細(xì)胞膜微粒CD31、CD54與酒精性股骨頭缺血性壞死的關(guān)系：隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)方案

1、www.CRTER.org楊云，等. 細(xì)胞膜微粒CD31、CD54與酒精性股骨頭缺血性壞死的關(guān)系：隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)方案細(xì)胞膜微粒CD31、CD54與酒精性股骨頭缺血性壞死的關(guān)系：隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)方案楊 云1，范海燕2，黃 健1，馬忠平1，張志峰1(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市 010030；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市 010030)引用本文：楊云，范海燕 ，黃健，馬忠平，張志峰. 細(xì)胞膜微粒CD31、CD54與酒精性股骨頭缺血性壞死的關(guān)系：隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)方案J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(44):6667-6672.DOI: 10.3969/j.iss

2、n.2095-4344.2016.44.019 ORCID: 0000-0002-5382-4252(楊云)文章快速閱讀：酒精性股骨頭壞死建模過程中細(xì)胞膜微粒的作用及與股骨頭內(nèi)血管損傷及血栓形成的關(guān)系楊云，男，1980年生，內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市人，漢族，2013年內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)疾病診斷及治療研究。并列第一作者：范海燕，女，1980年生，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市人，漢族，2015年內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)疾病影像學(xué)診斷研究。通訊作者：黃健，博士，主任醫(yī)師，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市010030中圖分類號(hào):R31

3、8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2016)44-06667-06稿件接受：2016-08-16建立酒精性股骨頭壞死模型每月取血及雙側(cè)股骨頭標(biāo)本W(wǎng)istar大鼠連續(xù)6個(gè)月灌胃46度烈性白酒(1)血清細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平(2)股骨頭空骨陷窩(3)股骨頭內(nèi)血管損傷陽性率(4)股骨頭內(nèi)微血栓形成(5)CD31、CD54與股骨頭壞死、血管內(nèi)皮損傷及微血栓的相關(guān)性文題釋義：細(xì)胞膜微粒：是血管內(nèi)皮損傷后從細(xì)胞表面脫落的一種小的膜性囊泡狀物質(zhì)，由磷脂和蛋白構(gòu)成，直徑在0.1-1 m，主要由血小板和內(nèi)皮細(xì)胞釋放。細(xì)胞膜微粒CD31、CD54的功能：細(xì)胞膜微粒起源不同，作用不同。CD54

4、由內(nèi)皮源性微粒特異表達(dá)，CD31由血小板及內(nèi)皮細(xì)胞源性微粒共同表達(dá)；CD31、CD54可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血，影響血管舒張功能；CD31表面富含血小板因子、組織因子和黏附因子，可黏附于暴露的內(nèi)皮下膠原；同時(shí)CD31還含有凝血因子，可為凝血酶原的激活提供更大的催化面積。因此細(xì)胞膜微粒CD31、CD54可通過介導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)、促凝、影響血管舒縮及促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致股骨頭內(nèi)微血管損傷。摘要背景：細(xì)胞膜微粒CD31、CD54可通過介導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)、促凝、影響血管舒縮及促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致股骨頭內(nèi)微血管損傷。文獻(xiàn)已證實(shí)細(xì)胞膜微粒在激素性股骨頭壞死中發(fā)揮重要作用，但是目前尚未見微粒與酒精性股

5、骨頭缺血性壞死相關(guān)性的研究。方法/設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，模型組連續(xù)6個(gè)月灌胃給予烈性白酒制備酒精性股骨頭缺血性壞死模型，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。干預(yù)1-6個(gè)月，每月2組各隨機(jī)取6只大鼠，分批取血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平；取雙側(cè)股骨頭，固定、脫鈣、石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅染色光鏡下進(jìn)行空骨陷窩計(jì)數(shù)確定股骨頭壞死情況，再行Verhoeff 氏染色及MSB微血栓染色觀察股骨頭內(nèi)微血管損傷及微血栓形成情況；并分析細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平與股骨頭壞死、血管內(nèi)皮損傷及微血栓形成的相關(guān)性。討論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬探討細(xì)胞膜微粒C

