新型納米載體固定化酶的研究

1、新型納米載體固定化酶的研究納米顆粒是有機或無機材料構成的亞微米基團（尺寸分布在1-100nm之間）什么是納什么是納米材料？米材料？ 自然界中的酶至少有70萬種, 而實現(xiàn)工業(yè)應用的僅上百種。因此, 在開發(fā)利用酶資源方面, 可以說才剛剛起步, 潛力巨大, 迫切需要克服影響酶工業(yè)化應用的障礙, 實現(xiàn)酶的高效利用。這不僅需要使單個酶在各個體系(水相、油相、油水界面面)發(fā)揮其最高活性,而且需要實現(xiàn)酶的重復利用、實現(xiàn)多酶的協(xié)調反應和輔酶再生。近年來, 隨著納米科學和納米技術的迅速發(fā)展, 有望利用納米技術實現(xiàn)上述關鍵技術的突破。1.理想載體材料應具備哪些特點？2.決定酶催化特性的因素有哪些？主要內容介紹主要

2、內容介紹納米載納米載體固定體固定化酶化酶2.2.納米載體固定化酶的方法納米載體固定化酶的方法1.酶納米載體的種類酶納米載體的種類（磁性納米粒子用于固定化酶的研究磁性納米粒子用于固定化酶的研究）3.3.納米載體的特點及納米載體納米載體的特點及納米載體固定對酶性質的影響固定對酶性質的影響4.納米酶催化劑的優(yōu)點及納米納米酶催化劑的優(yōu)點及納米技術在酶催化應用中的進展技術在酶催化應用中的進展5.納米載體固定化酶的應用與納米載體固定化酶的應用與挑戰(zhàn)挑戰(zhàn)一、酶納米載體的種類一、酶納米載體的種類金屬納金屬納米載體米載體有機納有機納米載體米載體非金屬非金屬無機納無機納米載體米載體復合物復合物納米載納米載體體酶納

3、米載體（按材料性質分）（按材料性質分）顆粒型納米載體顆粒型納米載體使用得較為廣泛使用得較為廣泛磁性納米粒子用于固定化酶的研究磁性納米粒子用于固定化酶的研究磁性粒子是一類新型的固定化酶載體材料，具有生物相容性好和固定化酶易從反應混合物中回收面優(yōu)點。無機磁性納米粒子應用較多的是 。 此類載體的核心由磁性納米顆粒組成，外面包被有一層有機或無機分子的殼，通過這種表面修飾的方法可以在載體表面引入多種反應性功能基團（如羥基、氨基、巰基面），因此該載體可以連接酶、抗體、核酸面生物分子，已被廣泛地用于生物學和醫(yī)學研究。1.決定磁性納米顆粒的磁學性能的兩關鍵因素決定磁性納米顆粒的磁學性能的兩關鍵因素小尺寸效應、

4、小尺寸效應、表面效應表面效應尺寸效應當納米顆粒小于單磁疇臨界尺寸時，止血顆粒能分散的最好；表面效應顆粒粒徑達到納米級時，其具有巨大的相對表面積，也使大部分原子都處于顆粒表面，致使其具有更高的表面活性。磁性納米顆粒具有較大的表面原子/體內原子比，其表面自旋會顯著影響磁化能力。2.磁性納米的表面修飾磁性納米的表面修飾在利用磁性fe3o4納米顆粒作為固定化酶載體前必須對其提供適當?shù)谋砻姘缓陀行У谋Ｗo措施以保持它的穩(wěn)定性，并可以引入各種功能基團以滿足特定的應用環(huán)境。該方法主要包括利用有機分子、聚合物、生物分子、無機分子嫁接，包被fe3o4納米顆粒。fe3o表面修飾的材料和方法材料方法作用表面活性劑和

5、聚合物化學鍵合、物理吸附鈍化納米顆粒表面從而避免顆粒的團聚貴金屬微乳液、氧化還原防止磁性納米顆粒的核被氧化二氧化硅stober法、溶膠-凝膠法、氣溶膠高溫分解法保持其穩(wěn)定性，避免顆粒的團聚；該顆粒具有良好的生物相容性、水溶性、穩(wěn)定性；硅包被標語在顆粒表面偶聯(lián)各種生物分子且能防止連接在其表面的配體與磁性核的直接接觸而發(fā)生不必要的發(fā)硬；硅包被可維持其物理特性碳電弧放電法、激光消融法、電子照射法、化學氣象沉積法碳具良好的化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和生物相容性比傳統(tǒng)包被材料更具優(yōu)勢，但如何得到單分散性的復合物顆粒依然是一項挑戰(zhàn)3.3.應用：應用：磁性生物分離和檢測；臨床診斷和治療；藥物靶向運輸；固定化酶載體

