免疫膠體金標(biāo)記手冊

1、.浙江大學(xué)電子顯微鏡室 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)培訓(xùn)班技術(shù)資料胡東維 洪 健 徐 穎浙江大學(xué)2001年10月精品.一、膠體金的制備根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1500nm的膠體金粒子，但做為免疫標(biāo)記探針，其直徑應(yīng)在3-30nm范圍內(nèi)。在氯化金（haucl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。以檸

2、檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對一致、直徑316nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進(jìn)行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時在溶液中添加0.10.2的h2o2能夠去除這些殘基。雙標(biāo)記或制備5-10 nm的膠體金時建議使用該方法。利用檸檬酸為還原劑，可以制備12150 nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時，膠體金粒子的誤差也同時增加。因此做單標(biāo)記時，建議使用該方法制備12-16 nm直徑的膠體金。除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5 nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷

3、易燃且有毒，制備的殘液需進(jìn)一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液時一次配完，暫時不用的可以用1.5 ml試管分裝為1 ml保存（-20）。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時可硅化處理（1雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時，烘干）。配制各種試劑時均使用雙蒸水，隨后再用0.22 mm微孔濾膜過濾后使用。三角瓶可反復(fù)多次使用，不用時應(yīng)密封保存，以防污染。制備好的膠體金保存壽命較長，可4保存6個月以上或室溫下保存1-2個月。當(dāng)出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。但無論無何，在保存較長時間后應(yīng)進(jìn)行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金

4、粒子凝集，說明已經(jīng)過期。1、單寧酸/檸檬酸鈉法制備316 nm膠體金(1) 取一250 ml三角瓶，加入79 ml雙蒸水和1 ml 1氯化金，預(yù)熱至6070。(2) 取一50 ml燒杯，加入4 ml 1檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25精品. mm k2co3。預(yù)熱至6070。k2co3的作用是保持溶液的中性ph。因此如果單寧酸的量少于0.5 ml時，對ph的影響不大，k2co3可以省略。(3) 將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）450003420004450064120847010

5、410162、白磷還原法制備5 nm膠體金(1) 取250 ml三角瓶一個，加79 ml雙蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 m k2co3將溶液調(diào)至中性（ph7.0）。(2) 取0.2 ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5 ml試管中，再加0.8 ml乙醚，混勻。取0.7 ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作請帶手套，多余的磷溶液用cuso4進(jìn)行中和)。(3) 室溫下輕輕搖勻15 min，然后加熱沸騰并保持5 min，自然冷卻。3、檸檬酸三鈉法制備12-30 nm膠體金(frens, 1973)(1) 取250 ml三角瓶一個，加100 ml雙蒸水及1 ml 1%氯化金，加熱沸騰；檸檬酸

6、鈉(ml)膠體金(nm)5124163242.830(2) 取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中?；靹颍俦３址序v30 min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，則顏色偏向紫色。精品.注 意：(1) 由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進(jìn)行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。(2) 膠體金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個月。但決不可保存在0以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。二、蛋白-金復(fù)合體的制備

7、一般認(rèn)為膠體金粒子表面為一層aucl2，因此，粒子表面帶有負(fù)電荷，這種負(fù)電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護(hù)這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于ph值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的ph值，在ph=pi時為中性。由于在ph=pi時蛋白溶解度最小，因此這時它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在實(shí)際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為ph=pi+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。膠體金探針?biāo)玫鞍妆仨氁?jīng)過前處理，其目的在于（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾

8、蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進(jìn)行。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時與多個膠體金粒子結(jié)合，影響標(biāo)記的靈敏度和定量分析。（3）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過?。?0 kd），形成的蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時間內(nèi)失活。而分子量過大時，被認(rèn)為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標(biāo)記靈敏度，延長探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如bsa，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的探針。當(dāng)?shù)鞍浊疤幚硗瓿珊?/p>

