基因工程的操作復習

1、基因工程的操作1、掌握基因操作的工具2、掌握基因操作的基本步驟3、了解獲取目的基因的方法，掌握PCR技術(shù)與細胞內(nèi)DNA分子復制的異同4、掌握基因操作的工具在構(gòu)建基因表達載體過程中的重要意義5、掌握農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程，了解其它轉(zhuǎn)基因的方法6、掌握目的基因檢測的方法學習目標基因工程的操作步驟目的基因的檢測與鑒定獲取目的基因構(gòu)建基因表達載體將目的基因?qū)胧荏w細胞第一步：獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫工具：限制酶，DNA連接酶人工合成目的基因條件是：基因比較小，且核苷酸序列已知方法：方法：1、從蛋白質(zhì)合成2、反轉(zhuǎn)錄法3、PCR法第二步：第二步：基因表達載體的構(gòu)

2、建：基因表達載體的構(gòu)建：它們所處的位置和有什么作用？它們所處的位置和有什么作用？a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標記基因、標記基因位于基因的位于基因的首端首端,是是mRNA聚合酶結(jié)合聚合酶結(jié)合位點位點位于基因的位于基因的末端末端,終終止轉(zhuǎn)錄止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導入受體細胞檢測目的基因是否導入受體細胞標記基因標記基因第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞（又稱為轉(zhuǎn)化）將目的基因?qū)胫参锛毎?將目的基因?qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎?將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎麢z測檢測導入檢測：目的基因是否導入受體細胞導入檢測：目的基因是否導入受體細胞方法方法 DN

3、ADNA分子雜交分子雜交表達檢測表達檢測轉(zhuǎn)錄檢測轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交分子雜交翻譯檢測翻譯檢測抗原抗體抗原抗體雜交雜交分分子子檢檢測測法法鑒定鑒定抗蟲鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定抗病鑒定活性鑒定等活性鑒定等個體水平的鑒定個體水平的鑒定第四步：目的基因的檢測與鑒定關于限制酶的問題一般來說，不同的限制酶有不同的識別序列，有不同的切點位置，切出不同的黏性末端，但也有兩種特殊情況：1.不同的限制酶有不同的識別序列，但可以切出相同的黏性末端，如以下兩種酶處理得到黏性末端均為AATT：酶I識別序列GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAG酶IIAAAATTTTAAAATTTTTTTTAAAATTTTAAAA兩種酶

4、經(jīng)常用于同一個基因工程中限制酶的選擇使用例題：基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶的識別序列和切點是GGATCC，限制酶的識別序列和切點是GATC。根據(jù)下圖示判斷下列操作正確的是A目的基因和質(zhì)粒均用限制酶切割B目的基因和質(zhì)粒均用限制酶切割C質(zhì)粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割D質(zhì)粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割限制酶的選擇使用變式訓練1抗四環(huán)素基因EcoBBamHHinDBamH應選擇哪種限制酶？HinD限制酶的選擇使用變式訓練2抗四環(huán)素基因EcoBHinDBamH使用的限制酶EcoBBamH HinD含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長情況含青霉素的培養(yǎng)基上

5、的生長情況抗青霉素基因關于限制酶的問題2.不同的限制酶有相同的識別序列，但可以切出不同的黏性末端，如：酶I識別序列GGAATTCCGGAATTCCCCTTAAGGCCTTAAGG酶IIGGAATTCCGGAATTCCCCTTAAGGCCTTAAGG黏性末端GAATTCGAATTCAATTAATT這兩種酶不會在同一個基因工程中采用1、將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法特點特點:能感染能感染雙子葉植物雙子葉植物和和祼子植物祼子植物,對對大多數(shù)大多數(shù)單子葉植物單子葉植物無感染能力無感染能力Ti質(zhì)粒質(zhì)粒的的TDNA可可轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至受體細至受體細胞并胞并整合整合到

6、其染色體上到其染色體上轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因構(gòu)建構(gòu)建表表達達載載體體導入導入植植物物細細胞胞整合整合 植物細胞染植物細胞染色體色體DNA表達表達新新性性狀狀轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌整合整合到染色體上到染色體上轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至受體細胞至受體細胞（2）基因槍法）基因槍法 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。的基因與其整合并表達的方法。常用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法（2）基因槍法基因槍法微彈轟擊

7、法微彈轟擊法特點：成本高特點：成本高胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。因借助花粉管通道進入受體細胞。2、將目的基因?qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎椒ǚ椒? 顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)操作程序操作程序:提純含目的基提純含目的基因

