g97310011六頁稿東海大學(xué)化學(xué)工程與材料工程學(xué)系

1、fept磁性奈米粒子的製備、應(yīng)用及其發(fā)展黃琳育*,何志松私立東海大學(xué)化學(xué)工程與材料工程學(xué)系摘要本研究由化學(xué)還原合成法製備出油溶相fept奈米粒子，並改變界面活性劑的比例參數(shù)，以操控製備出的奈米粒子尺寸及其分散度。使用硫醇族的化合物做表面修飾，將粒子轉(zhuǎn)換成水溶相，並藉由xrd、tem與vsm進(jìn)行水溶相與油溶相粒子性質(zhì)分析。將水溶相的fept磁性奈米粒子，以edc做接連劑，與酵素hrp做結(jié)合，再加入abts顯色，使用紫外線及可見光光譜儀分析其在不同hrp濃度下的吸收光譜，觀察吸收光譜強(qiáng)度隨著hrp濃度改變，可做為定量分析之依據(jù)。一、 緒論1-1 前言近年來磁性奈米粒子在製程上有許多研究，包括合金式

2、的磁性奈米粒子 1；核殼式的磁性奈米粒子 2；還有中空式的磁性奈米球 3等。應(yīng)用方面被廣泛運(yùn)用於生醫(yī)領(lǐng)域上，包含了在體外做診斷用的生物分離4及生物感測(cè)上，與體內(nèi)診斷的核磁共振造影5，和利用磁性奈米粒子做載體進(jìn)行藥物傳遞6，及標(biāo)靶式的磁熱治療7。1-2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)與目的本研究將以fept奈米粒子為載體，藉由表面修飾，使fept磁性奈米粒子能接上蛋白質(zhì)分子，再應(yīng)用簡(jiǎn)易的顯色及光學(xué)吸收儀器做定量檢測(cè)。二、 文獻(xiàn)回顧2-1fept磁性奈米粒子特性介紹近年來fept磁性奈米粒子被廣泛地研究，起初被當(dāng)做永久磁鐵8，進(jìn)而被用於磁記錄元件上，當(dāng)fept粒子小至奈米尺度，將呈現(xiàn)出超順磁的磁性質(zhì)，在無外加磁場(chǎng)下，粒

3、子間無引力，不會(huì)造成聚集現(xiàn)象，可良好地分散在溶液中，成為在生醫(yī)應(yīng)用上的優(yōu)點(diǎn)之一。2-2fept磁性奈米粒子製備首次發(fā)表利用化學(xué)還原法，將fe(co)5熱分解，與還原pt(acac)2，octyl ether做為溶劑，並藉由oleic acid與oleylamine做為保護(hù)劑以控制還原劑量，使反應(yīng)能自組裝合成，製備出大小為310 nm的。而kevin e. elkins等人將製程中鐵的前驅(qū)物改為fe(acac)3取代，使製程為無毒性且無揮發(fā)性8。2-3製備具有生物功能性的fept奈米粒子由於fept磁性奈米粒子的化學(xué)穩(wěn)定性佳，且無毒性，具有良好的生物相容性，使用化學(xué)還原法製備的fept磁性奈米粒

4、子，最小能到2 nm，其相對(duì)的比表面積增加許多。若將此fept磁性奈米粒子接連生物分子，則能抓取較多分子。但所介紹的合成方法中，均為製備油溶相的fept磁性奈米粒子，若要應(yīng)用於生醫(yī)上，則需轉(zhuǎn)換為水溶相。三、 fept磁性奈米粒子3-1製備油溶相fept磁性奈米粒子3-1-1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)我們利用化學(xué)還原法製備fept磁性奈米粒子。用fe和pt的錯(cuò)合物鹽類做為前趨物，以octyl ether當(dāng)溶劑，藉由還原劑1,2-hexadecandiol進(jìn)行高溫加熱，並加入oleic acid與油胺oleylamine做界面活性劑，使fept粒子慢慢形成奈米大小。3-1-2實(shí)驗(yàn)藥品platinum() acety