9、，接著要確定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳ph值。對于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同ph值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定ph值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的探針。在高濃度電解質(zhì)（如nacl）作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜ph范圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜ph值為最佳ph值。但有些探針的實(shí)際情況并不完全如此，最穩(wěn)定發(fā)探針并不完全代表活性最好。這要靠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。精品.在確定最佳ph值后，最后要確定最小蛋白量，即能夠形成穩(wěn)定探針的蛋白的最小量。如果在制備探針時加入太多的蛋白，不僅造成浪費(fèi)，而且更為嚴(yán)重的是容易造成探針凝聚，并嚴(yán)重影響標(biāo)記活性。因?yàn)樘结樔芤褐械挠坞x蛋白容易搶先與標(biāo)記位點(diǎn)結(jié)合，起到

10、“封閉”（blocking）作用，而膠體金探針標(biāo)記不上。在標(biāo)記位點(diǎn)希少、被標(biāo)記物含量較少的情況下要特別注意。這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時，除了蛋白量完全不同外，往往最佳ph也有一定變化。因此，在探針制備每一環(huán)節(jié)應(yīng)隨時監(jiān)測探針對分布情況、負(fù)染結(jié)合及活性。1、抗血清的前處理一般抗血清中igg的含量為10-25%，而絕大部分為其它蛋白。用抗血清直接制備探針其標(biāo)記活性與特異性均不理想。因此需去除其中多數(shù)雜蛋白。但處理環(huán)節(jié)不宜太繁，在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與經(jīng)驗(yàn)缺乏的情況下更是如此，否則會導(dǎo)致igg活性的大幅降低。如果你的實(shí)驗(yàn)室在蛋白純化方面有很強(qiáng)的技術(shù)支持，高度純化后效果會更好。大量

11、工作表明，只用硫酸銨沉淀就可以得到足夠純度及高活性的igg蛋白。其基本步驟如下：(1) 取抗血清0.2 ml；(2) 加生理鹽水（0.85 nacl）0.3 ml，混勻；(3) 逐滴加入飽和 (nh4)2so4 0.5 ml，充分振蕩混勻，4靜置1 h；(4) 10000 rpm/min離心20 min，棄上清；(5) 加0.5 ml生理鹽水重懸浮，混勻；(6) 逐滴加0.25 ml飽和 (nh4)2so4，充分振蕩混勻，4靜置1 h；(7) 10000 rpm/min離心20 min，棄上清；(8) 重復(fù)58步驟一次；(9) 加生理鹽水0.5 ml重懸浮，混勻；(10) 生理鹽水中透析122

12、4 h；(11) 在0.2 m ph 9.0硼酸緩沖液透析1224 h；(12) 分裝，即將使用時4保存，備用-20保存。為最大限度保持抗體活性，整個過程應(yīng)在4下進(jìn)行。對于凍干抗血清或長時間保存的血清，將生理鹽水透析改為3精品. m kcns透析，促使聚合的多聚體解聚。如果抗血清效價較低時，不宜準(zhǔn)備膠體金探針。2、親和純化抗體的處理親和純化抗體多是一些商品化的通用抗體，即二抗。一般為羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗體。這些抗體一般有兩個問題，一是igg分子往往聚集為多聚體分子，二是往往含有較多的鹽分。因此前處理的目的在于脫鹽和解聚。其基本步驟如下：(1) 將親和純化抗體用生理鹽水稀釋為0.5-1 m

13、g/ml濃度(2) 在3 m kcns（硫氰酸鉀）溶液中透析12 h(3) 在2 mmol ph 9.0的硼酸緩沖液中透析12 h（更換透析液數(shù)次）(4) 分裝備用其它蛋白可參考此方法進(jìn)行。但注意后一種透析液的ph值應(yīng)與交聯(lián)時ph值一致。在實(shí)際運(yùn)用中，一般省略去3m kcns透析這一步，特別是當(dāng)?shù)鞍追肿恿枯^小，且為非糖蛋白時。我們建議在制備通用探針（如二抗igg，protein a，protein g，streptavidin）等時，嚴(yán)格使用該方法，而制備直接標(biāo)記探針時，也可以忽略處理步驟。3、igg fab片段的制備一般來說體積較小的探針具有相對較高的標(biāo)記活性。主要原因在于膠體金顆粒較小時有