8、表達載體因表達載體取受精卵取受精卵顯微注射顯微注射移植到子宮移植到子宮早期胚胎早期胚胎新性狀動物新性狀動物2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎?、將目的基因?qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取受精卵取受精卵 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǔＳ梅ǎ篊a2+處理處理常用菌常用菌：大腸桿菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因：繁殖快繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：過程：Ca2+處理處理大腸桿菌大腸桿菌感受態(tài)感受態(tài)細

9、胞細胞表達載體表達載體與感受態(tài)與感受態(tài)細胞混合細胞混合感受態(tài)細感受態(tài)細胞吸收胞吸收DNA植物基因植物基因工程工程動物基因動物基因工程工程微生物基微生物基因工程因工程常用方法常用方法受體細胞受體細胞比較目的基因?qū)氩煌毎姆椒ū容^目的基因?qū)氩煌毎姆椒ㄞr(nóng)桿菌轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法化法顯微注顯微注射法射法Ca2+處處理法理法體細胞體細胞受精卵受精卵原核細胞原核細胞（一）、檢測（一）、檢測1 1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (關鍵步驟關鍵步驟) ).首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA（1）方法方法: :

10、DNADNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性片段用放射性 同位素等作標記同位素等作標記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染表明染色體已插入染色體色體DNA中中（二）、鑒定（個體生物學水平）（二）、鑒定（個體生物學水平）2 2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA3 3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等原理原理: :分分 子子 雜雜 交

11、交方法方法: :抗原抗體雜交抗原抗體雜交方法方法: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR技術(shù)技術(shù) 原理：原理： 前提：前提： 原料：原料： 優(yōu)點優(yōu)點 過程：過程：PCR擴增儀擴增儀DNA復制復制已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列：以：以_方式擴增，方式擴增， 在短時間內(nèi)大量擴增目的基因在短時間內(nèi)大量擴增目的基因指數(shù)指數(shù)模板模板DNA；DNA引物；四種脫氧引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；離子酶）；離子變性變性 復性復性延伸延

12、伸關于PCR技術(shù)中的原料和能量問題：PCR技術(shù)也是合成DNA分子的過程，屬于合成反應，是消耗能量的，但圖18中未提到能量。圖18分析：PCR的原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP。這四種物質(zhì)并不是必修二中我們熟悉的四種游離的脫氧核苷酸，而是脫氧核苷酸連接上了兩個磷酸，和ATP一樣，是高能化合物，在PCR過程中是可以提供能量的。試題中，若指出原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP，則條件中不再另寫能量，若原料是四種游離的脫氧核苷酸，則另外還需要ATP提供能量。PCR技術(shù)和DNA分子復制比較PCRDNA分子復制模板相同，均為DNA分子雙鏈原料四種游離的脫氧核苷酸或dCTP、dGTP、

13、dATP、dTTP四種游離的脫氧核苷酸解旋過程高溫（9095），不需要酶常溫，需要解旋酶DNA聚合酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶），最適溫度（7075）普通DNA聚合酶，最適溫度為常溫引物需要不需要2（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù)為循環(huán)次數(shù))（24-1）2=304.4.下列屬于獲取目的基因的方法的是下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取從基因組文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.3在已知在已知基因的核苷酸

14、基因的核苷酸序列的情況下，獲取目的序列的情況下，獲取目的基因的最方便方法是基因的最方便方法是A、化學合成法、化學合成法 B、基因組文庫法、基因組文庫法 C、CDNA文庫法文庫法 D、聚合酶鏈反應、聚合酶鏈反應5.加熱至加熱至95攝氏度的目的是使攝氏度的目的是使DNA中的中的 斷裂，這一過程在細胞內(nèi)是通過斷裂，這一過程在細胞內(nèi)是通過 解旋酶解旋酶 的作用來完成的。的作用來完成的。6.當溫度降低時，引物與模板末端結(jié)合，在當溫度降低時，引物與模板末端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成后合成2個個DNA分子，此過程中的原分子，此過程中的原料料 ，遵

15、循的原則是，遵循的原則是 。7.Taq酶的特點是（酶的特點是（ ） A.耐強酸耐強酸 B.耐強堿耐強堿 C.耐高溫耐高溫 D.最適溫度最適溫度37攝氏度攝氏度8.請指出請指出PCR技術(shù)與技術(shù)與DNA復制過程的區(qū)別復制過程的區(qū)別 9.在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分分子片段為子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進行人工復制，復制時應給予的條件是技術(shù)進行人工復制，復制時應給予的條件是 雙鏈雙鏈DNA分子為模板分子為模板 ATGTG或或TACAC模板鏈模板鏈 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 四種核苷酸四種核苷

