高效液相色譜法簡介課件

1、高效液相色譜法簡介 “色譜”一詞是由俄國科學(xué)家斯威特提出的。色譜法是基于補(bǔ)充物質(zhì)在相對運(yùn)動物的兩相之間分布時(shí)，物理或物理化學(xué)性質(zhì)的微小的差異而使混合物相互分離的一類分離或分析方法。發(fā)展與上世紀(jì)初，飛速發(fā)展于五十年代，有超過30位科學(xué)家家因?yàn)樗@得諾貝爾獎(jiǎng)，其有自己的理論和研究方法，同時(shí)也有眾多的應(yīng)用領(lǐng)域。色譜法常見的方法有：柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。柱色譜：柱色譜法是最原始的色譜方法，這種方法將固定相注入下端塞有棉花或?yàn)V紙的玻璃管中，將被樣品飽和的固定相粉末攤鋪在玻璃管頂端，以流動相洗脫。常見的洗脫方式有兩種，一種是自上而下依靠溶劑本身的重力洗脫，一種是自下而上依靠

2、毛細(xì)作用洗脫。收集分離后的純凈組分也有兩種不同的方法，一種方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一種方法是烘干固定相后用機(jī)械方法分開各個(gè)色帶，以合適的溶劑浸泡固定相提取組分分子。柱色譜法被廣泛應(yīng)用于混合物的分離，包括對有機(jī)合成產(chǎn)物、天然提取物以及生物大分子的分離。薄層色譜：薄層色譜法是應(yīng)用非常廣泛的色譜方法，這種色譜方法將固定相圖布在金屬或玻璃薄板上形成薄層，用毛細(xì)管、鋼筆或者其他工具將樣品點(diǎn)染于薄板一端，之后將點(diǎn)樣端浸入流動相中，依靠毛細(xì)作用令流動相溶劑沿薄板上行展開樣品。薄層色譜法成本低廉操作簡單，被用于對樣品的粗測、對有機(jī)合成反應(yīng)進(jìn)程的檢測等用途。 氣相色譜：GC主要是利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及

3、吸附性質(zhì)的差異來實(shí)現(xiàn)混合物的分離。待分析樣品在汽化室汽化后被惰性氣體（即載氣，也叫流動相）帶入色譜柱，柱內(nèi)含有液體或固體流動相，由于樣品中各組分的沸點(diǎn)、極性或吸附性能不同，每種組分都傾向于在流動相和固定相之間形成分配或吸附平衡。但由于載氣是流動的，這種平衡實(shí)際上很難建立起來。也正是由于載氣的流動，使樣品組分在運(yùn)動中進(jìn)行反復(fù)多次的分配或吸附/解吸附，結(jié)果是在載氣中濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出。當(dāng)組分流出色譜柱后，立即進(jìn)入檢測器。檢測器能夠?qū)悠方M分的與否轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺娦盘柕拇笮∨c被測組分的量或濃度成正比。當(dāng)將這些信號放大并記錄下來時(shí)，就是氣相色譜圖了。氣相色譜

4、被廣泛應(yīng)用于小分子量復(fù)雜組分物質(zhì)的定量分析。 高效液相色譜：高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9-107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。高效液相色譜（HPLC）是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣

5、便利切換嚴(yán)密；由于液體流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性的分析的各個(gè)領(lǐng)域。 高效液相色譜法分為：液-固色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法。 液-固色譜法（液-固吸附色譜法）固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分配的。液-固色譜法的作用機(jī)制吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，其表面常存在分散的吸附中心點(diǎn)。流動相中的溶質(zhì)分子X（液相）被流動相S帶入色譜柱后，在隨載液流動的過-程中，發(fā)生如下交換反應(yīng)：X（液相）+nS（吸附）X（吸附）+nS（液相）其作用機(jī)制是溶質(zhì)分子X

6、（液相）和溶劑分子S（液相）對吸附劑活性表面的競爭吸附。吸附反應(yīng)的平衡常數(shù)K為：K值較?。喝軇┓肿游搅軓?qiáng)，被吸附的溶質(zhì)分子很少，先流出色譜柱。K值較大：表示該組分分子的吸附能力較強(qiáng)，后流出色譜柱。發(fā)生在吸附劑表面上的吸附解吸平衡，就是液-固色譜分離的基礎(chǔ)。液-固色譜法的吸附劑和流動相常用的液-固色譜吸附劑：薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。一般規(guī)律：對于固定相而言，非極性分子與極性吸附劑（如硅膠、氧化銅）之間的作用力很弱，分配比k較小，保留時(shí)間較短；但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強(qiáng)，分配比k大，保留時(shí)間長。對流動相的基本要求：試樣要能夠溶于流動