6、D31、CD54在酒精性股骨頭壞死中的作用，更加深入探討酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制，對(duì)其早期診斷、早期治療提供新的理論依據(jù)，可能為其治療提供一種新的靶點(diǎn)。倫理批準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為YKD2016154。大鼠的實(shí)驗(yàn)操作和取材遵循關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見的規(guī)定，并與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生與健康研究院的指南一致。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；骨組織工程；細(xì)胞膜微粒；酒精性股骨頭壞死主題詞：股骨頭壞死；膜蛋白質(zhì)類；組織工程基金資助：內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(201301061)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(YKD2015QNCX028)3 P.O.Box

7、 1200,Shenyang 110004 kf23385083Relationship of cell membrane microparticles CD31 and CD54 with alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head: study protocol for a randomized controlled trialYang Yun1, Fan Hai-yan2, Huang Jian1, Ma Zhong-ping1, Zhang Zhi-feng1 (1Second Affiliated Hospital,

8、Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China)AbstractBACKGROUND: Cell membrane microparticles CD31 and CD54 lead to microvascular injury in th

9、e femoral head by mediating vascular inflammatory response, promoting blood clotting, affecting vasomotion and promoting vascular endothelial injury. Studies have verified that membrane particles play an important role in steroid-induced necrosis of the femoral head, but there is no studies concerni

10、ng relationship between microparticles and alcohol-induced avascular necrosis of femoral head. METHODS/DESIGN: This is a randomized controlled animal study. Healthy male Wistar rats will be randomly assigned to two groups. In the model group, rats will be intragastrically administered hard liquor fo

11、r 6 consecutive months to prepare models of alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head. Blank controls will be intragastrically given an equal volume of physiological saline. In 1-6 months of intervention, six rats will be randomly selected from each group every month. Blood will be coll

12、ected separately. Flow cytometry will be used to detect serum cell membrane particles CD31, CD54 levels. Bilateral femoral head will be fixed, decalcified, embedded in wax, and then sections. After hematoxylin-eosin staining, empty bone lacuna will be quantified under a light microscope to identify

13、femoral head necrosis. Verhoffs staining and MSB microthrombosis staining will be used to observe microvascular injury and microvascular thrombosis in the femoral head, and to analyze the correlation of CD31 and CD54 levels with femoral head necrosis, vascular endothelial injury and microvascular th

14、rombosis. DISCUSSION: This study will investigate the effects of CD31 and CD54 on alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head, explore the pathogenesis of alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head, provide a new theoretical basis for early diagnosis and early treatment, and m

15、ay provide a new target for its treatment. ETHICS APPROVAL: The protocol has been approved by the Animal Experimental Ethics Committee of Inner Mongolia Medical University (approval number YKD2016154). Experimental procedures and materials of rats will be in accordance with the Guide for the Care an

16、d Use of Laboratory Animals, which is consistent with the guide of National Institutes of Health. Subject headings: Femur Head Necrosis; Membrane Proteins; Tissue Engineering Funding: the Medical and Health Research Project of the Inner Mongolia Autonomous Region Health and Family Planning Commissio

17、n, No. 201301061; the Youth Innovation Fund Project of Inner Mongolia Medical University, No. YKD2015QNCX028Cite this article: Yang Y, Fan HY, Huang J, Ma ZP, Zhang ZF. Relationship of cell membrane microparticles CD31 and CD54 with alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head: study proto

18、col for a randomized controlled trial. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(44):6667-6672.Yang Yun, Master, Attending physician, Second Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaFan Hai-yan, Master, Attending physician, Affiliat

19、ed Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaYang Yun and Fan Hai-yan contributed equally to this paper. Corresponding author: Huang Jian, M.D., Chief physician, Second Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inn

20、er Mongolia Autonomous Region, China6671ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) Experimental design1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類型及描述 隨機(jī)分組，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 1.2 實(shí)驗(yàn)完成地點(diǎn) 中國(guó)，呼和浩特市，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科及內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心。2 學(xué)術(shù)背景及理論基礎(chǔ) Academic background and theoretical basis 2.1 前言 長(zhǎng)期大量飲酒與股骨頭缺血性壞死的發(fā)生之間的關(guān)系早已明確，且因飲酒導(dǎo)致股骨頭壞死發(fā)病逐年上升1-3。內(nèi)蒙