14、利于在標(biāo)記溶液中的擴(kuò)散運(yùn)動；在膠體金直徑一定時，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位點(diǎn)也越密集，也容易于靶位點(diǎn)結(jié)合。igg分子量為150 kd左右，由4個亞基組成，即兩條重鏈（h）和兩條輕鏈（l）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到兩種片段，即fab和fc。其中fab是具有抗原識別活性的部分，回收后制備探針。fc能夠與protein a和protein g特異性結(jié)合。但這種分離只能在有條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。其基本過程如下：(1) 用pbs（ph 7.0，含10 mm edta，20 mm鹽酸半胱氨酸）溶解純化的igg(2) 加固化木瓜蛋白酶(3) 37處理5h(4) 離心，去除固化木瓜

15、蛋白酶（沉淀）(5) 過protein g柱精品.(6) 純化的fab片段按前文方法做進(jìn)一步處理注：fab與膠體金結(jié)合的ph值為6.54、蛋白與膠體金結(jié)合最佳ph測定(例纖維素酶，pi未知)(1) 取若干個1.5ml試管，分別加入1 ml 10 nm膠體金；(2) 用25 mm k2co3將ph分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10；(3) 取一96孔培養(yǎng)板，按ph從低到高分別將上述膠體金分別取100 ml加入孔中，重復(fù)三次；(4) 每孔分別加入3 ml濃度為1 mg/ml的纖維素酶，混合，室溫下放置10-15 min；(5) 每孔分別加入20 ml濃度為10 nacl溶液，混合，室溫下放置

16、10 min；(6) 觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低ph(x)；(7) 重復(fù)(1)-(5)步，ph梯度為x-0.6；x-0.3；x；x+0.3；x+0.6；x+1。(8) 觀察膠體金顏色變化直到室溫下放置2小時，記錄仍保持紅色的最低ph。注意：1如膠體金粒子直徑較?。?6nm），加nacl需放置較長時間（幾個甚至十幾個小時）后才能觀察到顏色變化。必要時可放大反應(yīng)體積（1 ml膠體金），并借助離心來判斷。2有些蛋白最佳ph范圍較窄，設(shè)置的梯度不能太大。5、最小蛋白濃度的確定(1) 用0.22 mm微孔濾膜過濾或高速離心去除蛋白中殘物或多聚體；(2) 取一96孔滴定板，每個重復(fù)為若干個孔，

17、分別加入最佳ph的膠體金100 ml，重復(fù)3次；(3) 各孔依次加入不同量的蛋白（一般濃度為0.05-0.1 mg/ml）120 ml，混勻，室溫下放置15min；(4) 加入20 ml 10 nacl，室溫下放置10min；(5) 顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即最小蛋白濃度。精品.(6) 為確保結(jié)果準(zhǔn)確性，可放大反應(yīng)體積重復(fù)以上步驟。注：在實(shí)際探針制備工作中，蛋白濃度往往為最小濃度的130。6、igg-gold的制備(1) 取兩個1.5 ml試管，分別加入1.2 ml 10 nm膠體金；(2) 加入適量25 mm k2co3把ph調(diào)整為9.0；(3) 分別加入10 ml濃度為1 mg/ml

18、igg，混勻，室溫放置10min；(4) 分別加入12 ml 2% peg20000，室溫放置5 min；(5) 10000 rpm離心20 min，輕輕吸除上清；(6) 用20 ml bl溶液重懸浮松散的膠體金沉淀，并集中到新管中；(7) 分別加20 ml 甘油，充分混勻；(8) -20保存?zhèn)溆谩Ｗ⒁猓?).不同直徑膠體金所需要的蛋白量差別很大；2).不同直徑膠體金所需離心速度完全不同。以絕大部分探針形成松散沉淀為原則。離心力太大，會產(chǎn)生不可逆的探針凝聚；離心力太小，探針無法沉下。最好能夠直接用膠體金在不同轉(zhuǎn)速下離心以確定適當(dāng)?shù)碾x心力。3).在冷離心機(jī)中可適當(dāng)延長離心時間，同時適當(dāng)減小離心力