7、相中流動相粘度較小流動相不能影響試樣的檢測常用的流動相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 液固色譜法的應(yīng)用常用于分離極性不同的化合物、含有不同類型或不；數(shù)量官能團(tuán)的有機(jī)化合物，以及有機(jī)化合物的不同的異構(gòu)體；但液固色譜法不宜用于分離同系物，因?yàn)橐?固色譜對不同相對分子質(zhì)量的同系物選擇性不高。 液-液色譜法（液-液分配色譜法）將液體固定液涂漬在擔(dān)體上作為固定相。液-液色譜法的作用機(jī)制溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時(shí)，在固定液中溶解度較小的組分較難進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定液中溶解度較大的組分容易進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。液-液色譜法與液液萃取法的

8、基本原理相同，均服從分配定律：K=C固/C液K值大的組分，保留時(shí)間長，后流出色譜柱。正相色譜和反相色譜正相分配色譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑（如苯、正己烷等）作流動相。反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑（如水、甲醇、己腈等）作流動相。一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。液-液色譜法的固定相常用的固定液為有機(jī)液體，如極性的，氧二丙腈（ODPN），非極性的十八烷（ODS）和異二十烷（SQ）等。缺點(diǎn)：涂漬固定液容易被流動相沖掉。采用化學(xué)鍵合固定相則可以避免上述缺點(diǎn)

9、。使固定濃與擔(dān)體之間形成化學(xué)鍵，例如在硅膠表面利用硅烷化反應(yīng)：形成Si-O-Si-C型鍵，把固定液的分子結(jié)合到擔(dān)體表面上。優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質(zhì)速度快，無固定液的流失。固定液上可以結(jié)合不同的官能團(tuán)，改善分離效能。固定液不會溶于流動相，有利于進(jìn)行梯度洗提。液-液色譜法的應(yīng)用液-液色譜法既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物，如烷烴、烯烴、芳烴、稠環(huán)、染料、留族等化合物?；衔镏腥〈臄?shù)目或性質(zhì)不同，或化合物的相對分子質(zhì)量不同，均可以用液-液色譜進(jìn)行分離。 離子交換色譜法原理：離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進(jìn)行可逆交換，由于被測

10、離子在交換劑上具有不同的親和力（作用力）而被分離。離子交換色譜法的作用機(jī)制聚合物的分子骨架上連接著活性基團(tuán)，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。為了保持離子交換樹脂的電中性，活性基團(tuán)上帶有電荷數(shù)相同但正、負(fù)號相反的離子X，稱為反離子。活性基團(tuán)上的反離子可以與流動相中具有相同電荷的被測離子發(fā)生交換：離子交換色譜的分配過程是交換與洗脫過程。交換達(dá)到平衡時(shí)： K值越大，保留時(shí)間越長。溶劑和固定相兩種類型：多孔性樹脂與薄殼型樹脂。多孔性樹脂：極小的球型離子交換樹脂，能分離復(fù)雜樣品，進(jìn)樣量較大；缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度不高，不能耐受壓力。 薄殼型離子交換樹脂：在玻璃微球上涂以薄層的離子交換樹脂，這種樹脂柱效高，

11、當(dāng)流動相成分發(fā)生變化時(shí)，不會膨脹或壓縮；缺點(diǎn)是但柱子容量小，進(jìn)樣量不宜太多。離子交換色譜法的應(yīng)用主要用來分離離子或可離解的化合物，凡是在流動相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離。廣泛地應(yīng)用于：無機(jī)離子、有機(jī)化合物和生物物質(zhì)(如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等)的分離。凝膚色譜法（空間排阻色譜法）凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔隙，能被流動相浸潤，吸附性很小。凝膠色譜法的分離機(jī)制是根據(jù)分子的體積大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。凝膠色譜法的作用機(jī)制體積大于凝膠孔隙的分子，由于不能進(jìn)入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱；小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受阻，然后又從孔隙中

12、出來隨載液流動，后流出色譜柱；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進(jìn)行分離的一種色譜分析方法。凝膠色譜法的固定相軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝膠三種。凝膠色譜法的應(yīng)用特點(diǎn)保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分子質(zhì)量大的化合物，相對分子質(zhì)量在4008105的任何類型的化合物。保留時(shí)間短，色譜峰窄，容易檢測。固定相與溶質(zhì)分子間的作用力極弱，趁于零，柱的壽命長。不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上時(shí)才能得到分離。 高效液相色譜法在食品分析中的應(yīng)用乳品分析中的應(yīng)用 乳及乳制品的質(zhì)量評價(jià)比較復(fù)雜，包括營養(yǎng)