5、lacetonate, iron() acetylacetonate, 1,2-hexadecanediol, oleic acid, oleylamine, octyl ether.矽油、乙醇。3-1-3實(shí)驗(yàn)裝置本實(shí)驗(yàn)裝置如圖3-1，本實(shí)驗(yàn)是以微電腦加熱器控制加熱溫度及升溫速率，並且運(yùn)用十字磁石攪拌，並全程在通入氬氣絕氧的環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。圖3-1實(shí)驗(yàn)裝置圖3-1-4實(shí)驗(yàn)步驟此實(shí)驗(yàn)是利用化學(xué)還原法來製備fept磁性奈米粒子，固定前趨物fe與pt的莫爾比為2比1，並改變界面活性劑的比例來製備fept磁性奈米粒子，如圖3-2為實(shí)驗(yàn)流程圖。purging with ar (30 min at roo

6、m temperature) roomtemperature)heat to 100 (ar blanket)held at 100 for 20 min (ar blanket)oleylamine (0.5 mmol)+oleic acid (1 mmol)heat to 295 (7/min) (ar blanket)held at 295 for 1 hr (ar blanket)cooling down to room temperaturept(acac)2 (0.5 mmol) + fe(acac)3 (1 mmol)+ 1,2-hexadecanediol(4.5 mmol)

7、+ octyl ether (30ml)圖3-2製備油溶相fept實(shí)驗(yàn)流程圖3-2製備水溶相fept磁性奈米粒子3-2-1前言運(yùn)用相轉(zhuǎn)換的方式，將所製備的油溶相粒子經(jīng)由表面官能基的替換，使其呈現(xiàn)親水的性質(zhì)，得到水溶相的奈米粒子。3-2-2實(shí)驗(yàn)藥品mercaptoacetic acid, chloroform, ethanol.3-2-3實(shí)驗(yàn)步驟利用相轉(zhuǎn)換方式將製備好的油溶相fept磁性奈米粒子，做表面修飾，轉(zhuǎn)換成水溶相fept磁性奈米粒子。其實(shí)驗(yàn)步驟如下:1. 將油溶相fept磁性奈米粒子溶於氯仿中(1 mg/ml)，使用超音波震盪器使粒子均勻分散在溶液中。2. 加入濃度1 m的相轉(zhuǎn)換試劑me

8、rcaptoacetic acid，放入磁石攪拌，使反應(yīng)在劇烈攪拌中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為兩小時(shí)以上。3. 使用強(qiáng)力磁鐵吸引粒子使其沉降至瓶子底部，完成ligand exchange的程序，如圖3-3。4. 利用強(qiáng)力磁鐵將粒子進(jìn)行純化的步驟，放入烘箱烘乾，即可得水溶相fept磁性奈米粒子。圖3-3fept磁性奈米粒子(a)相轉(zhuǎn)換前 (b)相轉(zhuǎn)換後3-3油溶相fept磁性奈米粒子分析與討論我們?cè)囍{(diào)整製程中加入不同界面活性劑的量，變更為(30、20、10、5、1、0.5與0.25倍)，探討其性質(zhì)及轉(zhuǎn)相前後的差異。3-3-1 油溶相fept磁性奈米粒子粒徑分析將不同介面活性劑製程的油溶相粒子，以tem電

9、子顯微鏡觀察粒徑及分散情形，如表3-1。表3-1各種比例下油溶相粒子大小樣品代碼粒徑大小(nm)axb3.180.48c2.220.33d1.920.45e2.720.73f2.220.33 x表示油溶相的樣品a其tem圖無法明確的觀測(cè)到粒子以上量測(cè)的五組數(shù)據(jù)來看，雖然添加不同量的界面活性劑，但在粒徑的大小上並未觀察到有明顯差異，粒徑大小固定在23 nm。3-3-2油溶相fept磁性奈米粒子磁性質(zhì)分析我們利用vsm來量測(cè)粒子的磁性質(zhì)。在室溫下，外加磁場(chǎng)為-20 koe至20 koe，如圖3-4。圖3-4各樣品之vsm磁滯曲線圖3-3-3油溶相fept磁性奈米粒子晶格結(jié)構(gòu)分析我們藉由xrd對(duì)粒子

