染色體組型分析

1、遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)之遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)之 染色體組型分析染色體組型分析廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簄掌握染色體組型分析的各種數(shù)據(jù)指標(biāo)n學(xué)習(xí)染色體組型分析的基本方法實(shí)驗(yàn)原理n定義：染色體組型又稱(chēng)核型，是指將動(dòng)物、植物、真菌等的某一個(gè)體或某一分類(lèi)群（亞種、種、屬等）的體細(xì)胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對(duì)恒定的特征排列起來(lái)的圖像。n核型模式圖是指將一個(gè)染色體組的全部染色體逐個(gè)按其特征繪制下來(lái)，再按長(zhǎng)短、形態(tài)等特征排列起來(lái)的圖像。發(fā)展歷史n1920年提出n三項(xiàng)技術(shù)促進(jìn)：低滲處理 秋水仙素應(yīng)用 植物凝激素應(yīng)用n染色體分帶技術(shù)：q帶、g帶、c帶、r帶、t帶、n帶等nfish技術(shù)染色體的特征n數(shù)目 （2

2、n=？）n長(zhǎng)度 （絕對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度）n著絲粒位置 （msmstt）n隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置n帶型分析各類(lèi)常用實(shí)驗(yàn)生物和人細(xì)胞dna含量與染色體數(shù)目物 種染色體數(shù)目dna含量（bp）ms2噬菌體t4枯草桿菌大腸桿菌啤酒酵母果蠅海膽蛙小雞小鼠玉米人1111134852267840204631035104510521064.21061.41071.41081.61094.51092.11094.710931093.2109染色體超螺旋染色體的大小燈刷染色體（光鏡觀察）染色體觀察及核型分析應(yīng)用意義n染色體組型分析染色體水平上的表型n可確定物種的特征，確定種屬親緣關(guān)系n分析生物物種的變異和進(jìn)化

3、過(guò)程n識(shí)別單條染色體、基因定位n臨床應(yīng)用（染色體疾病、產(chǎn)前診斷）人類(lèi)人類(lèi)23對(duì)染色體對(duì)染色體組型分析實(shí)驗(yàn)方法n染色體數(shù)目確定n染色體形態(tài)特征： 長(zhǎng)度：絕對(duì)、相對(duì) 相對(duì)長(zhǎng)度=每條染色體的長(zhǎng)度/全套染色體長(zhǎng)度 臂比=長(zhǎng)臂/短臂 著絲點(diǎn)指數(shù)=短臂/（長(zhǎng)+短臂） 隨體的有無(wú)分組排隊(duì)原則n著絲粒類(lèi)型相同，相對(duì)長(zhǎng)度相近的分一組n同一組的按染色體長(zhǎng)短順序配對(duì)排列n各指數(shù)相同的染色體配為一對(duì)n可根據(jù)隨體的有無(wú)進(jìn)行配對(duì)n將染色體按長(zhǎng) 短排隊(duì)，短臂向上實(shí)驗(yàn)用品n毫米尺、剪刀、膠水、計(jì)算器、白紙n人染色體放大照片染色體編號(hào)(人x染色體)記述一特定帶時(shí)，需要寫(xiě)明4個(gè)內(nèi)容：染色體號(hào)，長(zhǎng)短臂，區(qū)的號(hào)序和帶的號(hào)序。這些內(nèi)容

4、按順序?qū)?，不用間隔或加標(biāo)點(diǎn)。如果某一帶被再細(xì)分，在原帶號(hào)數(shù)后加一小數(shù)點(diǎn)，編號(hào)原則仍按從著絲粒往臂端序貫編號(hào)。如1p31.2代表一號(hào)染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶核型描述n首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號(hào)： a-g 染色體組的名稱(chēng) 1-22 染色體編號(hào) x,y 性染色體 del 缺失 der 結(jié)構(gòu)重排的染色體 dup 重復(fù) inv 倒位 t 易位 +/- 在染色體符號(hào)前表示染色體增加或減少，在染色體符號(hào)后表示染色體多出或缺少一部分實(shí)驗(yàn)步驟1.計(jì)數(shù)，沿邊緣剪下染色體，編號(hào)2.初步目測(cè)配對(duì)，分組3.測(cè)量長(zhǎng)度，計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)、 臂比，相同