13、成分及含量、乳品的風(fēng)味物質(zhì)、藥物殘留和毒物種類及含量等多個(gè)方面，HPLC 法可用于乳品中多種質(zhì)量控制指標(biāo)的檢測。乳及乳制品中富含糖、脂、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)以及強(qiáng)化的營養(yǎng)物質(zhì)，HPLC 技術(shù)幾乎可用于各種營養(yǎng)成分的檢測。在低分子糖類的測定中多采用氨基鍵合柱、糖類分析專用柱進(jìn)行分離，也有研究者利用低成本非特定色譜柱測定低分子糖，如Mullin 等通過樹脂柱分離，脈沖安培檢測器測定奶酪和牛奶中的乳糖等并取得良好的效果。在氨基酸的檢測中，苗紅等利用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸脂柱前衍生氨基酸，Nova-Pak C18 色譜柱，乙腈磷酸緩沖液梯度洗脫，紫外UV248 nm 測，可同時(shí)準(zhǔn)確測

14、定奶粉中Lys、Met、Asp等16 種氨基酸。丁暉等用YWG C18 色譜柱，甲醇乙酸胺為流動相，紫外檢測器230 nm 處測定了AD 奶和活性乳中的山梨酸和苯甲酸含量。張春燕等 采用ORH-801 型有機(jī)酸專用色譜柱，以濃度0.01 mol/L 硫酸溶液為流動相，用折光檢測器對全脂奶粉和酸奶中乳酸與乳酸鹽進(jìn)行測定，最低檢測限可達(dá)1.5310-10 kg。隨著分離柱的不斷改進(jìn)高靈敏度的檢測儀器的引入，HPLC 法已深入到乳品分析中的方方面面。相信在不久的將來HPLC 法將在乳品工業(yè)中發(fā)揮更大的作用。 在肉制品分析中的應(yīng)用 HPLC 法可以測定肉制品中的獸藥殘留、致癌物質(zhì)含量等。腌臘品中常添加

15、硝酸鹽或亞硝酸鹽作發(fā)色劑用，由于添加量過大或自身的還原作用在肉品中生成N-亞硝胺。N-亞硝胺可誘發(fā)肝癌、結(jié)腸癌等。過去采用氣相色譜法測定食物中揮發(fā)性亞硝胺，其中僅色譜測定一步便需耗時(shí)1 h 之多，而采用高效液相色譜法則只需要13 min 左右。張輝應(yīng)用島津LC-4A 高效液相色譜儀測定肉類抗生素殘留量，對色譜分離實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括色譜柱、流動相配比、緩沖液、pH、溫度、檢測波長等，進(jìn)行了系統(tǒng)的試驗(yàn)，使肉類食品中的四環(huán)素、土霉素和金霉素能夠同時(shí)分離和定量測定。喬坤云建立了用HLPC 測定雞肝中土霉素金霉素、四環(huán)素方法。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院趙思俊等通過研究建立了同時(shí)檢測動物肌肉組織中環(huán)丙沙星、單諾沙

16、星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸、氟甲喹7種喹諾酮類藥物的HPLC-FLD 檢測方法。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院張素梅等建立了牛肉中替米考星殘留的HPLC 檢測方法,結(jié)果可靠。 在其它食品分析中的應(yīng)用 HPLC 可以廣泛地用于檢測食品的農(nóng)藥殘留，食品中過量的食品添加劑，食品中違禁成分；也可用于食品中營養(yǎng)成分的分析。沈向紅等建立了用HPLC 測定保健食品中人參皂甙的方法。彭錦峰建立了用高效液相色譜測定食用香菇中甲醛的方法。許龍福建立了用HPLC 同時(shí)測定飲料中對羥基苯甲酸乙(丙) 酯及咖液相色譜檢測方法。葉賽等應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海水中的氯霉素殘留量, 流動相為V（甲醇）V（水）=8020。樊金玲等利用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了牡丹花中的花色苷類化合物，分離檢測了5 種花色苷，結(jié)合紫外吸收光譜和質(zhì)譜信息分別確定了具體類型。廣東省深圳市疾病預(yù)防控制中心仲岳桐等建立了應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定蛋類食品及蛋制品中的蘇丹紅四號的方法，測定結(jié)果準(zhǔn)確。國家大豆深加工技術(shù)研究推廣中心李丹等利用高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜聯(lián)機(jī)技術(shù)準(zhǔn)確的分析了黑豆中異黃酮的種類和含量。HPLC 可測定氨基甲酸酯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥、百草枯、殺草快、草甘膦及氨基膦酸、苯并咪唑類殺菌劑、利谷隆(linuron)、滅草隆(monuron)及敵草隆(diuron)、三嗪類農(nóng)藥等。苯并咪唑類殺菌劑殘留