21、古地處北方高寒地區(qū)，特殊的文化背景及飲食習(xí)慣，飲酒人群非常龐大，部分牧區(qū)人群每日飲酒，甚至以酒代飯，因飲酒所致股骨頭壞死病例在日常診療中非常多見。故此，酒精作為誘因?qū)е碌墓晒穷^壞死的發(fā)病已不容忽視。多年來人們一直致力于研究酒精性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制，從酒精的細(xì)胞毒性、股骨頭壞死的全身或局部變化，組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)等各個(gè)方面的研究提出了多種學(xué)說，包括脂肪代謝紊亂學(xué)說、酒精的細(xì)胞毒性學(xué)說、骨質(zhì)疏松學(xué)說、骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化學(xué)說、骨內(nèi)高壓學(xué)說、基因多態(tài)性學(xué)說、血管內(nèi)凝血學(xué)說等等，目前具體發(fā)病機(jī)制不詳6-10。盡管關(guān)于酒精性股骨頭缺血性壞死存在多

22、種假說，但是到目前為止沒有一種學(xué)說能完全解釋酒精性股骨頭缺血性壞死發(fā)生發(fā)展的全部病理過程，多數(shù)專家認(rèn)同酒精性股骨頭壞死為多種因素共同作用的結(jié)果。2.2 背景研究 血管內(nèi)凝血學(xué)說目前已經(jīng)公認(rèn)為所有非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的共同通路。股骨頭內(nèi)微循環(huán)障礙是股骨頭缺血性壞死的病理基礎(chǔ)已得到多數(shù)專家的認(rèn)可，在大量股骨頭壞死標(biāo)本中檢測(cè)到微血栓也證實(shí)了這一點(diǎn)，而血管內(nèi)皮損傷是血管內(nèi)血栓形成的中心環(huán)節(jié)11-16。目前研究證實(shí)，血管內(nèi)皮損傷后可釋放一種膜性囊泡狀物質(zhì)，將其定義為細(xì)胞膜微粒13。細(xì)胞膜微粒由磷脂和蛋白構(gòu)成，直徑在0.1-1 m，主要由血小板和內(nèi)皮細(xì)胞釋放。細(xì)胞膜微粒起源不同，作用不同：CD54由內(nèi)皮源性

23、微粒特異表達(dá)，CD31由血小板及內(nèi)皮細(xì)胞源性微粒共同表達(dá)；CD31、CD54可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血，影響血管的舒張功能； CD31表面富含血小板因子、組織因子和黏附因子，可以黏附于暴露的內(nèi)皮下膠原；同時(shí)CD31還含有凝血因子，可為凝血酶原的激活提供更大的催化面積。因此細(xì)胞膜微粒CD31、CD54可通過介導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)、促凝、影響血管舒縮及促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致股骨頭內(nèi)微血管損傷17-20。那么細(xì)胞膜微粒是否同樣參與股骨頭內(nèi)血栓形成呢？細(xì)胞膜微粒是否可以作為一種早期篩查股骨頭壞死的敏感指標(biāo)呢？是否有一種藥物通過抑制微粒的產(chǎn)生預(yù)防股骨頭壞死呢？文獻(xiàn)已證實(shí)細(xì)胞膜微粒CD31、CD54在激素

24、性股骨頭壞死中發(fā)揮重要作用。如鄭敏哲等21的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激素可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞膜微粒，進(jìn)而破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，降低血管穩(wěn)定性，進(jìn)一步引起股骨頭缺血壞死。吳志宏等13報(bào)道大劑量糖皮質(zhì)激素可使兔體內(nèi)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞源性膜微粒數(shù)量顯著增加，干預(yù)藥物能夠抑制微粒的產(chǎn)生，或許有助于預(yù)防或避免激素誘發(fā)股骨頭缺血壞死的發(fā)生。康鵬德等22則指出，應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素后兔體內(nèi)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞源性膜微粒(CD31、CD54、CD62E)數(shù)量增加，這可能是激素誘發(fā)血液高凝易栓、導(dǎo)致股骨頭缺血壞死發(fā)生的原因之一，抑制微粒的產(chǎn)生或許有助于預(yù)防或避免激素誘發(fā)股骨頭缺血壞死的發(fā)生。但