5、的染色體間配對(duì)4.將配對(duì)好的染色體排列并粘貼在紙上，每一組下面畫(huà)一橫線，在兩端注明起止號(hào)，并在橫線下的中部寫(xiě)明a-g組號(hào)，染色體從大到小編為1-22號(hào)，性染色體單獨(dú)列為一組思考題n請(qǐng)描述核型： 45，xy, der (14;21) (q21;q14) 47，xy, +21生命科學(xué)中的生命科學(xué)中的“釣魚(yú)釣魚(yú)” （fish）技）技術(shù)術(shù) 遺傳及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)新技術(shù)新方法系列講座遺傳及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)新技術(shù)新方法系列講座 發(fā)展歷史n熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,fish)問(wèn)世于70年代后期,其曾多用于染色 體異常的研究,近年來(lái)隨著fish所應(yīng)用的

6、探針?lè)N類(lèi)的不斷增多,特別是全cosmid探針及染色體原位抑制雜交技 術(shù)的出現(xiàn),使fish技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面,而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究,如診斷、基因定位等放射性同位素原位雜交技術(shù)n原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)需重新標(biāo)記 、已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性 、需要較長(zhǎng)時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤差等。fish的基本原理n很簡(jiǎn)單, 就是標(biāo)記了熒光的單鏈dna(探針)和與其互補(bǔ)的dna(玻片上的標(biāo)本)退火雜交, 通過(guò)觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置來(lái)反映相應(yīng)

7、基因的情況. 熒光原位雜交（fish）n fish技術(shù)是常規(guī)染色體分析的輔助手段。它是用熒光素標(biāo)記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號(hào)來(lái)判斷結(jié)果。n它可用于標(biāo)記染色體的識(shí)別、特異融合基因的檢測(cè)、新基因定位，用全染色體涂抹探針識(shí)別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)異常。fish具有其不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：1.操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到結(jié)果。3.在同一標(biāo)本上，可同時(shí)幾種不同探針。4.不僅可用于分裂細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于靜止期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。fish的技術(shù)特點(diǎn)的技術(shù)特點(diǎn)：nfish選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體也可以是間期細(xì)胞

8、。間期細(xì)胞可以是冰凍切片，也可以是細(xì)胞滴片或印片。n生物素（biotin）地高辛（digoxigenin ）, dinitrophenyl(dnp)，aminoacetyl fluorene(aaf)均可用于探針標(biāo)記。直接標(biāo)記和間接標(biāo)記 n用生物素或地高辛標(biāo)記稱(chēng)為間接標(biāo)記, 雜交后需要通過(guò)免疫熒光抗體檢測(cè)方能看到熒光信號(hào), 因而 步驟較多, 操作麻煩, 其優(yōu)點(diǎn)是在信號(hào)較弱或較小時(shí)可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大n直接用熒光素標(biāo)記dna的方法稱(chēng)為直接標(biāo)記. 由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號(hào), 省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng), 不再需要購(gòu)買(mǎi)熒光抗 體, 也由于近年來(lái)熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高

9、, 直接標(biāo)記的熒光探針越來(lái)越成為首選, 并采用多種不同顏色的熒光, 方便在同一標(biāo)本上同時(shí)檢測(cè)多種異常. 其熒光強(qiáng)度 和信號(hào)大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察, 使fish過(guò)程變得簡(jiǎn)便而易于操作. 探針標(biāo)記n在已知探針dna結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用pcr或rna逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常用biotin標(biāo)記的探針應(yīng)大于100bp，較小的探針可采用pcr技術(shù)來(lái)標(biāo)記。n近年來(lái)，vysis公司成功的生 產(chǎn)了大片段的dna探針（100400kb）。由于探針較長(zhǎng)，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過(guò)程進(jìn)一步簡(jiǎn)化面且雜交信號(hào)增強(qiáng)。染色體著絲粒熒光染色體端粒熒光多色信號(hào)采集n常規(guī)的熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的照像

10、， 彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標(biāo)記探針的應(yīng)用，使用ccd照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運(yùn)用軟件系統(tǒng)融合各次得到的影像，最終形成一個(gè)復(fù)合的多顏色的圖像。fish和g顯帶技術(shù)結(jié)合n對(duì)已做過(guò)g顯帶的染色體片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使fish更清晰的辨認(rèn)各條染色體及染色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的易位，插入，倒位等）,不僅可以用新近g帶外理過(guò)的片子，而且還可用陳舊的g帶片子。因此，fish技術(shù)可成功的幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。fish技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合nfish技術(shù)和rflp結(jié)合，可以精確地描述原屬于染色本長(zhǎng)短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核形

