施，可望 降低用量，減輕副作用，達(dá)到最佳治療效果。4. 造血生長因子：紅細(xì)胞生成素（EPO :紅細(xì)胞生成素（EPO是一種糖蛋白，分子量約 3039KD,主要由腎小管內(nèi)皮細(xì)胞合成，也可由肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。EP0是一種強(qiáng)效的造血生長因子，活性單一，只作用于骨髓巨核前體細(xì)胞，可刺激紅祖細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞形成成熟的紅細(xì)胞集落，EP0的產(chǎn)生受機(jī)體內(nèi)血容量和氧分壓的調(diào)節(jié)。5. 細(xì)胞因子受體：多數(shù)細(xì)胞因子

31、受體屬于幾個大的多基因家族，每個家族的成員具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征， 相互之間在進(jìn)化上可能有一定關(guān)系。細(xì)胞因子受體家族的劃分不是絕對的，有的受體可歸于多個家族。細(xì) 胞因子受體除鑲嵌于細(xì)胞膜表面的形式外，還有分泌游離的形式，即可溶性細(xì)胞因子受體。第二節(jié) 細(xì)胞因子測定方法及應(yīng)用一、測定方法 檢測細(xì)胞因子的方法主要有生物學(xué)檢測法、免疫學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測法。（一）生物學(xué)檢測法 生物學(xué)檢測又稱生物活性檢測，是根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物活性而設(shè)計(jì)的檢測法。由于各種細(xì)胞因子 具有不同的活性，例如IL-2促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，TNF殺傷腫瘤細(xì)胞，CSF刺激造血細(xì)胞集落形成，IFN保護(hù) 細(xì)胞免受病毒攻擊，因此選擇某一細(xì)

32、胞因子獨(dú)特的生物活性，即可對其進(jìn)行檢測。生物活性檢測法又可分為以下幾類：1. 細(xì)胞增殖法：許多細(xì)胞因子具有細(xì)胞生長因子活性，特別是白細(xì)胞介素，如IL-2朿9激T細(xì)胞生長、IL-3 刺激肥大細(xì)胞生長、 IL-6 刺激漿細(xì)胞生長等。利用這一特性，現(xiàn)已篩選出一些對特定細(xì)胞因子起反應(yīng) 的細(xì)胞，并建立了只依賴于某種因子的細(xì)胞系，即依賴細(xì)胞株（簡稱依賴株）。這些依賴株在通常情況下 不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如 IL-2 依賴株 CTLL-2 在不含 IL-2 的培養(yǎng)基中很快死亡， 而加入 IL-2 后則可在體外長期培養(yǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖與IL-2 量呈正比，因此通過測定細(xì)胞增殖情

33、況（如使用3 H-TdR摻入法、MTT法等）鑒定IL-2的含量。除依賴株外，還有一些短期培養(yǎng)的細(xì)胞， 如胸腺細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細(xì)胞等，均可作為靶細(xì)胞來測定某種細(xì)胞因子活性。2. 靶細(xì)胞殺傷法：是根據(jù)某些細(xì)胞因子（如TNF）能在體外殺傷靶細(xì)胞而設(shè)計(jì)的檢測方法。通常靶細(xì)胞多選擇體外長期傳代的腫瘤細(xì)胞株，利用同位素釋放法或染料染色等方法判定細(xì)胞的殺傷率。3. 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法：某些細(xì)胞因子可刺激特定細(xì)胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2 、 IL-3 誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞合成胺、IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成 a i-抗糜蛋白酶等。通過測定所誘生的相應(yīng)產(chǎn)物，可反映細(xì)胞因子 的活性。4. 細(xì)

34、胞病變抑制法：病毒可造成靶細(xì)胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導(dǎo)致的細(xì)胞病變，因此可利 用細(xì)胞病變抑制法檢測這類因子。（二 免疫學(xué)檢測法 細(xì)胞因子均為蛋白或多肽，具有較強(qiáng)的抗原性。隨著重組細(xì)胞因子的出現(xiàn)，可較方便地獲得細(xì)胞因子 的特異性抗血清或單克隆抗體，因此可利用抗原抗體特異性反應(yīng)的特性，用免疫學(xué)技術(shù)定量檢測細(xì)胞因子。盡管細(xì)胞因子種類繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體（包括多克隆抗體或單克隆抗體）均可采用相似的技術(shù)開展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印跡法。目前，幾乎所有常見細(xì)胞因子的檢測試劑盒均有商品供應(yīng)。此外還可利用酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子單克隆抗體，原位檢測因子在細(xì)胞

35、內(nèi)的合成及分布情況。免疫學(xué)檢測法可直接測定樣品中特定細(xì)胞因子的含量（用ng/ ml表示），為大規(guī)模檢測臨床病人血清中細(xì)胞因子的含量提供了方便。本法僅測定細(xì)胞因子的抗原性，與該因子活性不一定相平行， 因此要了解細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，必須結(jié)合生物學(xué)檢測法。（三）分子生物學(xué)方法這是一類利用細(xì)胞因子的基因探針檢測特定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù)。目前所有公認(rèn)的細(xì)胞因子的基因均已克隆化，故能較容易地得到某一細(xì)胞因子的cDNA探針或根據(jù)已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測細(xì)胞因子mRNAl達(dá)的方法多種多樣，常使用斑點(diǎn)雜交、Northernblot 、逆轉(zhuǎn)錄PCR細(xì)胞或組織原位雜交等。實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的核酸探針和獲得合格的待測物（提取的mRNA羊品或細(xì)胞/組織標(biāo)本）。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物（如生物素、地高辛等）標(biāo)記并與目 的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA RNA根據(jù)其來源可分為 cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針 及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點(diǎn)雜交及Northern blot ，