藥物化學(xué)chap6b_TOCSYNOESY

1、TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝全相關(guān)譜TOCSY(total correlation spectroscopy)也稱HOHAHA (homonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy)，可以提供整個自旋體系的信息。 TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝TOCSYPositive and absorptive diagonal & cross peaks for Z-filtered anisotropic TOCSYMLEV-17Spin LockProduct Operator:TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝 在TOC

2、SY中用的混合脈沖有很多種類，如WALTZ-16,MLEV-17,DIPSI-2,DIPSI-3等，不同的isotropic mixing sequence的效率不同，適合的譜寬也不同。 在混合脈沖期間還有ROE效應(yīng)，因此有的TOCSY序列中的混合脈沖包括一定的間隔，在無脈沖的間隔中沒有ROE效應(yīng)，但有NOE效應(yīng)，由于蛋白質(zhì)等大分子有ROE2NOE，這樣適當(dāng)選取間隔長度，可使二者基本抵銷。這種TOCSY序列稱為Clean-TOCSY。 TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝C 實驗及處理同相譜與COSY等反相譜不同，間接維的點數(shù)不必很大，一般512點足夠。 混合時間的選擇與要求的傳遞距離有關(guān)，傳

3、遞距離越長，需要的時間越長，一般短的可取20-30ms，長的可取100ms左右。要注意：混合脈沖所用的功率不能太大，尤其混合時間較長的。否則可能損壞放大器及探頭，另外混合脈沖產(chǎn)生的熱量將使樣品發(fā)熱，使得TOCSY的峰位同其他譜相比發(fā)生位移。由于TOCSY是同相譜，一般用相移6090度的正弦窗函數(shù)。 TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝TOCSY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝D 應(yīng)用TOCSY可提供整個自旋體系的連接，而且信號強(qiáng)，對于譜峰證認(rèn)很有用。 TOCSY-wagergate生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝預(yù)飽和， 低功率選擇性90脈沖（對準(zhǔn)水峰）TOCSY-doublewagergate生物大分子

4、波譜學(xué)原理吳季輝d1恢復(fù)前梯度脈沖清除殘留磁化，兩個WATERGATE以改善基線TOCSY-enhance mode生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝180度脈沖第六章第六章 同核核磁實驗方法同核核磁實驗方法 COSY型實驗 多量子譜 TOCSYNOESY ROESY 生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝Selection of NOESY and ROESY 1000 3000 NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESYMixing time: 80% of T1 11221121112111121coscoscoscostItItItIIIyx IzNOEzx Iyx

5、 Iyx Iz NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝C 實驗及處理 同TOCSY類似，間接維的點數(shù)不必很大，但考慮到NOESY積分的要求，最好稍為大一些，一般取512800點。累加次數(shù)也要大一些，以獲得信噪比較好的譜。 混合時間的選擇很重要，從上述傳遞效率的關(guān)系式可知，在一定范圍內(nèi)，混合時間小，交叉峰弱，混合時間越長，交叉峰越強(qiáng)。混合時間長到一定程度，交叉峰反而變?nèi)酰Q為出現(xiàn)了自旋擴(kuò)散。只有在前者情況下（initial rate regime），交叉峰強(qiáng)度才與混合時間以及兩核間的交叉弛豫

6、速率成正比，即此時的交叉峰強(qiáng)度與兩核間的距離的6次方成反比，這里假定適用各向同性的運(yùn)動翻滾模型。 一般由NOESY計算距離約束有兩類方法：一種用已知距離的交叉峰積分為基準(zhǔn)，根據(jù)交叉峰強(qiáng)度與兩核間的距離的6次方成反比的性質(zhì)，來推算其他交叉峰對應(yīng)的距離，這時混合時間應(yīng)該在initial rate regime范圍內(nèi)，以免自旋擴(kuò)散的影響；另一類直接利用交叉峰強(qiáng)度與弛豫矩陣的指數(shù)的關(guān)系，通過所謂的完全弛豫矩陣迭代來計算弛豫速率以及對應(yīng)的空間距離，這時混合時間可以長一些，因為自旋擴(kuò)散的影響已經(jīng)包括在弛豫矩陣的指數(shù)函數(shù)中。一般在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計算中常用第一種方法，而在核酸結(jié)構(gòu)計算中常用第二種方法。 通常小蛋白

