核酸的研究方法1ppt課件

1、第第1515章章核酸的研討方法核酸的研討方法 制備天然核酸必需采用溫暖的條件，制備天然核酸必需采用溫暖的條件，防止過酸、過堿，防止猛烈攪拌，尤其防止過酸、過堿，防止猛烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分別、提純和定量測定一、核酸的分別、提純和定量測定真核真核DNADNA以核蛋白以核蛋白DNPDNP方式存在，方式存在，DNPDNP溶于水或高鹽溶液溶于水或高鹽溶液1mol/L 1mol/L N a C lN a C l ， 但 不 溶 于 低 鹽 溶 液 ， 但 不 溶 于 低 鹽 溶 液0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl去除蛋白質(zhì)：水飽和

2、酚，氯仿異戊去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇一一DNA分別純化分別純化制備制備RNARNA時，最重要的是使時，最重要的是使RNaseRNase滅活：滅活：一切容器都要經(jīng)過高溫處置，不能高溫高一切容器都要經(jīng)過高溫處置，不能高溫高壓的用壓的用0.10.1焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯DEPCDEPC處置。處置。參與強變性劑如胍鹽使參與強變性劑如胍鹽使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反響體系內(nèi)參與的反響體系內(nèi)參與RNaseRNase的抑制劑的抑制劑如如RNasin)RNasin)二二RNA的分別的分

3、別三核酸含量的測定三核酸含量的測定2、定糖法、定糖法 RNA：核糖：核糖 糠醛糠醛 綠色物質(zhì)綠色物質(zhì)670-680nm DNA：脫氧核糖：脫氧核糖+二苯胺二苯胺蘭色物質(zhì)蘭色物質(zhì)595-620nm苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法、紫外吸收法1個個A50g/ml 雙鏈雙鏈DNA 40g/ml RNA或單鏈或單鏈DNA3、定磷法、定磷法 核酸含磷量為核酸含磷量為9.5% 1g磷相當于磷相當于10.5g核酸核酸4、瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳 溴乙錠能插入溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間構成復合物分子的堿基對間構成復合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光 熒光

4、強度與熒光強度與DNA含量成正比含量成正比純純DNA DNA 比值比值1.81.8， 1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染純純RNA RNA 比值比值2.02.0， 2.0 DNA 2.0 DNA、 PrPr、苯酚污染、苯酚污染四、核酸純度的測定OD260OD280二、核酸的沉降特性與超速離心二、核酸的沉降特性與超速離心 不同構象的核酸線形、不同構象的核酸線形、環(huán)形、超螺旋，密度和沉環(huán)形、超螺旋，密度和沉降速率不同，用密度梯度離降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象心可以將不同構象DNADNA、RNARNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來與蛋白質(zhì)區(qū)分開來8M CsCl，45000rpm，16h密度梯

5、度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡時：浮力密度平衡時：浮力密度=CsCl密度密度=離心力離心力=0 +4.22r2 - r02 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度弧度：角速度弧度/秒秒r：樣品到轉軸的間隔：樣品到轉軸的間隔一核酸密度的測定G-C含量與含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系的浮力密度之間呈正比關系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =-1.658 10 二測定二測定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA變性變性DNA雙鏈雙鏈DNA 蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大變性程度越大，浮力密度越大三研討核酸的構象三研討核酸的構象四用于核酸

6、的制備四用于核酸的制備超螺旋超螺旋DNADNA或或用于大片段用于大片段DNA的分別，精度低，但的分別，精度低，但分別范圍廣。分別范圍廣。三、核酸的凝膠電泳三、核酸的凝膠電泳一瓊脂糖凝膠電泳一瓊脂糖凝膠電泳用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相對分子質(zhì)量小于相對分子質(zhì)量小于1000bp的的DNA片片斷和斷和RNA的電泳。的電泳。PAGE中普通不含中普通不含RNase，用于，用于RNA分析時不會分解樣品。分析時不會分解樣品。二聚丙烯酰胺凝膠電泳二聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGEPAGE一一DNADNA的酶法測定的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定四、核酸的核苷酸序列測定英國英國 SangerSanger

