藥物分析(第六章)

1、第六章 芳酸類藥物的分析學(xué)習(xí)目標(biāo) 掌握水楊酸、苯甲酸類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)與分析方法間的關(guān)系；鑒別與含量測(cè)定的方法；特殊雜質(zhì)的檢驗(yàn)方法與雜質(zhì)限量計(jì)算；兩步滴定法和雙相測(cè)定法的原理。熟悉紫外分光光度法、高效液相色譜法在芳酸類藥物中的應(yīng)用。了解其他芳酸類藥物的分析。第六章 芳酸類藥物的分析本章目錄本章目錄 第一節(jié) 第二節(jié) 第六章 芳酸類藥物的分析 羧基直接與芳香環(huán)相連的化合物稱芳酸。芳酸及其酯類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是： 結(jié)構(gòu)中有羧基、酯鍵和苯環(huán)； 有些藥物有酚羥基、芳伯氨基 第六章 芳酸類藥物的分析第一節(jié) 水楊酸類藥物分析水楊酸類藥物水楊酸類藥物結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)鑒 別檢 查含量測(cè)定 第六章 芳酸類藥物分析藥物結(jié)構(gòu)理

2、化性質(zhì)與分析方法在乙醇中易溶，在水中溶解度小，多以醇為溶劑分析；具羧基，呈酸性； 含酯鍵，不穩(wěn)定，易水解 ；水解后生成游離的酚羥基，可與鐵離子發(fā)生呈色反應(yīng) 有苯環(huán)，在紫外光區(qū)有吸收 COOHOCOCH3阿司匹林結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的關(guān)系 第六章 芳酸類藥物分析COOHOH酸性：用于定性、定量反應(yīng)酚羥基：FeCl3呈色反應(yīng)苯環(huán)：紫外吸收水楊酸 第六章 芳酸類藥物分析COONaOHNH2芳酸堿金屬鹽：水溶性大，顯弱堿性酚羥基，有何性質(zhì)？芳伯氨基：重氮化偶合反應(yīng)苯環(huán)有何性質(zhì)?對(duì)氨基水楊酸鈉 第六章 芳酸類藥物分析COOOCOCH3NHCOCH3酯鍵：水解，可生成酚羥基和醋酸酯鍵：水解，可生成酚羥基和羧基酰

3、胺鍵：水解，可生成芳伯氨基苯環(huán)苯環(huán)貝諾酯返返 回回 第六章 芳酸類藥物分析一、鑒別試驗(yàn)1.三氯化鐵反應(yīng) 含酚羥基結(jié)構(gòu)的藥物在中性或弱酸性條件下，可與Fe3 反應(yīng)，形成有色配位化合物。（1） 水楊酸：加三氯化鐵試液1滴，即呈紫色。（2） 阿司匹林：加入氫氧化鈉試液，煮沸水解后，放冷，加 FeCl3試液1滴，呈紫堇色。（3）貝諾酯：加入氫氧化鈉試液，煮沸，放冷，濾液調(diào)成微 酸性，加三氯化鐵試液2滴，呈紫堇色。 第六章 芳酸類藥物分析COOHOHCOOOFe中性或微酸性+ 4FeCl323Fe + 2HCl反應(yīng)式如下：貝諾酯和阿司匹林需水解，生成水楊酸，才能發(fā)生該反應(yīng) （紫堇色） 第六章 芳酸類藥物

4、分析2.重氮化偶合反應(yīng) 貝諾酯由阿司匹林和對(duì)乙酰氨基酚酯化而成。在酸性條件下加熱水解，生成對(duì)氨基酚，呈芳香第一胺反應(yīng)。 供試品稀鹽酸，煮沸，放冷，濾過(guò)濾液猩紅色亞硝酸鈉、堿性-萘酚 第六章 芳酸類藥物分析HClCOOOCOCH3+H2OCOOHOHOHNH2+ 2CH3COOHOHOHNNHOOHNH2NOH+ NaNO2HClNCl, OH 第六章 芳酸類藥物分析3.3.紫外吸收光譜法紫外吸收光譜法 貝諾酯溶液，在240nm 的波長(zhǎng)處有最大吸收，按干燥品計(jì)算，吸收系數(shù)（ ）為 730 760 。 4.4.紅外吸收光譜法紅外吸收光譜法 水楊酸、阿司匹林、貝諾酯、對(duì)氨基水楊酸鈉均采用紅外吸收光譜

