基因工程的基本操作順序

1、12補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)聚酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子 RNA RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。并與其結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄開始后，轉(zhuǎn)錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動(dòng)，并分子移動(dòng)，并以以DNADNA分子的一條鏈為模板合成分子的一條鏈為模板合成RNARNA。 轉(zhuǎn)錄完畢后，轉(zhuǎn)錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來(lái)，緊接著鏈釋放出來(lái)，緊接著RNARNA聚聚合酶也從合酶也從DNADNA模板鏈

2、上脫落下來(lái)。模板鏈上脫落下來(lái)。3不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子啟動(dòng)子4補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚酶聚酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子

3、 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA RNA 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 5真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)

4、。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子6原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思思考考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼7基因工程基本操作的四個(gè)步驟基因工程基本操作的四個(gè)步驟1 1、

5、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定89一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2 2、獲取目的基因的方法、獲取目的基因的方法（1 1）從基因文庫(kù)中獲?。幕蛭膸?kù)中獲取（2 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增（3 3）人工合成）人工合成第二教材第二教材P P8 8預(yù)習(xí)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)航10基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法1 1

6、）鳥槍法：）鳥槍法：供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運(yùn)載體運(yùn)載體限制酶限制酶載入載入受體細(xì)胞受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入導(dǎo)入外源外源DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增目的基因目的基因分離分離受體細(xì)胞受體細(xì)胞( (直接分離法直接分離法) )112 2）反轉(zhuǎn)錄法：）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使的信使RNARNA為模板，反為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNADNA，然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成雙鏈雙鏈DNADNA，從而獲得所，從而獲得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADN

7、A( (即目的基因即目的基因) )反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄合成合成基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法123 3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使應(yīng)的信使RNARNA序列，然序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的

8、核苷酸序列推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法13上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)鳥槍法鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基根據(jù)已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便廣泛使用廣泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)專一性強(qiáng)操作過(guò)程麻煩，操作過(guò)程麻煩，mRNAmRNA很不穩(wěn)定，要很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因?qū)^少的簡(jiǎn)單基因14(2)(2

9、)利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ (_ (做啟動(dòng)子做啟動(dòng)子) )、 _._.前提條件：前提條件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增為擴(kuò)增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對(duì)引物一對(duì)引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍

10、地?cái)U(kuò)增使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增15過(guò)程：過(guò)程：a a、DNADNA變性變性（90-9690-96）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火、退火（復(fù)性復(fù)性25-6525-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端端延伸，合成與模板互補(bǔ)延伸，合成與模板互補(bǔ) 的的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈165 5/ /3 3/

11、 /GGGGTCTC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /AGAG引物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物PCRPCR原理原理變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸175 5/ /3 3/ /GGGGTCTC5 5/ /3 3/ /GGGGTCTC5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物3 3/ / 183 3/ /5 5/ /GAGACCCC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引

12、物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物3 3/ /5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物19（3 3）人工合成：若基因）人工合成：若基因_，核苷酸序列又，核苷酸序列又 _ _ ，則可用此法。，則可用此法。較小較小已知已知20用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 核心核心將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）

13、分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同21質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）經(jīng)此過(guò)程，基因表達(dá)載體的構(gòu)建就成功了？經(jīng)此過(guò)程，基因表達(dá)載體的構(gòu)建就成功了？2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 核心核心同一種同一種22基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：目的基因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因2

14、33 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)24通過(guò)目的基因上的標(biāo)記基因，進(jìn)行篩選和檢測(cè)通過(guò)目的基因上的標(biāo)記基因，進(jìn)行篩選和檢測(cè) 導(dǎo)入過(guò)程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入導(dǎo)入過(guò)程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入

15、重組重組DNADNA分子嗎？分子嗎？真正能攝入重組真正能攝入重組DNADNA分子的受體細(xì)胞很少。分子的受體細(xì)胞很少。 所以要對(duì)受體細(xì)胞作怎樣的處理？所以要對(duì)受體細(xì)胞作怎樣的處理？對(duì)受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測(cè)對(duì)受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測(cè) 怎樣進(jìn)行檢測(cè)？怎樣進(jìn)行檢測(cè)？254 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗

16、蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗原抗體雜交26DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 271）以下說(shuō)法正

17、確的是）以下說(shuō)法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C C282）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNA293）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶304）有關(guān)基因工程的敘述正確的是）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)