19、，探針活性較好。4).igg的最佳交聯(lián)ph有多種報(bào)導(dǎo)，從7.4-9.0。一般認(rèn)為，7.4時膠體金結(jié)合的蛋白最多，9.0時制備的探針最穩(wěn)定。三、樣品的固定、包埋與標(biāo)記1固定為了減少對標(biāo)記底物結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞化學(xué)樣品固定的時間相對較短，多為1-3小時。環(huán)境溫度一般在25c以下。低溫固定劑一般采用2-3%甲醛與1%戊二醛。甲醛分子量小、滲透快，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，可較好地保存其抗原活性。但對細(xì)胞整體的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存欠佳。戊二醛對細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存較好，但往往導(dǎo)致蛋白失去抗原活性。因此，在標(biāo)記低物不是蛋白質(zhì)或多肽時（如纖維素、多酚類化合物、精品.b-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)等），可用常規(guī)方法進(jìn)行4%戊二醛

20、和1%鋨酸的雙固定。2包埋根據(jù)標(biāo)記低物的不同，可以選擇常規(guī)（常溫）包埋劑或低溫包埋劑包埋樣品。如果標(biāo)記物為蛋白質(zhì)，特別是性質(zhì)不穩(wěn)定或不清楚時，建議使用低溫包埋劑包埋，以最大程度保存抗原活性。大量實(shí)驗(yàn)表明，k4m是目前使用最為普遍的低溫包埋劑。當(dāng)選擇常溫包埋劑時，建議使用spurr包埋劑。spurr包埋劑粘性小，易滲透，易操作；包埋塊不吸潮，保存時間長。3標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記程序的不同，標(biāo)記分直接與間接標(biāo)記。直接標(biāo)記指膠體金探針直接與被標(biāo)記底物結(jié)合；而間接標(biāo)記指膠體金探針通過一或多個中間標(biāo)記物后與底物結(jié)合。直接標(biāo)記 間接標(biāo)記直接標(biāo)記需要制備膠體金探針，其好處是標(biāo)記特異性好，背景小，能夠做陰性對照。間接標(biāo)

21、記無需制備膠體金探針，可以直接購買通用二抗探針，缺點(diǎn)是標(biāo)記特異性較難把握，背景較高，不能夠做陰性對照。在做病毒粒子標(biāo)記時，直接標(biāo)記法可用抗體直接富集低濃度或稀有病毒而不會增加任何背景。影響標(biāo)記的因素主要包括以下方面：（1）phph變化會對探針蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心產(chǎn)生影響，繼而影響到標(biāo)記強(qiáng)度與特異性。在很多情況下探針作用的最佳ph值往往與該蛋白作用的最佳ph值有一定差別。例如有一種來自真菌的纖維素酶本來在ph 4.8時活性最強(qiáng)，但結(jié)合到膠體金上后，ph在6.0左右時最強(qiáng)，當(dāng)ph到7精品.2時仍有較強(qiáng)的標(biāo)記活性。（2）離子環(huán)境有些蛋白只有在一定離子環(huán)境中才有生物活性，其中很多涉及ca2+，mg2+

22、，mn2+，cu2+等陽離子。有時溶液中ca2+、cu2+等容易形成不溶性沉淀而導(dǎo)致標(biāo)記失??；因此，在配制標(biāo)記溶液時要注意各種陰陽離子的配伍，添加順序及溶液ph。（3）溫度標(biāo)記溫度對標(biāo)記活性及特異性影響最大，也最容易出問題。以水解酶類做成的膠體金探針對溫度變化也更為敏感，不同溫度、不同時間標(biāo)記出的切片其視覺效果完全不一樣。在此特別指出一點(diǎn)，在用內(nèi)切的水解酶探針時，切忌溫度過低，時間過長，否則會出現(xiàn)標(biāo)記的擴(kuò)散現(xiàn)象。建議在可能時盡量使用外切酶探針。在使用igg或protein a，protein g探針時，有人認(rèn)為在4下長時間標(biāo)記特異性最好。但我們研究發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此，在25以上的室溫下標(biāo)記20-