5、法，供試品的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜一致。 對(duì)氨基水楊酸鈉水溶液還可呈鈉鹽鑒別反應(yīng)。%1cm1EIR：阿司匹林-COOH-COOHPh-C鄰位取代PhN-HO-HN-HPh:C=C芳胺酚 第六章 芳酸類藥物分析二、雜質(zhì)檢查（一）阿司匹林的雜質(zhì)檢查 阿司匹林原料主要控制的特殊雜質(zhì)有“溶液的澄清度”“水楊酸”“易炭化物” 第六章 芳酸類藥物分析1.溶液的澄清度 本項(xiàng)目主要檢查碳酸鈉試液中不溶性雜質(zhì)。這些雜質(zhì)是未反應(yīng)的酚類、或副反應(yīng)產(chǎn)生的無(wú)游離羧基的醋酸苯酯、水楊酸苯酯和乙酰水楊酸苯酯等。阿司匹林有羧基，溶解于碳酸鈉試液。OCOCH3OHCOOOCOCH3COO醋酸苯酯 水楊酸苯酯 乙酰水楊酸苯

6、酯 第六章 芳酸類藥物分析2.游離水楊酸 水楊酸可由合成過(guò)程中乙?；煌耆虬⑺酒チ衷谫A藏過(guò)程中水解產(chǎn)生。水楊酸對(duì)人體有毒，并有刺激性，其進(jìn)一步氧化產(chǎn)物使藥物變色，影響藥物的質(zhì)量。故應(yīng)嚴(yán)格控制阿司匹林中的水楊酸。 中國(guó)藥典（2010）采用高效液相法測(cè)定。 第六章 芳酸類藥物分析【實(shí)例分析實(shí)例分析】阿司匹林中游離水楊酸檢查阿司匹林中游離水楊酸檢查游離水楊酸 照高效液相色譜法（附錄 D）測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為303nm。理論板數(shù)按水楊酸峰計(jì)算不低于5000，阿司匹林主峰與水楊酸主峰分離度

7、應(yīng)符合要求。供試品溶液的制備 取本品約100mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加1%冰醋酸甲醇溶液適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（臨用前新配）。對(duì)照品溶液的制備 取水楊酸對(duì)照品約10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加1%冰醋酸甲醇溶液適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置50ml量瓶中，用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法 立即精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如顯水楊酸色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中水楊酸含量，含水楊酸不得過(guò)0.1%。 第六章 芳酸類藥物分析 原則上，制劑不必重復(fù)檢查原料藥

8、項(xiàng)下檢查的雜質(zhì)，但在制劑制備或制劑貯存過(guò)程中，有可能再引入的雜質(zhì)，應(yīng)檢查控制。 阿司匹林片在制備或貯存過(guò)程中，因酯鍵易水解，而生成水楊酸，故阿司匹林片劑、栓劑均要檢查水楊酸。 第六章 芳酸類藥物分析3.易炭化物 本項(xiàng)目檢查被硫酸碳化而呈色的低分子有機(jī)雜質(zhì) 第六章 芳酸類藥物分析(4)有關(guān)物質(zhì) 照高效液相色譜法（附錄 D）測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm。阿司匹林峰的保留時(shí)間約為8分鐘，理論板數(shù)按阿司匹林峰計(jì)算不低于5000，阿司匹林峰與水楊酸

9、峰分離度應(yīng)符合要求。時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相A（%） 流動(dòng)相B（%）0.0100060.02080 第六章 芳酸類藥物分析測(cè)定法 取本品約0.1g，精密稱定，置10ml量瓶中，加1%冰醋酸甲醇溶液適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；精密量取供試品溶液1ml，置200ml量瓶中，用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照溶液；精密量取對(duì)照溶液10ml，置100ml量瓶中，用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得靈敏度試驗(yàn)溶液。分別精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液、靈敏度試驗(yàn)溶液及水楊酸檢查項(xiàng)下的水楊酸對(duì)照品溶液各10l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，除小