7、質(zhì)的NOESY的混合時間可以取得相對大一些，大蛋白質(zhì)運(yùn)動慢，更容易產(chǎn)生自旋擴(kuò)散，最大可取到100多ms。NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝零量子峰的強(qiáng)度受混合時間的余弦調(diào)制，所以混合時間大，交叉峰強(qiáng)時，零量子峰的干擾就小，因此一般盡可能取大一些的混合時間?；旌蠒r間小時，應(yīng)當(dāng)采取一定措施抑制零量子峰，有若干不同的方案，基本上均利用零量子峰的強(qiáng)度受混合時間的余弦調(diào)制這個性質(zhì)。如混合時間在一定范圍內(nèi)變化，累加所有結(jié)果；或者在m期間插入一個180度脈沖，此時縱向磁化僅僅變號，而零量子項的有效進(jìn)動時間與180度脈沖的位置有關(guān)，若180度脈沖的位置隨t1隨機(jī)變化，也可抑制零量子峰。由于NOESY是同相譜

8、，一般用相移6090度的正弦窗函數(shù)。 NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝D 應(yīng)用及其他原則上，距離小于5埃的兩個氫核都能產(chǎn)生可觀測的NOE交叉峰。NOESY既用于序列證認(rèn)，也用于獲得距離約束。水峰預(yù)飽和往往抑制水峰附近的信號，也使相關(guān)的交叉峰強(qiáng)度變化，這時可采用其他手段，如jump-and-return，或用WATERGATE梯度場脈沖作為觀測序列。 NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝NOESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝第六章第六章 同核核磁實驗方法同核核磁實驗方法 COSY型實驗 多量子譜 TOCSYNOESY ROESY 生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝R

9、OESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝由于實驗室坐標(biāo)系中的交叉弛豫速率在小分子為正，在大分子為負(fù)，在中間大小的分子如小肽接近零，因此小肽的NOE交叉峰非常弱乃至消失。在這種情況下要得到殘基間的關(guān)聯(lián)信息可以利用ROESY實驗。ROESY實驗檢測旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的交叉弛豫速率，同NOE不同，ROE在所有相關(guān)時間下均為正，因此即使NOE峰消失，ROE峰仍能產(chǎn)生。 ROESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝ROESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝ROESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝ROESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝ROESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝C 實驗及處理由于自旋鎖定期間會產(chǎn)生TOCSY型的信號傳遞，射頻場功

10、率要相當(dāng)?shù)?，一般?-5kHz，一方面為了抑制TOCSY型峰，另一方面為了避免樣品發(fā)熱及保護(hù)儀器，因為ROESY混合時間較TOCSY長。同NOESY相比，混合時間可以短一些，因ROE速率為NOE速率的二倍。采樣點數(shù)及適用的窗函數(shù)等與NOESY類似。 ROESY生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝D 應(yīng)用主要用于分子量較小的多肽，較大蛋白質(zhì)的其他研究也可用ROESY，因自旋擴(kuò)散對ROESY的影響相對小一些，此外在ROESY中交叉弛豫產(chǎn)生的交叉峰為負(fù)峰，而化學(xué)交換產(chǎn)生的交叉峰呈正峰，因而可用于相關(guān)的研究，其他一些類似的旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的核磁實驗可用于研究蛋白質(zhì)分子的整體運(yùn)動。但在定量上，這類實驗受頻偏及其他因素

11、的影響較大。 同核相關(guān)譜譜形總結(jié)同核相關(guān)譜譜形總結(jié)生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝 以下列出本節(jié)討論過的所有 (AX體系) 同核化學(xué)位移相關(guān)譜的譜形。雖然每組共振峰都有4個峰，但往往只有在DQF-COSY譜中能看到4個峰。對于本節(jié)已討論過的其它幾個2D譜，如幅度COSY，TOCSY，NOESY和ROESY，由于分辯率較低，這4個共振峰往往合并成一個峰。幅度COSY由于是幅度譜，因而是純吸收的正峰，不過其共振峰較相敏譜的來得粗一些，不能調(diào)相。 同核相關(guān)譜譜形總結(jié)同核相關(guān)譜譜形總結(jié)生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝幅度COSY由于是幅度譜，因而是純吸收的正峰，不過其共振峰較相敏譜的來得粗一些，不能調(diào)相。 對于相