6、二、納米載體固定酶的方法二、納米載體固定酶的方法l 吸附法：吸附法： 將制備好的納米顆?；蚱渌{米載體直接加入含有一定濃度酶液的緩沖溶液，在合適條件下納米載體可以通過靜電作用或與氨基酸殘基側鏈基團之間的特異性結合而將酶分子牢固吸附到納米載體表面, 如金特異性地結合氨基酸殘基側鏈的巰基和氨基; 鎳離子特異性地結合蛋白質末端的多聚組氨酸“尾巴”?！緝?yōu)點】操作簡單, 是目前應用得較為廣泛的一種固定化方法, 尤其是用于各種酶傳感器的制備。用納米材料制備的各種酶傳感器, 能顯著提高生物傳感器的檢測極限, 增強檢測的特異性, 縮短電極響應時間。l 包埋法包埋法將酶與聚合物單體在一定的條件下混合, 聚合物單

7、體之間發(fā)生聚合交聯(lián)的過程，就可以將酶分子固定到高分子聚合物中; 或者是將酶分子包裹在多孔的單分子膜中, 形成微膠囊型納米顆粒?！緝?yōu)點】包埋效率高；固定化穩(wěn)定性好，酶分子與納米載體不易解體分離,；對酶結構的完整性也沒有顯著的影響,；酶的半衰期長達143 天共價結合法：共價結合法：酶和納米載體以共價鍵的形式結合在一起, 這種方法需要酶和載體都具有氨基、羧基或羥基面官能團。1）直接結合法納米載體必須攜帶有能與氨基酸側鏈基團發(fā)生反應的相應基團, 如c60的各種衍生物就可以直接固定各種酶蛋白;2）間接結合法間接法是先在納米載體顆粒的表面包被上一層攜帶有活性基團的聚合，或者先將納米顆粒用具有活性基團的材料

8、膠囊化, 然后再與酶分子共價連接?！緝?yōu)點】能有效地防止酶與載體的解離, 從而防止酶的丟失; 并且有助于防止酶的變性, 增強其穩(wěn)定性。【缺點】反應過程中酶的活性位點被隱藏或限制了活性位點與底物的結合, 將不可避免地導致酶活性一定程度的降低。三、三、納米載體的特點及納米載體固定對納米載體的特點及納米載體固定對酶性質的影響酶性質的影響（一）特點：（一）特點： 表面積大、體積?。?表面自由能高； 易于將酶與底物和產物分離； 提高酶的生物相容性、免疫活性和穩(wěn)定性。（二）對酶性質的影響：（二）對酶性質的影響： 1.對酶活力和穩(wěn)定性的影響對酶活力和穩(wěn)定性的影響與傳統(tǒng)材料相比，納米結構能使酶在不同體系長期保持

9、活性穩(wěn)定,2.對酶特異性的影響對酶特異性的影響納米材料巨大的比表面積、充足的表面功能化基團, 尤其是單層受保護的納米粒子, 會使酶活力提高很多。eg：在空間位阻和靜電的共同作用下, 結合在表面用烷基硫醇- 四( 乙二醇) 乙酸單分子膜功能化的納米金顆粒表面的- 胰凝乳蛋白酶,表現(xiàn)出了很明顯的化學選擇性: 對攜帶正電荷的底物表現(xiàn)出很強的親和性, 有較高的催化活力; 對攜帶負電荷的底物僅表現(xiàn)很低的親和力和催化活力; 對中性底物的親和力和催化能力居中。3.對酶結構和功能的影響對酶結構和功能的影響一般來說, 納米材料固定化對酶結構和功能基本上沒有太大的影響, 都能夠保持其完整性; 有些可以通過在納米材

10、料表面偶聯(lián)一些特異性的配體, 調控酶的結構和功能四、納米酶催化劑的優(yōu)點及納米技術在酶催四、納米酶催化劑的優(yōu)點及納米技術在酶催化應用中的進展化應用中的進展。（一）納米酶催化劑的優(yōu)點：（一）納米酶催化劑的優(yōu)點：1.降低酶固定化時的變構, 保持酶的穩(wěn)定性；2.納米顆粒的布朗運動使納米固定化酶和底物頻繁碰撞, 大幅度提高催化效率，且納米結 構提高水相、有機相、油-水界面的催化效率；3.使伴隨輔酶再生的多酶催化體系成為可能；4.微反應器的設計使納米酶的回收利用成為可能, 將帶來更大的工業(yè)應用優(yōu)勢。（二）、納米技術在酶催化應用中的進展（二）、納米技術在酶催化應用中的進展1. 納米技術能夠實現(xiàn)酶的穩(wěn)定固定化