10、于靈敏度試驗(yàn)溶液中阿司匹林主峰面積的單個(gè)雜質(zhì)峰、溶劑峰及水楊酸峰不計(jì)外，其余各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰峰面積（0.5%）。 第六章 芳酸類藥物分析（二）對(duì)氨基水楊酸鈉中間氨基酚的檢查 間氨基酚易被氧化，氧化產(chǎn)物導(dǎo)致藥物變色，并且對(duì)人體有毒性作用，應(yīng)嚴(yán)格控制其限量 間氨基酚引入的途徑有二：一是未反應(yīng)完全的原料；二是對(duì)氨基水楊酸鈉遇熱或日光照射脫羧 第六章 芳酸類藥物分析 【檢查】 有關(guān)物質(zhì) 避光操作。取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1ml中含0.7mg 的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液A。另

11、取間氨基酚對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含1.2g的溶液，作為對(duì)照品溶液B。照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm測(cè)定，理論板數(shù)按對(duì)氨基水楊酸鈉峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，對(duì)氨基水楊酸鈉峰與雜質(zhì)峰之間的分離度應(yīng)符合要求。取對(duì)照溶液A 20l，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使對(duì)氨基水楊酸鈉色譜峰的峰高為滿量程的2025。另精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液A與對(duì)照品溶液B各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3.5倍。供試品溶液的色譜圖中如有與間氨基酚峰保留時(shí)間一致的峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其含量不得過(guò)0.25%，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液A主峰

12、面積的1/10（0.1%），其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液A主峰面積（1.0%）。 一、酸堿滴定法(Acid-base titration method)苯甲酸苯甲酸pKa 4.20水楊酸水楊酸pKa 2.98酸性較強(qiáng)酸性較強(qiáng)COHOHO羧酸鄰位羧酸鄰位-OH-OH，吸電子基團(tuán)，使酸性增加；，吸電子基團(tuán)，使酸性增加；分子內(nèi)氫鍵，更增加了其極性分子內(nèi)氫鍵，更增加了其極性直接滴定Aspirin、丙磺舒丙磺舒(Ch.P. BP. JP等等) 苯甲酸苯甲酸(Ch.P等等)均均可采用本法可采用本法1.直接滴定法直接滴定法中性乙醇COOHOCOCH3NaOH20以下COONaOCOCH3H2O乙醇乙

13、醇作用：溶解作用：溶解ASAASA；防止；防止ASAASA在水溶在水溶 液中滴定過(guò)程易水解液中滴定過(guò)程易水解中性乙醇：中性乙醇：對(duì)指示劑對(duì)指示劑( (酚酞酚酞) )而言為中性，而言為中性， 可消除滴定誤差可消除滴定誤差 pKa 36 的藥物溶于中性醇的藥物溶于中性醇,可可直接用直接用NaOH滴定滴定 pKa 69 的藥物要用的藥物要用非水溶液滴定法非水溶液滴定法2.水解后剩余滴定法水解后剩余滴定法( (Residual titration after hydrolysis) )OCOCH3COOH2NaOHH2OOHCOONaCH3COONa2NaOH H2SO4 Na2SO4 2H2O取本品

14、約1.5g，精密稱定，準(zhǔn)確加NaOH液(0.5mol/L)50.0ml，緩緩煮沸10min，放冷，以酚酞為指示劑，用H2SO4液(0.25mol/L)滴定剩余的NaOH，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的NaOH液(0.5ml/L)相當(dāng)于45.04mg的C9H9O4USP32-NF27含量% = ( V0-V) FTW 100%T = 0.5 12180.16 = 45.04 (mg/ml)滴定度滴定度滴定度滴定度濃度濃度待測(cè)物反應(yīng)待測(cè)物反應(yīng)系數(shù)系數(shù)滴定液物反滴定液物反應(yīng)系數(shù)應(yīng)系數(shù)滴定液物摩滴定液物摩而質(zhì)量而質(zhì)量空白反應(yīng)體空白反應(yīng)體積積樣品測(cè)定消樣品測(cè)定消耗體積耗體積樣品稱重量樣品稱重量3

15、.兩步滴定法兩步滴定法( (Two-step titration) )Aspirin片HOCCOOHCH2COOHCH2COOH枸櫞酸枸櫞酸Citric acidHOCHCOOHCHCOOHHO酒石酸酒石酸Trataric acid水解產(chǎn)物水解產(chǎn)物水楊酸水楊酸SAHAc第一步第一步：NaOH滴定所有的酸：ASA，CA，TA，SA，HAc第二步：第二步：水解后剩余滴定取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于阿司匹林0.3g)，置錐形瓶中，加中性乙醇(對(duì)酚酞指示劑顯中性)20ml，振搖使ASA溶解，加酚酞指示液3滴，滴加NaOH液(0.1mol/L)至顯粉紅色，再精密加NaOH液(0.