7、1955 1955 確定牛胰島素構造，確定牛胰島素構造，1958 1958 獲諾貝爾化學獎獲諾貝爾化學獎1975 1975 設計出設計出DNADNA測序法，測序法，1980 1980 獲諾貝爾化學獎獲諾貝爾化學獎合成一段與待測合成一段與待測DNADNA序列互補的序列互補的DNADNA片段群。片段群。 末端終止法末端終止法Sanger2，3雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸ddNTP是是DNA合成鏈延伸的抑合成鏈延伸的抑制劑。制劑。MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團標志的四色熒光基團標志的dNTP二二DNADNA的化

8、學法測序：的化學法測序： 由由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所發(fā)明。所發(fā)明。 其根本原理是用特異的化學試劑作用于其根本原理是用特異的化學試劑作用于DNADNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反響堿基分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反響堿基的多核苷酸鏈。用的多核苷酸鏈。用4 4組不同的特異反響，可使末組不同的特異反響，可使末端標志的端標志的DNADNA分子切成不同長度的片斷，其末端分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜影得到測序圖譜 4 4組特異的反響如下：組特異的反響如下：1 1G G反

9、響：用硫酸二甲酯反響：用硫酸二甲酯DMSDMS使鳥嘌呤上的使鳥嘌呤上的N7N7原子甲原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤零落，多核苷酸鏈可在此處斷基化，加熱引起鳥嘌呤零落，多核苷酸鏈可在此處斷裂裂2 2G+AG+A反響：用甲酸使反響：用甲酸使A A和和G G嘌呤環(huán)上的嘌呤環(huán)上的N N原子質(zhì)子化，原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂3 3T+CT+C反響：用肼使反響：用肼使T T和和C C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基除去堿基4 4C C反響：當有鹽存在時，只需反響：當有鹽存在時，只需C C與肼反響，并被哌與肼反響，并被哌啶

10、除去。嘧啶使修飾堿基零落，并使去掉堿基的磷酸啶除去。嘧啶使修飾堿基零落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂二酯鍵斷裂 32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處： 32p ，32p-GCTAC在C處：32P-G和 32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯G： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸G+A： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/NaclC： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼C+T： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCG

11、AC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P *ACTTCGACAG三三RNARNA的測序的測序 RNARNA的測序方法有的測序方法有3 3個：個：1 1用酶特異切斷用酶特異切斷RNARNA鏈：鏈：2 2用化學試劑裂解用化學試劑裂解RNARNA3 3逆轉錄成逆轉錄成cDNAcDNA19951995年年K.MullisK.Mullis發(fā)明。根本步驟為：發(fā)明。根本步驟為：1.1.設計一對引物以便有效擴增所需求的設計一對引物以便有效擴增所需求的DNADNA序列，并盡量減少能夠產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物序列，并盡量減少能夠產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物2.2.優(yōu)化反響體系：包括適量模板、引物、

12、優(yōu)化反響體系：包括適量模板、引物、4 4種種dNTPdNTP、Taq DNATaq DNA聚合酶和適量聚合酶和適量Mg2+Mg2+五、五、DNADNA聚合酶鏈式反響聚合酶鏈式反響PCRPCR3.3.選擇選擇3 3個溫度進展熱循環(huán)：個溫度進展熱循環(huán)：變性變性9494，454560s60s；退火，根據(jù)引物的退火，根據(jù)引物的Tm Tm ，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。循環(huán)循環(huán)4.4.擴增完成后取出一定量的反響產(chǎn)物，檢擴增完成后取出一定量的反響產(chǎn)物，檢測擴增結果：先進展凝膠電泳，用溴化乙測擴增結果：先進展凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測結果啶染色，紫外光下檢測結果y=產(chǎn)物；產(chǎn)物；x=擴增效率；擴增效率；n循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)(1)nyx 模板模板DNA單鏈單鏈引物引物DNA聚合酶聚合酶TaqdNTPMg2+MOV:MCB4.0POLYMERAS