23、60 min其特異性更好。一般來說，如果用來自植物或微生物的蛋白做探針，標(biāo)記溫度最好在25左右；用來自動物的蛋白做探針時，標(biāo)記溫度最好在30左右。（4）封閉液組成封閉液對封閉有關(guān)非特異性活性基團(tuán)，特別是醛基至關(guān)重要。在多數(shù)情況下封閉液與探針重懸浮液、標(biāo)記溶液是一樣的。目前最常用的封閉液組分有bsa、卵清蛋白、脫脂奶粉、peg20000等。在用igg、protein a、protein g等標(biāo)記時，應(yīng)優(yōu)先選用bsa(組分五)；在植物凝集素類探針標(biāo)記時，應(yīng)優(yōu)先選用peg20000。也有人發(fā)現(xiàn)igg探針標(biāo)記時脫脂奶粉最佳。如果是用交聯(lián)蛋白做成的探針，那么封閉液中最好有載體蛋白的成分。精品.4樣品的低

24、溫包埋的基本程序(1) 將新鮮樣品切成113 mm3的小塊，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸緩沖液(100 mm, ph 7.2)中4c下固定2 h；(2) 在4c依次用30%、50%乙醇溶液脫水，每步30 min；(3) 在-20c冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脫水，每步60 min；（注意乙醇溶液首先在冰箱中預(yù)冷?。?4) 在-20c冰箱中依次用30%、70%、100%的k4m滲透，每步120 min；注意不斷輕輕搖動樣品使?jié)B透完全。(5) 在4c k4m樹酯包埋。注意包埋劑應(yīng)盡量裝滿，否則氣泡中的氧氣會抑制包埋劑的聚合。(6) 在-20c冰箱中

25、長紫外線照射聚合72 h。室溫下聚合48 h。注意每天翻動2次樣品使紫外光照射均勻。(7) 聚合后的樣品應(yīng)及時切片，長時間放置會導(dǎo)致樣品與包埋劑之間分離而無法切片。(8) 超薄切片應(yīng)收集在鎳網(wǎng)、金網(wǎng)或鈹網(wǎng)上做膠體金標(biāo)記。與其它標(biāo)記用包埋劑相比，k4m可在-35c低溫下仍保持較低的黏度；k4m有極性，親水，易脫水，易標(biāo)記；聚合后交聯(lián)度高，易切片。k4m的配方根據(jù)材料的性質(zhì)確定。植物或堅(jiān)硬的材料包埋劑的硬度要高；動物或幼嫩材料包埋劑的硬度要低。具體參見包埋劑說明。注意：(1) k4m有毒，須帶pvc或pvdv手套謹(jǐn)慎操作。濺入眼睛或皮膚時請立刻用清水沖洗。(2) 所有脫水乙醇須提前預(yù)冷。(3) 脫

26、水過程中防止樣品結(jié)霜吸潮。5樣品常溫包埋（常規(guī)）的基本程序（1） 將新鮮樣品切成113 mm3的小塊，立即放入4%戊二醛的磷酸緩沖液(100 mm, ph 7.2)中4c下固定612 h；（2） 樣品用磷酸緩沖液沖洗3次每次5 min；然后在2%鋨酸溶液中固定1 h；沖洗3次，每次5分鐘。（通風(fēng)櫥中戴手套進(jìn)行，含鋨酸廢液倒入食用油中?。┚?（3） 在4c或室溫下依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脫水，每步15 min；（4） 依次用30%、70%、100%的spurr包埋劑滲透，每步120 min；然后在100%的spurr包埋劑中過夜。（5） spu

27、rr包埋劑包埋?？砂裨?.5 ml的離心管中，每管加0.3 ml包埋劑即可。加入紙標(biāo)簽。（6） 在70c溫箱中聚合1216 h。（7） 聚合后的樣品可長時間保存。超薄切片應(yīng)收集在鎳網(wǎng)、金網(wǎng)或鈹網(wǎng)上做膠體金標(biāo)記。6膠體金直接標(biāo)記基本程序(1) 在培養(yǎng)皿中鋪上石蠟?zāi)?parafilm)；四周加吸水紙和水以保濕；(2) 加一滴dd h2o，鎳網(wǎng)切片向下漂浮2 min；(3) 另滴50 ml封閉液(bl)，將鎳網(wǎng)切片向下漂浮30 min；(4) 另滴50 ml封閉液(bl)，加入2-3 ml膠體金探針，充分混勻；將鎳網(wǎng)切片向下漂浮30 min；(5) 標(biāo)記后鎳網(wǎng)的在dd h2o上漂洗除去未標(biāo)記的膠體