10、做晶格結(jié)構(gòu)的分析如圖3-5，在40.5時(shí)有一個(gè)fept(111)的主要繞射峰出現(xiàn)。圖3-5油溶相樣品e、fept database及玻璃載盤之xrd圖3-4水溶相fept磁性奈米粒子分析與討論3-4-1 水溶相fept磁性奈米粒子粒徑分析不同樣品的水溶相fept磁性奈米粒子，以tem電子顯微鏡觀察粒徑及分散情形，如表3-3。表3-3各種比例下水溶相粒子大小樣品代碼粒徑大小(nm)axb1.940.28c2.080.27d2.460.48e1.820.36fx x表示油溶相的樣品a、f其tem圖無法明確的觀測(cè)到粒子經(jīng)過相轉(zhuǎn)換後，將水溶相的粒子分散在n-hexanol或pbs buffer中，觀察

11、到樣品在粒徑大小上並沒有很大的改變，仍維持在23nm，如表3-2。3-4-2 水溶相fept磁性奈米粒子晶格結(jié)構(gòu)分析轉(zhuǎn)相前後的xrd結(jié)構(gòu)分析，在主要繞射峰並無位移的現(xiàn)象，皆出現(xiàn)在40.5的位置，如圖3-6。圖3-6 樣品d相轉(zhuǎn)換前後之xrd圖3-4-3 水溶性fept磁性奈米粒子磁性質(zhì)分析相轉(zhuǎn)換後的磁滯曲線觀察，其水溶相樣品飽和磁化量明顯的降低，如圖3-7。圖3-7 樣品d相轉(zhuǎn)換前後之vsm圖四、 fept磁性奈米粒子與hrp的結(jié)合與檢測(cè)4-1前言由相轉(zhuǎn)換過後的fept磁性奈米粒子當(dāng)作載體，先將粒子分散在pbs buffer中，經(jīng)由edc作交聯(lián)劑將水溶相fept磁性奈米粒子表面的羧基修飾成胺基

12、 9。之後再與hrp作結(jié)合，最後利用與abts substrate的顯色，使用紫外光/可見光分光光度儀檢測(cè)其吸收峰，藉由改變hrp的濃度，來觀測(cè)其定量分析的效果。4-1-1辣根過氧化酶hrp簡(jiǎn)介辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, hrp)是一種血紅素蛋白質(zhì)，分子量約為44 k，其結(jié)構(gòu)包含蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)兩部分，蛋白質(zhì)部分由308個(gè)胺基酸組成，而非蛋白質(zhì)部分則含一個(gè)血基質(zhì)，具有穩(wěn)定酵素結(jié)構(gòu)的功能10。4-1-2hrp應(yīng)用簡(jiǎn)介近年來，hrp具有熱穩(wěn)定性及催化效率高的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用於各種領(lǐng)域10。此研究選用hrp與fept磁性奈米粒子結(jié)合後，再以abts試劑反應(yīng)顯色，利用紫外光

13、/可見光分光光譜儀，即可簡(jiǎn)單迅速的完成定性與定量分析。4-1-3protein-label分析方法實(shí)驗(yàn)採(cǎi)用protein-label的分析方法。選用酵素hrp與水溶相的fept磁性奈米粒子做結(jié)合，若與奈米粒子結(jié)合完成，立即加入abts substrate試劑，可觀察溶液有無顏色變化。若顏色產(chǎn)生變化，由無色改變成綠色，則表示結(jié)合成功，如圖4-1所示。(a)(b)圖4-1顯色前後示意圖:(a)abts substrate(b)接合後與abts之顯色圖4-2 實(shí)驗(yàn)藥品edc, abts,hrp.4-3 實(shí)驗(yàn)步驟(a)hrp的活性測(cè)試1.取50 l hrp(10 mg/ml)溶液。2.加入100 l

14、abts試劑，靜置兩分鐘，此時(shí)溶液會(huì)變成藍(lán)綠色。3.將樣品稀釋至1 ml，即可做分光光譜儀檢測(cè)。(b)結(jié)合不同hrp濃度1.將4 mg的水溶相粒子溶於1 ml pbs buffer的溶液，取出100 l。2.加入edc(0.5 mg/ml)溶液50 l，在室溫下震盪反應(yīng)30分鐘。3.去除上層液，再加入100 l pbs buffer。重複此步驟2次。4.加入hrp溶液(301 mg/ml) 50 l，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。5.取出上層液，再加入100 l pbs buffer。重複此步驟3次。6.取出上層液，將下層粒子加入100 l abts buffer。7.靜置2 min，顯色即有接上，加入