16、酸 DNA聚合酶聚合酶 熱熱穩(wěn)定穩(wěn)定DNA聚合酶引物聚合酶引物 溫度變化溫度變化 恒溫恒溫A BC DD10.在基因工程中，把選出的目的基因（共在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個）放入個）放入DNA擴增儀中擴增擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是氧核苷酸的個數(shù)是A.540個個 B.8100個個 C.17280個個D.7560個個B非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子終止子終止子

17、基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)啟動子啟動子原核原核真核真核直接分離法直接分離法供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運載體運載體限制酶限制酶受體細胞受體細胞產(chǎn)生特定性狀產(chǎn)生特定性狀導入導入外源外源DNADNA擴增擴增目的基因目的基因分離分離( (鳥槍法鳥槍法) )多用于原核生物多用于原核生物蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化學合成化學合成推測推測推測推測人工合成法：人工合成法： 化學法合成的目化學法合成的目的基因含的基因含內(nèi)含子、啟內(nèi)含子、啟動子和終止子動子和終止子嗎？嗎？提取某種生物的

18、提取某種生物的全部全部DNADNA用適當?shù)南拗泼该盖杏眠m當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接重組載體重組載體基因組文庫基因組文庫導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建1.構(gòu)建基因組構(gòu)建基因組DNA文庫時，首先應分離細胞的文庫時，首先應分離細胞的A、染色體、染色體DNA B、線粒體、線粒體DNAC、總、總mRNA D、tRNA 2.目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫的描述正確的是的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫、某生物的全套基因就是一個基

19、因文庫B、將含有某種生物不同的許多、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導入某個片段，導入某個生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文文庫庫AC提取某種生物的提取某種生物的某器官某器官或或特定發(fā)育時期特定發(fā)育時期的的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段重組載體重組載體與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚

20、合酶聚合酶導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法：逆轉(zhuǎn)錄法： DNA聚合酶聚合酶有關的酶有關的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前體前體mRNA單鏈單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄剪接剪接逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復制復制終止子終止子基因基因不含不含非編碼非編碼系列系列。即不。即不含含非編碼區(qū)非編碼區(qū)和和內(nèi)含子內(nèi)含子 真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？原核生物基因呢？思考？思考？培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)導入導入含目的基因的重組質(zhì)粒導入大腸桿菌含目的基因的重組質(zhì)粒導入大

21、腸桿菌含有氨芐青霉素含有氨芐青霉素 的完全培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基含有四環(huán)素的含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基均不能生長大腸桿兩種培養(yǎng)基均不能生長大腸桿菌菌 Ca2+ 處理細胞處理細胞形成感受態(tài)細胞形成感受態(tài)細胞檢測檢測（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素 抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌）抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌）只有氨芐青霉素只有氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒抗性基因質(zhì)粒只具有氨芐青霉素只具有氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌抗性基因大腸桿菌不具有氨芐青霉不具有氨芐青霉素素 抗性基因和抗性基因和四環(huán)素抗性積基四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌因的大腸桿菌完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基導入導入接種

22、培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)含有四環(huán)素的含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不含大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因抗四環(huán)素基因證明：證明：不存活不存活含有四環(huán)素的含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基證明：證明： 大腸桿菌大腸桿菌的受體細胞含的受體細胞含有目的基因有目的基因 四環(huán)素四環(huán)素抗性基因抗性基因 四環(huán)素四環(huán)素抗性基因抗性基因存活存活如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？存活存活導入導入接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)含有四環(huán)素的含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基大腸桿菌不

23、含大腸桿菌不含抗四環(huán)素基因抗四環(huán)素基因證明：證明：不存活不存活含有四環(huán)素的含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基證明：證明：大腸桿菌含抗大腸桿菌含抗四環(huán)素基因四環(huán)素基因證明：證明： 大腸桿菌大腸桿菌的受體細胞含的受體細胞含有目的基因有目的基因 四環(huán)素四環(huán)素抗性基因抗性基因 四環(huán)素四環(huán)素抗性基因抗性基因完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基存活存活如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？ 5.目的基因與運載體結(jié)合所需的條件有目的基因與運載體結(jié)合所需的條件有 同一種限制酶同一種限制酶 具有抗性基因的質(zhì)粒具有抗性基因的質(zhì)粒 RNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DNA連接酶連接酶 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 ATP A BC D6.（多選）一個基因表達載體的構(gòu)建應包括（多選）一個基因表達載體的構(gòu)建應包括 A目的基因目的基因 B啟動子啟動子 C終止子終止子 D標記基因標記基因ABCDD7.下列關于基因表達載體的敘述不正確的下列關于基因表達載體的敘述不正確的是是A啟動子是與啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼的部位，是起始密碼B啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C標記基因是為了鑒別受體細