11、或復(fù)雜片段的性質(zhì)。nfish和細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以同時(shí)用多種顏色反應(yīng)不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)找到基因的位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄和翻譯和產(chǎn)物，有助了解核苷酸結(jié)構(gòu)功能以及表達(dá)產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。多色熒光原位雜交（m-fish）nm-fish相當(dāng)于在 一次雜交中給每一條染色體都涂上了不同的顏色, 因而很容易就可看到多條染色體間的復(fù)雜易位情況和確定標(biāo)志染 色體的來(lái)源. nm-fish是1996年才建立的一種新技術(shù)。使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體上24種特異的熒光色彩以供核型分析。它為人們提供了既豐富又完善的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來(lái)源、檢測(cè)微小的染色

12、體易位和檢測(cè)復(fù)雜的染色體易位 。多色熒光染色體顯帶（rx-fish）n 能否讓每條區(qū)帶也雜交上不同的顏色呢? 這一想法導(dǎo) 致了彩色核型分析(rx-fish)的誕生.n rx-fish技術(shù)是采用多種熒光素標(biāo)記與人類(lèi)dna有高度同原性猿的dna作為探針，雜交后使人類(lèi)的24條染色體上呈現(xiàn)特異的帶型。這樣便可根據(jù)彩色的熒光條帶進(jìn)行核型分析。比較基因組雜交（cgh） ncgh不需要制備患者的染色體標(biāo)本, 只需采用腫瘤患者的基因組dna和正常人的基因組dna作為探針，與正常人的中期染色體分裂相進(jìn)行雜交。比較兩種探針?biāo)鶚?biāo)的熒光信號(hào)的強(qiáng)度比率來(lái)判斷腫瘤患者的dna是否存在缺失、增加或復(fù)制。 因而cgh最適合于

13、檢測(cè)實(shí)體瘤, 淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標(biāo)本的疾病. ncgh另一無(wú)法替代的優(yōu)點(diǎn)是, 它可在一次雜交中檢測(cè)整個(gè)基因遺傳 物質(zhì)的增加或減少, 但精度有限, 對(duì)微小的擴(kuò)增或缺失檢測(cè)不出, 僅適用于對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行篩查. cgh也無(wú)法發(fā) 現(xiàn)平衡染色體易位. fish的臨床運(yùn)用n在細(xì)胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是衛(wèi)星dna、衛(wèi)星dna和經(jīng)典衛(wèi)星dna探針。 衛(wèi)星dna探針主要檢測(cè)人染色體的著絲粒。 衛(wèi)星dna位于頂端著絲粒染色體及染色體的異染色質(zhì) 周?chē)?經(jīng)典衛(wèi)星dna有著aatgg短片段，位于染色體1、9、15、16和y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)周?chē)?，后兩處探針除了可用于染色體數(shù)目檢查外，

14、還可用于上述部位精細(xì)改變的檢查。fish的臨床運(yùn)用n白血病檢測(cè)中常用的fish探針有單一序列探針, 著絲粒探針, 整條染色體探針, 常用方法有單標(biāo)記fish, 雙 標(biāo)記fish, 比較基因組雜交(cgh), m-fish 和rx-fish等.各種fish探針及方法均在白血病的診斷, 治療監(jiān)測(cè), 預(yù)后估計(jì)和微小殘留病檢測(cè)中起重要作用 應(yīng)用實(shí)例 n常規(guī)的染色體核型分析已廣泛用于各類(lèi)急、慢性白血病患者的骨髓染色體檢查。如m3型的t（15；17）、m2b型的t（8；21）、cml和部分all的ph染色體等。n fish技術(shù)已成功地用于t（15；17），t (8；21) 和ph染色體等的檢測(cè)，并為人類(lèi)基因組實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的新基因進(jìn)行了定位。利用染色體涂抹技術(shù)，結(jié)合常規(guī)核型分析和cgh技術(shù)，確診了多例復(fù)雜的染色體異位。已用cgh技術(shù)，分別對(duì)高二倍體all的患者和cml患者進(jìn)行了研究。