DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟

1、DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟DNA凝膠電泳凝膠電泳DNA agarose gel electrophoresis實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟 瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超

2、螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNAIDNAocDNA 當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：PCR產(chǎn)物產(chǎn)物,植物基因組植物基因組DNA,質(zhì)粒質(zhì)粒DNA等等，購買，購買 或自行提取純化?；蜃孕刑崛〖兓?shí)驗(yàn)試劑：實(shí)驗(yàn)試劑：5TBE電泳緩沖

3、液：電泳緩沖液： 6電泳載樣緩沖液：電泳載樣緩沖液：0.25 溴粉藍(lán)，溴粉藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶蔗糖水溶液，貯存于液，貯存于 4。 溴化乙錠溴化乙錠(EB)溶液母液：將溶液母液：將EB配制成配制成10 mg/mL，用鋁箔，用鋁箔或黑紙包裹容器或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。儲(chǔ)于室溫即可。 實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料和試劑DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟微波爐微波爐實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟凝膠電泳槽凝膠電泳槽DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)系統(tǒng)DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟取取5TBE緩沖液緩沖液20mL加水至加水至200mL，配制成配制成0.5TBE稀釋緩沖液，稀釋緩沖液，待用。待用。

4、膠液的制備：稱取膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入錐形瓶中，加入50mL 0.5TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，勻，此為此為0.8瓊脂糖凝膠液。瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底槽置于水平支持物上，插上

5、樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持面保持1mm左右的間隙。左右的間隙。 向冷卻至向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠錠(EB)溶液使其終濃度為溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋

6、緩沖液至液面恰好沒稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。過膠板上表面。 DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟加樣：取加樣：取10L DNA樣品與樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞炕ハ辔廴?，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。凝膠刺穿。 電泳：加完樣后電泳：加完樣后,合上電

7、泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷诤仙想娪静凵w，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，時(shí)，停止電泳。停止電泳。染色：未加染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的的EB溶液中，室溫溶液中，室溫下染色下染色20-25min。 觀察和拍照：在波長(zhǎng)為觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有加有EB的電泳膠板。的電泳膠板。 DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟 瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下瓊脂糖通常用水平裝

8、置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。瓊脂糖主要在電泳。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中，在中持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中，在中性性pH值下帶負(fù)電荷的值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：下列多種因素決定： 1、 DNA的分子大小的分子大小 2、 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象分子的構(gòu)象 4、 電源電壓電源電壓 5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 6、 離子強(qiáng)度影響離子強(qiáng)度影響 DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟DNADNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶存在處

9、顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶 DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟 EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專的垃圾要專門處理后才可丟棄。門處理后才可丟棄。 當(dāng)當(dāng)EB太多太多, 膠染色過深，膠染色過深，DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡，餾水沖泡，30min后再觀察。后再觀察。 制備凝膠時(shí)，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速制備凝膠時(shí)，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。