16、1mol/L)40ml，置水浴上加熱15min，并時(shí)時(shí)振搖，迅速放冷至室溫，用H2SO4液(0.05mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每每1ml1ml的的NaOHNaOH液液(0.1mol/L)(0.1mol/L)相當(dāng)于相當(dāng)于18.02mg18.02mg的的C C9 9H H8 8OO4 4COONaOCOCH3NaOHCOONaOHNaAc H2O2NaOH H2SO4 Na2SO4 2H2O標(biāo)示量%=WW標(biāo)示量100%(V0-V)FT空白空白消耗消耗樣測(cè)樣測(cè)消耗消耗校正校正因數(shù)因數(shù)滴定滴定度度片劑片劑規(guī)格規(guī)格游游離離S SA A偏偏高高時(shí)時(shí)結(jié)結(jié)果果偏偏高高不不能能完完全全排排

17、出出干干擾擾缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)操操作作簡(jiǎn)簡(jiǎn)便便水水楊楊酸酸干干擾擾少少結(jié)結(jié)果果準(zhǔn)準(zhǔn)確確，避避免免游游離離S SA A及及片片劑劑中中穩(wěn)穩(wěn)定定直接滴定法水解后剩余滴定法兩步滴定法二、非水溶液滴定法吡羅昔康四、UV1.直接直接UV法法2.離子交換離子交換- -UV法法氯貝丁酯在氯貝丁酯在226nm226nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，但對(duì)氯酚等的波長(zhǎng)處有最大吸收，但對(duì)氯酚等有關(guān)物質(zhì)亦有吸收，干擾有關(guān)物質(zhì)亦有吸收，干擾UVUV法的測(cè)定。根據(jù)氯貝丁酯法的測(cè)定。根據(jù)氯貝丁酯為酯結(jié)構(gòu)，不能發(fā)生電離，而有關(guān)物質(zhì)可發(fā)生酸性解為酯結(jié)構(gòu)，不能發(fā)生電離，而有關(guān)物質(zhì)可發(fā)生酸性解離的性質(zhì)差異，采用陰離子交換色譜分離后，采用離的性質(zhì)差異，

18、采用陰離子交換色譜分離后，采用UVUV法測(cè)定。法測(cè)定。標(biāo)示量%=AsCRDWWAR標(biāo)示量100%3.CPC- -UV法法(Column Partition Chromatography)利用固定相酸堿性的不同酸堿性的不同進(jìn)行分離利用藥物和固定相起化學(xué)反應(yīng)而進(jìn)行分離利用生成離子對(duì)離子對(duì)進(jìn)行層析分離單純靠選擇流動(dòng)相進(jìn)行分離200300mm60mm4mm22mm層析柱玻棉壓榨棒350mm21mm擔(dān)體：硅藻土：硅藻土(Celite 545)(Celite 545)固定相：一定：一定pHpH的緩沖水溶液的緩沖水溶液流動(dòng)相：與水不相混溶的有機(jī)：與水不相混溶的有機(jī)溶劑溶劑( (洗脫前必須先用水飽和洗脫前必須

19、先用水飽和) )b.ASA測(cè)定供試液制備洗脫洗脫 5,25mlCHCl3 相繼洗脫，棄去相繼洗脫，棄去CHCl3洗脫洗脫 10ml冰冰HAc-CHCl3(150)*；85ml冰冰HAc-CHCl3(1100)，并稀釋至，并稀釋至100ml測(cè)定測(cè)定：280nm 空白空白：CHCl3NaHCONaHCO3 3使使ASA和和SA成鹽成鹽保留于柱上保留于柱上 用用CHClCHCl3 3洗脫的目的洗脫的目的：去除中性或堿性雜質(zhì)去除中性或堿性雜質(zhì)冰冰HAcHAc酸化的目的酸化的目的：使使ASAASA游離游離，易被，易被 CHCl3洗脫洗脫CRAR阿司匹林(mg)=Ax供試品吸光度供試品吸光度對(duì)照品吸光度對(duì)

