動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1、動(dòng)物基因工程發(fā)展歷程古語有云龍生龍鳳生鳳，兔子生來會(huì)打洞。老祖先么通過長(zhǎng)期生活經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的俗諺往往與現(xiàn)代科學(xué)發(fā)現(xiàn)有著驚人的共同點(diǎn)。現(xiàn)代生物學(xué)認(rèn)為生物的遺傳性狀由基因決定基因遺傳信息的基本單位。一般指位于染色體上編碼一個(gè)特定功能產(chǎn)物(如蛋白質(zhì)或RNA分子等)的一段核苷酸序列。 1969年 科學(xué)家成功分離出第一個(gè)基因1970年，從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶 1972年美國(guó)斯坦福大學(xué)P.Berg等構(gòu)建了第一個(gè)重組子1973年，S.N.Cohen構(gòu)建了第一個(gè)可以在細(xì)胞中表達(dá)的重組子1980年 科學(xué)家首次培育出世界第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠1983年 科學(xué)家首次培育出世界第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草

2、1988年 K.Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)加速了基因工程的發(fā)展具有里程碑意義1980年，Gordon首次報(bào)道用DNA顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠；1982年，美國(guó)科學(xué)家Palmiter首次將大鼠生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训男坌栽酥?，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，其個(gè)體比對(duì)照鼠增大一倍，稱之為“超級(jí)鼠”。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自1980年代誕生以來，一直是生命科學(xué)研究和討論的熱點(diǎn)，隨著研究的不斷深入和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用，幾乎每年都有令人矚目的研究成果報(bào)道，有些轉(zhuǎn)基因成果已經(jīng)進(jìn)入實(shí)用化和商業(yè)化的開發(fā)階段。動(dòng)物基因工程動(dòng)物基因工程動(dòng)物轉(zhuǎn)基因主要是將外源基因轉(zhuǎn)移到胚胎細(xì)胞內(nèi)的染色體上，并進(jìn)行整

3、合、表達(dá)和遺傳等。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一項(xiàng)高度綜合的技術(shù)，它涉及到DNA重組技術(shù)、胚胎工程技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等，因而這需要多學(xué)科的交叉和融合。同時(shí)也需要更為嚴(yán)苛的技術(shù)手段。動(dòng)物基因工程簡(jiǎn)介動(dòng)物基因工程簡(jiǎn)介目的基因的分離與克隆表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的獲得基因?qū)胧荏w動(dòng)物選擇轉(zhuǎn)基因胚胎移植轉(zhuǎn)基因整合表達(dá)的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化遺傳性能研究以及性能選育組建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新類群等動(dòng)物基因工程流程物理方法點(diǎn)擊穿孔法顯微注射法裸露DNA直接注射法化學(xué)方法DEAE葡聚糖法磷酸鈣DNA共沉淀法脂質(zhì)體載體包埋法生物學(xué)方法病毒轉(zhuǎn)染法胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法精子載體法外源基因?qū)氲郊?xì)胞的方法外源基因?qū)氲郊?xì)胞的方法這些方法

4、各有自己的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，但在整個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)過程中，其基本原理應(yīng)該是相同。即將外源基因或體外重組基因經(jīng)體外增值和修飾轉(zhuǎn)移到動(dòng)物受精卵或細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒉糠只蚣舫蛞种剖蛊湓趧?dòng)物體內(nèi)得以整合和表達(dá)，以產(chǎn)生新遺傳特征或形狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。并能將新的遺傳信息穩(wěn)定地進(jìn)行世代遺傳獲得新的轉(zhuǎn)基因系或群體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)基本原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)基本原理將外源基因通過電場(chǎng)作用，導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用,并且效率較高。活體電穿孔法的原理很簡(jiǎn)單,在直流電場(chǎng)作用的瞬間,細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105115m ,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然后自行恢復(fù)。在此期

5、間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞。電穿孔的法的特點(diǎn)：1理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官2對(duì)導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒有限制3電穿孔法操作簡(jiǎn)單快速,電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作缺點(diǎn)：首先,外源基因表達(dá)持續(xù)的時(shí)間很短,雖然外源基因?qū)牒笞羁炜稍?15 小時(shí)有表達(dá),但大多12 月后表達(dá)量降至很低。外源基因表達(dá)的時(shí)間主要由于所構(gòu)建的表達(dá)載體和基因?qū)氲陌屑?xì)胞組織器官不同而存在巨大差異。 電電擊穿孔法擊穿孔法電電擊穿孔法流程圖擊穿孔法流程圖顯微注射法是指在顯微鏡下操作的微量注射技術(shù)?？蓪⒓?xì)胞的某一部分(如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器)或外源物質(zhì)(

