高美華醫(yī)學免疫學zlwesternblot秋季PPT學習教案

1、會計學1高美華醫(yī)學免疫學高美華醫(yī)學免疫學zlwesternblot秋季秋季第1頁/共19頁第2頁/共19頁第3頁/共19頁第4頁/共19頁第5頁/共19頁第6頁/共19頁 2. 實驗方法實驗方法1) 玻璃玻璃L準備準備：依次用水依次用水、10 SDS、H2O、乙醇和水沖洗乙醇和水沖洗，干燥。干燥。2) 配制分離膠：總量配制分離膠：總量5 mL，其中：，其中： 水水 1.65 mL 30 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液2.0 mL 1.5 mol/L Tris-HCl（PH 8.8） 1.25 mL 10 SDS 0.05 mL 10 過硫酸銨過硫酸銨 0.05 mL TEMED 0.002 mL第7

2、頁/共19頁第8頁/共19頁 4) 加樣加樣：將：將ENA與上樣緩沖液等體積混合，煮沸與上樣緩沖液等體積混合，煮沸35 min后，將其后，將其加入梳加入梳孔內，每孔孔內，每孔20 L。 5) 電泳電泳：開始時電壓為開始時電壓為8V/cm凝膠，染料進入分離膠后，將電壓增加到凝膠，染料進入分離膠后，將電壓增加到15V/cm凝膠，繼續(xù)電泳直到染料抵達分離膠底部，斷開電源。凝膠，繼續(xù)電泳直到染料抵達分離膠底部，斷開電源。 6) 染色：取下凝膠，切下一部分染色，其余用于電轉移。染色：取下凝膠，切下一部分染色，其余用于電轉移。 第9頁/共19頁第10頁/共19頁第11頁/共19頁第12頁/共19頁 3、按

3、下列過程安裝轉移裝置：按下列過程安裝轉移裝置： （1）將塑料支架平放在含有轉移緩沖液的托盤中，在塑料支架上放一塊海綿。）將塑料支架平放在含有轉移緩沖液的托盤中，在塑料支架上放一塊海綿。 （2）將）將3塊塊3MM濾紙對齊放在海綿上，依次放置濾紙對齊放在海綿上，依次放置PVDF膜膜、凝膠凝膠、另外另外3塊塊3MM濾紙及海綿。在放置每一層時，均要去除它們之間的氣泡，若有氣泡殘留，則影響轉移效果。濾紙及海綿。在放置每一層時，均要去除它們之間的氣泡，若有氣泡殘留，則影響轉移效果。 （3）最后用塑料支架夾緊上述各層，放入電轉移槽內，）最后用塑料支架夾緊上述各層，放入電轉移槽內， 注意注意PVDF膜一側靠正

4、極，膠一側靠負極。膜一側靠正極，膠一側靠負極。海綿海綿3層濾紙層濾紙塑料支架塑料支架3層濾紙層濾紙海綿海綿塑料支架塑料支架PVDF膜膜凝膠凝膠+-第13頁/共19頁 4、接通電源，電壓接通電源，電壓40 V，電流電流0.17-0.2 A，轉移，轉移1.5-6 h，轉移時間可根據(jù)靶蛋白的大小來定，蛋白質分子量小則需時短，蛋白質分子量大需時長。，轉移時間可根據(jù)靶蛋白的大小來定，蛋白質分子量小則需時短，蛋白質分子量大需時長。 5、轉移結束后，取出塑料支架，依次去掉各層，用鉛筆在膜的上緣作好標記轉移結束后，取出塑料支架，依次去掉各層，用鉛筆在膜的上緣作好標記。 6、切下部分、切下部分PVDF膜，麗春紅

5、染色觀察轉印情況。膜，麗春紅染色觀察轉印情況。 7、在標記好的上緣用蘸有人、在標記好的上緣用蘸有人IgG的鋼筆劃一條線。的鋼筆劃一條線。第14頁/共19頁（三）（三）固相酶免疫測定固相酶免疫測定檢測檢測ENA（extractable nuclear antigen）自身抗自身抗體體第15頁/共19頁 一、材料一、材料 1、洗滌液：含洗滌液：含0.05 吐溫吐溫-20 的的PH 7.4的的PBS 2、酶標抗人酶標抗人IgG 3、陰性對照血清、陽性對照血清陰性對照血清、陽性對照血清 4、底物溶液底物溶液 5、終止液終止液 6、已轉印有已轉印有ENA的的PVDF膜。膜。 7、恒溫搖床、微量加樣器、反

6、應槽、塑料袋、恒溫搖床、微量加樣器、反應槽、塑料袋、 滴管、吸管等。滴管、吸管等。 第16頁/共19頁 二、方法二、方法 1切下數(shù)條已轉切下數(shù)條已轉移移有有ENA的的PVDF膜。膜。 2封閉（用封閉（用1的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白4過夜過夜）。）。 3洗滌液漂洗洗滌液漂洗5次，每次次，每次1 min。 4加樣加樣：1 mL洗滌液加入洗滌液加入20 L血清，血清，37 恒溫搖動恒溫搖動40 min。 5洗滌液漂洗洗滌液漂洗5次，每次次，每次1 min。 6加入加入1 mL酶標羊抗人酶標羊抗人IgG，37恒溫搖動恒溫搖動30 min。 7洗滌液漂洗洗滌液漂洗5次，每次次，每次1 min。 8加入底物液加入底物液1 mL，顯色，顯色3-5 min。 9加入終止液終止反應。加入終止液終止反應。 第17頁/共19頁 三、三、結果判斷結果判斷 用肉眼觀察。用肉眼觀察。出現(xiàn)染色條帶為出現(xiàn)染色條帶為陽性陽性，不出現(xiàn)染色條帶為，不出現(xiàn)染色條帶為 陰性陰性，不同的疾病可以出現(xiàn)不同的條帶。跟據(jù)條帶位置，不同的疾病可以出現(xiàn)不同的條帶。跟據(jù)條帶位置 判斷結果。判斷結果。判斷標準判斷標準：1抗抗Sm抗體：同時出現(xiàn)抗體：同時出現(xiàn)29KD、28KD、13.5KD條帶。條帶。2抗抗SSA抗體：抗體：60KD、52KD任意出現(xiàn)一條帶。任意出現(xiàn)一條帶。3抗抗