28、金探針，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干；(6) 常規(guī)染色，觀察。7膠體金間接標(biāo)記基本程序(1) 鎳網(wǎng)切片向下在dd h2o上漂浮2 min；(2) 在封閉液(bl)上漂浮30 min；(3) 把一抗用bl稀釋100-500倍，將鎳網(wǎng)切片向下漂浮30-60 min；(4) dd h2o漂洗兩次各5 min，除去多余一抗；(5) 在封閉液(bl)上漂浮30 min；(6) 用膠體金探針標(biāo)記30 min；(7) dd h2o上漂洗除去未標(biāo)記的膠體金探針，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干；(8) 常規(guī)染色，觀察。精品.8利用膠體金間接標(biāo)記法進(jìn)行雙標(biāo)記的基本程序(1) 鎳網(wǎng)切片向下在dd

29、h2o上漂浮2 min；(2) 在封閉液(bl)上漂浮30 min；(3) 把一抗a用bl稀釋100-500倍，將鎳網(wǎng)切片向下漂浮30-60 min；(4) dd h2o漂洗兩次各5 min，除去多余一抗a；(5) 在封閉液(bl)上漂浮30 min；(6) 用小顆粒膠體金探針a標(biāo)記30 min；(7) dd h2o漂洗兩次各5 min，除去多余膠體金探針a；(8) 重復(fù)步驟(2)-(7)，其中抗體和探針改用一抗b和大顆粒膠體金探針b；(9) dd h2o上漂洗除去未標(biāo)記的膠體金探針，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干；(10) 常規(guī)染色，觀察。9利用膠體金直接標(biāo)記法進(jìn)行雙標(biāo)記的基本程序如

30、果兩種探針的重懸浮液相同（如同為igg-gold），可直接混合，按上述5的方法進(jìn)行。單混合時大顆粒膠體金的量要適當(dāng)增加。如果兩種探針的重懸浮液差別較大，可分別進(jìn)行直接標(biāo)記。步驟如下：(1) 鎳網(wǎng)切片向下在dd h2o上漂浮2 min；(2) 在封閉液1上漂浮30 min；(3) 用膠體金探針1標(biāo)記30 min；(4) dd h2o上漂洗除去未標(biāo)記的膠體金探針，共漂洗2次，每次5-10 min；(5) 在封閉液2上漂浮30 min；(6) 用膠體金探針2標(biāo)記30 min；(7) dd h2o上漂洗除去未標(biāo)記的膠體金探針，共漂洗3次，每次5-10 min；晾干；(8) 常規(guī)染色，觀察。10直接法標(biāo)

31、記粗提純病毒(1) 取新覆膜鎳網(wǎng)，在用bl稀釋500倍的病毒抗血清上漂浮3 min；(2) 在病毒溶液上吸附10 min；(3) bl封閉30 min；(4) 一抗膠體金探針標(biāo)記30-120 min；(5) 水洗3次，每次5-10 min；(6) 2%醋酸雙氧鈾負(fù)染。精品.注意：(1) 如果使用間接標(biāo)記方法，不能采用或只能采用高度稀釋的抗體吸附病毒。否則，高強(qiáng)度的標(biāo)記背景影響正確判斷。(2) 該方法允許多探針直接混合一步法同時標(biāo)記多種病毒。特別適應(yīng)于對未知病毒的檢測。膠體金標(biāo)記技術(shù)路線的選擇1包埋劑根據(jù)抗原或標(biāo)記底物性質(zhì)決定包埋劑種類。蛋白類，推薦使用k4m；包埋后立即切片標(biāo)記。外泌蛋白可選擇

32、spurr?？砷L期保存使用。細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分，如纖維素、b-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)、多酚化合物等，可選擇spurr。2膠體金體積精細(xì)定位如病毒、細(xì)胞器定位等選用5 nm膠體金。細(xì)胞壁組分采用15-20 nm膠體金。多標(biāo)記時，膠體金直徑推薦選用6 nm、10 nm、15 nm；穩(wěn)定抗原采用較大顆粒膠體金。一般蛋白標(biāo)記采用10 nm。3通用探針選擇igg-gold：-20c可保存1年；但定位時膠體金距離標(biāo)記位點(diǎn)較遠(yuǎn)，不適于精細(xì)定位。protein a/g：-20c可保存3個月；但定位時膠體金距離標(biāo)記位點(diǎn)較近，適于精細(xì)定位和多標(biāo)記。精品.protein a和protein g與不同抗體之間的親和性抗體來