25、是，目前尚未見微粒與酒精性股骨頭缺血性壞死相關(guān)性的研究。2.3 前期實(shí)驗(yàn)介紹 從2000年開始，課題組一直致力于研究非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制研究。2001年進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)蒙古自治區(qū)科委自然科學(xué)基金資助課題“前凝血狀態(tài)下應(yīng)用激素導(dǎo)致骨壞死的實(shí)驗(yàn)研究”，并在動(dòng)物股骨頭內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量血栓形成，隨后陸續(xù)發(fā)表多篇文獻(xiàn)證實(shí)。近年，課題組對(duì)酒精性股骨頭壞死的研究也取得進(jìn)展，證實(shí)一些血管炎性遞質(zhì)參與酒精性股骨頭血管損傷，從而導(dǎo)致股骨頭壞死23。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過長(zhǎng)期灌胃烈性白酒模擬人類飲酒，成功建立了酒精性股骨頭缺血壞死大鼠模型，證實(shí)長(zhǎng)期攝入乙醇可導(dǎo)致大鼠股骨頭內(nèi)微血管內(nèi)皮損傷，局部微循環(huán)供血異常，誘發(fā)股骨頭缺血

26、性壞死，且壞死程度與乙醇累積攝入量相關(guān)。2.4 研究的理論依據(jù) 近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酒精性股骨頭缺血性壞死機(jī)制研究熱點(diǎn)為血管內(nèi)凝血學(xué)說，微粒作為檢測(cè)血管損傷及血栓形成的一種新的標(biāo)記物正成為共識(shí)24-26。微粒通過損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放后，通過介導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)、抑制血管的收縮、啟動(dòng)凝血等多種途徑導(dǎo)致血栓形成27-28。已有學(xué)者證實(shí)其在激素性股骨頭壞死中發(fā)揮重要作用。課題首次提出微粒是否與酒精性股骨頭壞死相關(guān)，并通過制作酒精性股骨頭壞死大鼠模型，檢測(cè)飲酒前后大鼠血清中細(xì)胞膜微粒CD31、CD54的變化，結(jié)合病理學(xué)染色觀察股骨頭內(nèi)血管損傷及血栓形成情況，探討細(xì)胞膜微粒在酒精性股骨頭壞死中的作用。更加深入

27、探討酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制，對(duì)其早期診斷、早期治療提供新的理論依據(jù)，可能為其治療提供一種新的靶點(diǎn)。3 研究目的 Study purpose 3.1 主要目的 研究細(xì)胞膜微粒CD31、CD54是否與血管內(nèi)皮損傷及血栓形成相關(guān)；探討細(xì)胞膜微粒CD31、CD54在酒精性股骨頭壞死中的作用。3.2 次要目的 證實(shí)長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致大鼠股骨頭缺血性壞死。4 動(dòng)物的選擇 Animal selection選擇成年健康雄性Wistar大鼠，鼠齡四五個(gè)月，體質(zhì)量(24030) g，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001。所有Wistar大鼠體型正常，健康狀況良好，排除健康

28、狀況不良，不活潑，有發(fā)燒、腹瀉等癥狀者。5 實(shí)驗(yàn)方法 Experimental methods 5.1 酒精性股骨頭缺血性壞死大鼠模型建立 Wistar大鼠灌胃給予46度烈性白酒10 mL/kg，1次/d，連續(xù)6個(gè)月。5.2 分組處理及取材 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，模型組連續(xù)6個(gè)月灌胃給予烈性白酒制備酒精性股骨頭缺血性壞死模型，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水(10 mL/kg， 1次/d，連續(xù)6個(gè)月)。每個(gè)月2組各隨機(jī)取6只大鼠，分批取血后處死，取下雙側(cè)股骨頭進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。 5.3 指標(biāo)檢測(cè)5.3.1 血清中細(xì)胞膜微粒CD31、CD54檢測(cè) 每月兩組各取血4 mL入抗凝管，取血后2 h內(nèi)

29、分次離心，獲得富含微粒血漿，加入抗體，常溫孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31、CD54含量。5.3.2 股骨頭空骨陷窩率 將所取雙側(cè)股骨頭，用40 g/L多聚甲醛(pH=7.2)固定24 h，10%乙二胺四乙酸(EDTA，pH 7.4)脫鈣8周，沿股骨頭冠狀面切片，石蠟包埋切片，厚度5 m。然后作蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，計(jì)數(shù)空骨陷窩率，確定股骨頭壞死情況。5.3.3 微血管損傷情況 股骨頭固定、脫鈣、石蠟包埋切片后，按相應(yīng)步驟進(jìn)行Verhoeff 氏染色，隨機(jī)抽取每張切片5個(gè)視野，觀察動(dòng)、靜脈的各層結(jié)構(gòu)及血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，比較血管損傷陽性率。5.3.4 微血栓檢測(cè)