12、敏COSY和DQF-COSY，由于是通過反相分量產(chǎn)生相干轉(zhuǎn)移而建立起核與核之間的聯(lián)系 (由交叉峰表現(xiàn))的，因此其交叉峰是正、負(fù)交替的。 對于由反相分量而建立起的聯(lián)系的譜，如幅度COSY，相敏COSY，DQF-COSY都是用正弦鐘窗函數(shù)進(jìn)行處理，以便加強(qiáng)交叉峰，削弱對角峰。 同核相關(guān)譜譜形總結(jié)同核相關(guān)譜譜形總結(jié)生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝 對于TOCSY，NOESY和ROESY由于是通過同相分量而建立起核與核之間的聯(lián)系的，因此其交叉峰是同相的。 對于由同相分量而建立起聯(lián)系的譜，如TOCSY，NOESY和ROESY都用余弦窗函數(shù)進(jìn)行處理，以便加強(qiáng)交叉峰而削弱對角峰。 同核相關(guān)譜實驗設(shè)置同核相關(guān)譜實驗

13、設(shè)置 生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝同核相關(guān)實驗的設(shè)置如下：幅度COSY：采集256個FID, 零填充后譜由1K1K個實數(shù)點組成；相敏COSY：采集512個FID, 零填充后譜由2K2K個實數(shù)點組成；DQF-COSY：采集512個FID, 零填充后譜由2K2K個實數(shù)點組成；TOCSY : 采集256個FID, 零填充后譜由1K1K個實數(shù)點組成，=15ms75ms；NOESY ：采集256個FID, 零填充后譜由1K1K個實數(shù)點組成, =150ms250ms； ROESY ：采集256個FID, 零填充后譜由1K1K個實數(shù)點組成，=150ms250ms； 以上數(shù)據(jù)適合于分子量小于10000的分子的實

14、驗。從中可看出，由于相敏COSY和DQF-COSY的交叉峰是反相的，為了防止正負(fù)對消，因而所用數(shù)據(jù)集較大。 同核相關(guān)譜實驗設(shè)置同核相關(guān)譜實驗設(shè)置 生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝 在進(jìn)行這些2D實驗時，接收機(jī)的增益 (receiver gain) 的設(shè)置值得注意。對于這三種COSY實驗（幅度COSY，相敏COSY，DQF-COSY），由于它們的FID信號是調(diào)制的。因次，前面的一些FID的信號會很弱，第一個FID（t1=0）的信號強(qiáng)度為零。但會逐步增強(qiáng)。所以接收機(jī)增益的設(shè)置不能由前面的FID來確定，而只能由后面的FID來確定，否則會由于接收機(jī)增益太大而導(dǎo)致出現(xiàn)許多假峰。但對于TOCSY，NOESY和R

15、OESY實驗，由于它們的FID是調(diào)制的，因此第一個FID具有最強(qiáng)的信號強(qiáng)度。于是這三個實驗的增益可由它們的第一個FID的強(qiáng)度來確定。 同核相關(guān)譜實驗設(shè)置同核相關(guān)譜實驗設(shè)置 生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝 在實驗中，NH-H交叉峰有可能缺失，導(dǎo)致NH-H交叉峰缺失的原因和相應(yīng)的解決方法如下： 1. 由于水峰的飽和導(dǎo)致水峰附近的H共振峰的飽和或部分飽和而引起NH-H交叉峰缺失。這時可升高或降低溫度10C, 這時水峰移動顯著，而H共振峰基本上不變； 2. 由于NH與H2O存在交換，當(dāng)水峰飽和時，導(dǎo)致NH共振峰部分飽和因而其強(qiáng)度下降。這可通過改變壓水峰方法 (如改用或等)，降低溫度和pH使交換變慢而避免； 3. 由于小的NH-H耦合常數(shù)或大的線寬導(dǎo)致的反相信號的對消而導(dǎo)致的交叉峰缺失。這可通過降低樣品的粘度 (如降低樣品濃度或升高溫度) 而減小線寬。 同核三維譜 生物大分子波譜學(xué)原理吳季輝從二維譜到三維譜的擴(kuò)展是很自然的，因其有助于擁