33、源igg類型與protein a的親和性與protein g的親和性人igg(正常)+igg1+igg2+igg3+igg4+小鼠(mouse)igg1+igg2a+igg2b+igg3+大鼠(rat)igg1+igg2a+igg2b+igg2c+山羊(goat)igg+綿羊(sheep)igg+家兔igg+狗igg+豬igg+雞igg+馬igg+豚鼠(guinea-pig)igg+倉鼠(hamster)igg+貓igg+小牛igg+精品.膠體金制備與標(biāo)記中常見的緩沖液配方1醋酸鹽緩沖液（200 mm）ph200 mm naac(ml)200 mm hac(ml)ph200 mm naac(m

34、l)200 mm hac(ml)3.60.708.85.07.03.04.02.657.3200 mm naac溶液的配制：naac3h2o定容于1000毫升。2磷酸鹽緩沖液（pbs, 200 mm）ph200mm na2hpo4 (ml)200mm nah2po4 (ml)ph200mmna2hpo4 (ml)200mm nah2po4 (ml)5.88.0927.061396.012.387.77.272286.218.58

35、1.57.481196.426.573.57.687136.637.562.57.849518.094.75.31 m na2hpo4溶液的配制：178.05克na2hpo42h2o或358.22克na2hpo412h2o定容于1000毫升。1m nah2po4溶液的配制：138克nah2po4naach2o或156克nah2po42h2o定容于1000毫升。精品.3trihcl緩沖液（50mm）ph23c 37c200mm tris(ml)100mm hcl(ml)ph23c 37c200mm tris(ml)100mm hcl(ml)9.10 8.95255.08.05

36、 7.902527.58.92 8.78257.57.96 7.822530.08.74 8.602510.07.87 7.732532.58.62 8.482512.57.77 7.632535.08.50 8.372515.07.66 7.522537.58.40 8.272517.57.54 7.402540.08.32 8.182520.07.36 7.222542.58.23 8.102522.57.20 7.0525458.14 8.002525.050 mm tris溶液的配制：36.3克tris定容于1000毫升。4硼酸鹽緩沖液（200 mm）ph50mm na2b4o7(ml

37、)200mm h3bo3 (ml)ph50mm na2b4o7(ml)200mm h3bo3 (ml)7.41.07.8288.7648.0379.082200 mm h3bo3溶液的配制：12.37克h3bo3定容于1000毫升。50mm na2b4o7溶液的配制：19.07克na2b4o73h2o定容于1000毫升。精品.5碳酸鹽緩沖液（100 mm）ph20c 37c100 mm na2co3(ml)100 mm nahco3 (ml)ph20c 37c100 mm na2co3(ml)100 mm nahco3 (ml)9.16

38、8.771910.14 9.99649.40 9.122810.28 10.08739.51 9.403710.53 10.28829.78 9.504610.83 10.57919.90 9.7255100 mm na2co3溶液的配制：28.62克na2co3定容于1000毫升。100mm nahco3溶液的配制：8.4克nahco3定容于1000毫升。本緩沖液臨用前配制，不能長時間保存。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中有ca2+、mg2+時不能使用。圖1. igg的基本結(jié)構(gòu)h，重鏈；l，輕鏈；hc，重鏈保守區(qū)；hv，重鏈變異區(qū)；lc，輕鏈保守區(qū)；lv輕鏈變異區(qū)。箭頭為木瓜蛋白酶與胃蛋白酶的酶切位點(diǎn)。fab、f

39、c分別為木瓜蛋白酶水解后的兩種片段。protein a和protein g可識別fc部分。精品.主要參考文獻(xiàn)1. beesley je ed. immunocytochemistry, a practical approach. oxford university press. 19932. benhamou n, lafontaine pj. 1995. ultrastructural and cytochemical characterization of elicitor-induced responses in tomato root tissues infected by fusar

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