30、股骨頭固定、脫鈣、石蠟包埋切片后，按相應(yīng)步驟進(jìn)行MSB微血栓染色。每組在顯微鏡下連續(xù)觀察50個(gè)視野，計(jì)數(shù)微血栓數(shù)量。6 研究設(shè)計(jì) Study protocol6.1 研究設(shè)計(jì)概要 隨機(jī)分組干預(yù)，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。6.2 實(shí)驗(yàn)計(jì)劃 實(shí)驗(yàn)計(jì)劃解決3個(gè)問題：證實(shí)長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致大鼠體內(nèi)細(xì)胞膜微粒CD31、CD54含量增加，并與酒精攝入量呈正相關(guān)；證實(shí)酒精性股骨頭壞死主要原因?yàn)檠軆?nèi)皮損傷及微血栓形成，進(jìn)一步揭示酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制；證實(shí)細(xì)胞膜微粒CD31、CD54參與酒精性股骨頭壞死發(fā)病，從而為酒精性股骨頭壞死的治療提供新的靶點(diǎn)。6.3 實(shí)驗(yàn)步驟(1)建立酒精性股骨頭缺血性壞死大鼠模型。(2)流式

31、細(xì)胞儀檢測(cè)血清細(xì)胞膜微粒CD31、CD54含量。(3)光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察，計(jì)數(shù)股骨頭空骨陷窩，確定股骨頭壞死情況。(4)進(jìn)行Verhoeff 氏染色，觀察股骨頭血管內(nèi)皮損傷情況。(5)進(jìn)行MSB微血栓染色，觀察微血栓。6.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫落情況 在實(shí)驗(yàn)過程中有大鼠死亡脫落者，記錄并分析原因，不再補(bǔ)足動(dòng)物數(shù)量。6.5 技術(shù)路線圖 見圖1。雄性四五月齡Wistar大鼠，體質(zhì)量(24030) g，標(biāo)準(zhǔn)飲食，分籠喂養(yǎng)每月每只大鼠取血4 mL，并取雙側(cè)股骨頭固定、脫鈣、石蠟包埋切片Verhoeff 氏染色，觀察股骨頭血管內(nèi)皮損傷情況流式細(xì)胞儀檢測(cè)血漿CD31、CD54蘇木精-伊紅染色，光鏡下計(jì)數(shù)股骨頭空

32、骨陷窩統(tǒng)計(jì)處理：SPSS 13.0軟件，方差分析；線性相關(guān)，P 0.05為差異有顯著性意義空白對(duì)照組灌胃法給予生理鹽水10 mL/(kg.d)，周期6個(gè)月圖1 實(shí)驗(yàn)流程技術(shù)路線圖Figure 1 Study flow chart模型組灌胃法給予烈性白酒(46度飲用白酒)10 mL/(kg.d)，周期6個(gè)月MSB染色，觀察股骨頭微血栓形成7 指標(biāo)與觀察 Outcome measurement7.1 主要觀察指標(biāo) 血清細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平；股骨頭空骨陷窩率；股骨頭動(dòng)靜脈血管損傷陽性率；股骨頭微血栓數(shù)。7.2 次要觀察指標(biāo) 細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平與股骨頭壞死、血管內(nèi)皮損傷及微血

33、栓的相關(guān)性。7.3 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)一覽表 見表1。8 統(tǒng)計(jì)方法 Statistical analysis8.1 研究假設(shè) 所有假設(shè)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P 0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。8.2 樣本量 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組大鼠數(shù)量定為40只。8.3 實(shí)驗(yàn)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料(包括細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平；股骨頭空骨陷窩率；股骨頭動(dòng)靜脈血管損傷陽性率及股骨頭微血栓數(shù))用s表示，采用方差分析。細(xì)胞膜微粒CD31、CD54水平與股骨頭壞死、血管內(nèi)皮損傷及微血栓的相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析。8.4 統(tǒng)計(jì)分析 由不參與實(shí)驗(yàn)的專業(yè)統(tǒng)計(jì)人員完成統(tǒng)計(jì)工作。在所有數(shù)據(jù)