11、納米技術能夠實現(xiàn)酶的穩(wěn)定固定化 .納米顆粒的尺寸對酶的固定結構有很大影響粒徑越小，顆粒表面的曲率越大，酶與顆粒表面的接觸面積越小，就不容易使酶變構失活。 .納米顆粒顯示了顯著的尺寸效應顆粒越小, 布朗運動速率提高, 和底物的碰撞頻率迅速提高, 從而提高了催化效率。 .納米凝膠的柔性微環(huán)境能使酶發(fā)生柔性變化，從而和底物更好地結合；同時由于是納米尺寸，底物很容易從外擴散到酶附近?？梢哉J為，納米顆粒對酶的活性保持有利于我們進一步了解細胞內納微結構和環(huán)境對酶活性的影響，為設計仿生材料和環(huán)境提供新思路。2.納米技術能夠保持酶在有機相中的穩(wěn)定性納米技術能夠保持酶在有機相中的穩(wěn)定性 .由于限制了酶變構, 因

12、此固定化酶在有機溶劑中仍能保持高的活性； .納米孔也對酶結構有很好的穩(wěn)定作用 。與平坦的表面相比, 納米孔的高曲率能夠有效地維持酶的結構, 使酶得到穩(wěn)定固定化, 從而保持高的酶催化活性。（a: 由于酶和納米孔的表面曲率相似而能實現(xiàn)多鍵結合由于酶和納米孔的表面曲率相似而能實現(xiàn)多鍵結合; b: 酶與平面載體以單鍵結合）酶與平面載體以單鍵結合）（圖）納米孔穩(wěn)定納米酶示意圖（圖）納米孔穩(wěn)定納米酶示意圖3.3.納米技術能夠實現(xiàn)油納米技術能夠實現(xiàn)油- -水界面催化水界面催化l 酶應存在于相界面才能高效地實現(xiàn)催化; 而一般酶往往是溶于水相或油相。 .利用疏水性高分子材料(如聚苯乙烯)修飾水溶性酶, 通過合理

13、設計聚苯乙烯的分子量, 可以獲得兩親性的酶, 該兩親性酶能自組裝于油-水界面, 減少反應傳質阻力，提高界面自組裝酶的催化活性。 .疏水性納米材料的固相界面能使酶在油-水界面更加穩(wěn)定。（圖）（圖） 單壁碳納管修飾的大豆過氧化物酶單壁碳納管修飾的大豆過氧化物酶( )和天然酶和天然酶( )在油水兩相中的穩(wěn)定性在油水兩相中的穩(wěn)定性4.4.納米技術能夠實現(xiàn)多酶催化反應體系的構建納米技術能夠實現(xiàn)多酶催化反應體系的構建目前, 在工業(yè)上獲得應用的基本為單酶體系。有很多反應體系需要同時使用酶和輔酶, 而輔酶往往非常昂貴, 如果不能使其再生, 則難以在實際生產中獲得應用。l現(xiàn)用的兩種方法：現(xiàn)用的兩種方法： .將兩

14、種酶與輔酶共同固定在納米孔內, 輔酶在兩種酶之間穿梭, 一種酶與輔酶的還原態(tài)共催化生成產物1, 另一種酶則與輔酶的氧化態(tài)共催化生成產物2 。這種設計不僅實現(xiàn)了輔酶再生, 而且可以同時獲得兩種重要產品。由于納米孔尺度小, 輔酶依靠熱振動就能在兩種酶之間穿梭。同時, 納米孔還能使酶穩(wěn)定 .多酶體系也可以利用納米顆粒來實現(xiàn), 將分別固定了酶和輔酶的納米顆?；旌? 依靠納米顆粒的布朗運動來實現(xiàn)酶和輔酶的共催化以及輔酶再生。（圖）（圖） 包括輔酶再生的納微結構多酶催化體系設計。包括輔酶再生的納微結構多酶催化體系設計?！?左左)酶酶-輔酶通過由布朗運動驅動的納米粒子之輔酶通過由布朗運動驅動的納米粒子之間的碰撞發(fā)生相互作用并催化生物轉化反應間的碰撞發(fā)生相互作用并催化生物轉化反應; (右右)納米粒子被包埋在多孔微膠囊的內部形成微納米粒子被包埋在多孔微膠囊的內部形成微反應器反應器, 既能保證底物與產物的自由出入既能保證底物與產物的自由出入, 又避免又避免直接利用納米粒子所帶來的催化劑回收利用困難直接利用納米粒子所帶來的催化劑回收利用困難的問題。這樣的催化體系可靈活應用于諸如固定的問題。這樣的催化體系可靈活應用于諸如固定床和懸浮攪拌反應器中床和懸浮攪拌反應器中, 適于工業(yè)放大生產過程適于工業(yè)放大生產過程】五、納米載體固定化酶的應用與待解