20、照品吸光度對(duì)照品濃度對(duì)照品濃度例子例子五、HPLC標(biāo)示量%=CRAxARDWW標(biāo)示量100%對(duì)照對(duì)照品濃品濃度度供試供試品濃品濃度度對(duì)照對(duì)照品濃品濃度度 第六章 芳酸類藥物分析【實(shí)例分析實(shí)例分析】阿司匹林原料的含量測(cè)定阿司匹林原料的含量測(cè)定 取本品約0.4g，精密稱定，加中性乙醇（對(duì)酚酞指示液顯中性）20ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于18.02mg 的C9H8O4。 阿司匹林的百分含量式中 V: 氫氧化鈉滴定液消耗的體積，ml； T：滴定度（18.02mg）； F: 滴定液濃度校正系數(shù)； W：供試品取樣量

21、。VTF100%W 第六章 芳酸類藥物分析注意事項(xiàng)：（1）中性乙醇：阿司匹林在乙醇中溶解度大，不易水解；乙 醇中有微量乙酸等物質(zhì)，故應(yīng)制成中性（對(duì)酚酞指示液 顯中性）；（2）為防止阿司匹林在滴定過(guò)程中水解，一要快速滴定，二 要?jiǎng)×艺駬u，防止局部堿過(guò)濃；（4）滴定終點(diǎn)后，因乙酰水楊酸鈉逐漸水解，會(huì)使粉紅色褪 去，所以要注意判斷終點(diǎn)第六章 芳酸及其酯類藥物的分析第二節(jié) 苯甲酸類藥物的分析 苯甲酸及其鈉鹽結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)鑒 別檢 查含量測(cè)定第六章 芳酸藥物的分析COOH藥物結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)與分析方法 2.羧基4.苯環(huán)3.芳酸1.在乙醇、氯仿或乙醚中易溶，在水中微溶，在沸水中溶解；其鈉鹽在水中易溶，乙醇中略溶

22、2.酸性，用于定量 3.三氯化鐵呈色反應(yīng)4.共軛雙鍵，紫外吸收 1.溶解性一、苯甲酸及其鈉鹽的結(jié)構(gòu)、主要理化性質(zhì)與分析方法返返 回回 第六章 芳酸藥物的分析二、苯甲酸及其鈉鹽分析（一）鑒別試驗(yàn) 1. 1. 三氯化鐵反應(yīng)三氯化鐵反應(yīng) 在堿性溶液和苯甲酸鈉在中性溶液，苯甲酸與三氯化鐵試液生成沉淀。COONaCOOFe3+Fe(OH)3（赭色）3+ 2FeCl3 + 3NaOH3+ 3NaCl + 3HCl第六章 芳酸藥物的分析2.分解產(chǎn)物的反應(yīng)分解產(chǎn)物的反應(yīng) 苯甲酸鈉升華試驗(yàn)：苯甲酸鈉固體，加硫酸，加熱，可見(jiàn)白色苯甲酸凝結(jié)在試管內(nèi)壁。 此反應(yīng)收載于中國(guó)藥典（2005年版）附錄“一般鑒別試驗(yàn)”中。3.紅外光譜法紅外光譜法 供試品紅外光吸收?qǐng)D譜與對(duì)照的圖譜比較應(yīng)一致。第六章 芳酸藥物的分析(二二)含量測(cè)定含量測(cè)定1.苯甲酸直接酸堿滴定法苯甲酸直接酸堿滴定法 基本原理：苯甲酸酸性較強(qiáng)，水中溶解度小，而其鈉鹽在水中溶解度大，故以中性稀乙醇為溶劑,可用氫氧化鈉滴定液直接滴定。 終點(diǎn)產(chǎn)物為苯甲酸鈉，偏堿性，以酚酞為指示劑。第六章 芳酸藥物的分析【實(shí)例分析實(shí)例分析】苯甲酸的含量測(cè)定苯甲酸的含量測(cè)定 取苯甲酸約0.25g,精密稱定，得0.2478g。加中性稀乙醇（對(duì)酚酞指示液顯中性）25ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1033mol