34、錄入、審核完畢后，統(tǒng)計(jì)人員應(yīng)及時(shí)完成統(tǒng)計(jì)分析工作，交付實(shí)驗(yàn)的主要研究者，寫出研究報(bào)告。表1 數(shù)據(jù)觀察記錄表 (s)Table 1 Data records指標(biāo)模型組1個(gè)月2個(gè)月3個(gè)月4個(gè)月5個(gè)月6個(gè)月CD3137.396.7534.235.0239.6212.9945.983.3357.116.7356.655.24CD5442.2611.2740.692.3248.364.8348.617.3660.945.6559.384.92空骨陷窩率11.072.4512.803.1314.003.0220.933.1830.404.6529.934.86血管損傷陽性率31.46

35、8.471.8713.4333.4815.772.9320.075.25微血栓數(shù)0.730.530.970.973.2715.503.4018.633.12指標(biāo)空白對(duì)照組1個(gè)月2個(gè)月3個(gè)月4個(gè)月5個(gè)月6個(gè)月CD3127.9211.2625.209.5820.776.4926.7410.0426.8410.7126.4210.72CD5435.146.2335.146.2332.284.2131.473.3135.146.6335.146.63空骨陷窩率10.531.6612.02.7812.472.5613.472.3414.002.6814.272.15血管損傷陽性率

36、5.201.005.765.871.706.501.706.501.36微血栓數(shù)0.560.301.240.801.230.901.230.900.970.931.000.919 行政部分 Administration9.1 實(shí)驗(yàn)用試劑及儀器 46度白酒購自北京紅星股份有限公司，由專人保存，每天實(shí)際用量均有相應(yīng)的記錄。相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑已與廠家及代理商取得聯(lián)系；內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)儀器。9.2 動(dòng)物的飼養(yǎng) 內(nèi)蒙古大學(xué)提供質(zhì)量合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，專人飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，分籠喂養(yǎng)，自由飲水，實(shí)行12 h/12 h間斷照明，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(242) 。9.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量保

37、證 結(jié)果數(shù)據(jù)表格由研究者制作，研究者認(rèn)真填寫數(shù)據(jù)記錄表，記錄過程不遺漏項(xiàng)目，經(jīng)常核對(duì)；監(jiān)察員應(yīng)定期確認(rèn)所有的數(shù)據(jù)記錄正確完整，與原始記錄一致；由2個(gè)數(shù)據(jù)錄入員負(fù)責(zé)抄錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別將抄錄后的文檔標(biāo)注日期上傳至指定的電腦備份。10 總條款和協(xié)議 Terms and conditions10.1 科研審查委員會(huì) 由內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳及內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)批復(fù)，同意開展“細(xì)胞膜微粒CD31、CD54與酒精性股骨頭缺血性壞死相關(guān)性研究”相關(guān)研究。10.2 倫理指導(dǎo) 由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)進(jìn)行審核。10.3 倫理批準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為YKD2016154。大

38、鼠的實(shí)驗(yàn)操作和取材遵循關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見的規(guī)定，并與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生與健康研究院的指南一致。10.4 研究數(shù)據(jù)的保密 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包括書面數(shù)據(jù)和電子版數(shù)據(jù)兩種形式，電子版數(shù)據(jù)由研究者核對(duì)并對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鎖定，鎖定后的數(shù)據(jù)文件不允許再作變動(dòng)并將數(shù)據(jù)庫保存?zhèn)洳?，任何非授?quán)內(nèi)研究者外的人員均不得接觸。書面數(shù)據(jù)存放于固定地點(diǎn)并加鎖，鑰匙由資料管理員和研究室負(fù)責(zé)人保管。10.5 資料存檔 所有原始資料由文檔管理員專人完整保存，同時(shí)復(fù)制一份電子版資料，以方便使用。 10.6 文章發(fā)表 實(shí)驗(yàn)完成后總結(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，撰寫研究報(bào)告，總結(jié)報(bào)告，作結(jié)題的準(zhǔn)備。由主要研究者撰寫科研論文。11 參

39、考文獻(xiàn) References1 Jones JP Jr. Intravascular coagulation and osteonecrosis. Clin Orthop Relat Res.1992(277):41-53. 2 李子榮.科學(xué)診斷和治療股骨頭壞死J.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2005,19(9):685-686.3 Drescher W, Pufe T, Smeets R, et al. Avascular necrosis of the hip-diagnosis and treatment. Z Orthop Unfall.2011;149(2):231-240.4 Tan H

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