15、900 l pbs buffer稀釋之後即可做紫外光分光光譜儀之檢測(cè)。4-4 結(jié)果與討論4-4-1hrp的活性分析為了找出abts與hrp顯色後的吸收光譜特徵峰，以pbs buffer與abts混合的溶液，做為背景值，再將製備好含有hrp且顯色完成的溶液放入紫外光分光光譜儀，掃描波長(zhǎng)在200 nm400 nm，如圖4-2。在波長(zhǎng)385 nm430 nm有一個(gè)明顯的特徵峰。圖4-2hrp活性檢測(cè)之吸收光譜圖4-4-2 改變與粒子結(jié)合的hrp濃度圖4-3為未與hrp做結(jié)合的背景吸收光譜圖，可觀察在350 nm與300 nm有特殊的吸收峰，此兩個(gè)吸收峰沒有出現(xiàn)在圖4-2，所以我們推測(cè)此兩個(gè)吸收峰是水

16、溶相粒子的吸收峰。圖4-3含粒子的背景值之光譜圖水溶相粒子分別與hrp濃10 mg/ml結(jié)合後，再和abts反應(yīng)顯色之後，掃描吸收光譜圖、如圖4-4，觀察到有粒子的吸收峰與abts和hrp反應(yīng)之後的吸收峰。隨abts加入後的時(shí)間越長(zhǎng)，吸收值逐漸降低， 120分鐘後，反應(yīng)的吸收峰有明顯的減小，靜置一天後則此吸收峰完全消失。圖4-4濃度10 mg/ml的hrp顯色後在不同時(shí)間下之吸收光譜圖圖4-5為接合不同濃度hrp再與abts反應(yīng)顯色五分鐘之後的吸收光譜圖，可觀察到接合的hrp濃度越低時(shí)，反應(yīng)之後的主吸收峰會(huì)隨之降低，可為定量分析之依據(jù)。接合的hrp濃度降至5 mg/ml以下，無法辨別。圖4-5

17、粒子與不同濃度的hrp顯色五分鐘後之吸收光譜圖五、 結(jié)論1.合成油溶相粒子，粒徑大小約在23 nm之間。2.將界面活性劑的添加比例改變時(shí)，在粒徑並未觀察到明顯差異，粒子的分散度也無明顯差異。3.vsm的分析下，除了樣品d的圖形接近超順磁現(xiàn)象外，其他樣品皆呈現(xiàn)軟磁性的磁滯曲線。4.觀察磁滯曲線，無法看出樣品呈現(xiàn)規(guī)律變化的趨勢(shì)。5.xrd的結(jié)構(gòu)分析，皆有出現(xiàn)在40.5的fept(111)主要繞射峰。轉(zhuǎn)相前後，在主要繞射峰並無位移的現(xiàn)象。6.轉(zhuǎn)相試劑，將油溶相粒子表面修飾為親水性的水溶相粒子。7.相轉(zhuǎn)換後飽和磁化量明顯降低。8.在hrp定性反應(yīng)的光譜掃描下，在波長(zhǎng)385 nm430 nm有一個(gè)明顯的

18、特徵峰。9.當(dāng)接合的hrp濃度越低時(shí)，反應(yīng)後的主吸收峰會(huì)隨之降低，為定量分析之依據(jù)。但當(dāng)濃度降至5 mg/ml以下，則無法辨別。10.接在粒子上的hrp酵素活性，會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，逐漸衰退，而吸收峰強(qiáng)度隨之降低。此活性衰退現(xiàn)象比未接上粒子的hrp衰退速度還快。以上粒子皆為fept磁性奈米粒子六、參考文獻(xiàn)1.何建新，國(guó)立清華大學(xué)材料科學(xué)工程研究所碩士論文，2004。2.王正文，私立東海大學(xué)化學(xué)工程研究所碩士論文，2007。3.j. wang et al, chem. matter., 19, 2566-2572, 2007.4.s. b. et al, appl. phys. letters, 89, 252503, 2006.5.w.