6、如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白質(zhì)等)通過玻璃毛細(xì)管拉成的細(xì)針，注射到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)。是研究各種生物分子的作用、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、克隆動(dòng)物等的重要技術(shù)。顯微注射法轉(zhuǎn)入基因長(zhǎng)度可以達(dá)到數(shù)百kb，并能隨機(jī)地整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，并且直接、相對(duì)容易控制應(yīng)用范圍廣。但是有時(shí)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組的重排易位、缺失或者定點(diǎn)突變顯微注射法顯微注射法顯微注射法流程圖顯微注射法流程圖脂質(zhì)體載體包埋法脂質(zhì)體載體包埋法流程反轉(zhuǎn)錄病毒具有侵入宿主細(xì)胞并整合于細(xì)胞染色體DNA的能力。將外源基因DNA插入反轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過輔助細(xì)胞包裝成高感染度的病毒顆粒，感染胚胎后，將感染的桑椹期胚胎細(xì)胞導(dǎo)入子宮，可

7、發(fā)育成攜帶外源基因的子代動(dòng)物。該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點(diǎn)整合，適合于難以觀察到原核的禽類受精卵。由于病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10kb，否則影響活性和穩(wěn)定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動(dòng)物的表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染法病毒轉(zhuǎn)染法流程圖轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也異常迅猛。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球現(xiàn)有以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的公司超過40家已成為21世紀(jì)生物技術(shù)領(lǐng)域的支柱產(chǎn)業(yè)。1998年全球動(dòng)物生物技術(shù)產(chǎn)品銷售額估計(jì)為62億美元。預(yù)計(jì)到2010年僅在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域銷售額將達(dá)到110億美元，其中75億美元來自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品種：而利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物和功能蛋白的銷售額預(yù)計(jì)可達(dá)500億

8、美元?？梢姡m然部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還處于研究與開發(fā)生產(chǎn)階段，但該項(xiàng)技術(shù)給我們生產(chǎn)和生活所帶來的益處已引起國(guó)際學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的高度關(guān)注。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用發(fā)育生物學(xué)的研究 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于觀察目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達(dá)、關(guān)閉及調(diào)控機(jī)制，了解調(diào)控順序(如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子)在組織特異性表達(dá)中的作用，此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可用于識(shí)別動(dòng)物發(fā)育過程中的基因(包括內(nèi)源基因)及其活動(dòng)，也可測(cè)出與動(dòng)物發(fā)育相關(guān)的未知基因的表達(dá)特性。遺傳學(xué)研究 利用自然突變或人為修飾的基因作為外源基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，研究導(dǎo)人的異?；虻谋硇托?yīng)，可以了解基因站構(gòu)和功能的蓋系，還可用于基因組印跡分析、遺傳缺陷的矯正等生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)

9、理論生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)理論研究研究心血管疾病的研究各種調(diào)節(jié)心血管功能的因子如轉(zhuǎn)脂蛋白、轉(zhuǎn)纖維蛋白溶酶原等都可通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來了解其生理功能及作用，建立如動(dòng)脈粥樣硬化、突發(fā)性高血壓、靜脈閉塞等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。 腫瘤學(xué)研究 腫瘤基因的發(fā)現(xiàn)是近10年來腫瘤學(xué)研究的重大突破，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺癌基因等100多個(gè)腫瘤基因。實(shí)驗(yàn)證明，各種脊椎動(dòng)物都攜帶腫瘤基因，在通常情況下并不引起細(xì)胞癌變，只有在某些條件下才能被激活使癌細(xì)胞增生而導(dǎo)致癌變。建立帶有腫瘤基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可了解哪些組織對(duì)腫瘤基因轉(zhuǎn)化活性敏感、腫瘤形成與其基因的關(guān)系、腫瘤基因生長(zhǎng)分化影響等等。 遺傳病研究 通常是將功能正常的外源基因?qū)雱?dòng)物體的靶細(xì)胞內(nèi)，

10、用來彌補(bǔ)缺陷的基因，改變患病細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，進(jìn)行基因治療。相反的將顯性疾病基因或一個(gè)、甚至多個(gè)外源基因人為地導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，就可制備遺傳性疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，研究和治療人類遺傳性疾病。免疫學(xué)研究 巴賓耐特(Babinet)發(fā)現(xiàn)雖然轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生HBsAg，但在6個(gè)月內(nèi)沒有任何病理變化，表現(xiàn)為一種持續(xù)的帶病毒狀態(tài)。這些結(jié)果表明：乙型肝炎患者的肝細(xì)胞損傷不是由HBV的HBsAg表達(dá)直接引起，而是通過對(duì)肝細(xì)胞膜上的病毒抗原發(fā)生免疫反應(yīng)造成的。因此，可以用轉(zhuǎn)基因小鼠模型來研究免疫耐受與肝細(xì)胞損傷的關(guān)系以探討發(fā)病機(jī)制。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠還為研究第l和第類主要組織相容性抗原的功能提供了新手段。醫(yī)學(xué)研究醫(yī)學(xué)研

11、究經(jīng)典的遺傳育種方法要在同種或親源關(guān)系很近的種經(jīng)典的遺傳育種方法要在同種或親源關(guān)系很近的種間才能進(jìn)行，并且受到變異或突變的限制，而使用間才能進(jìn)行，并且受到變異或突變的限制，而使用重組重組DNADNA技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)就可使技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)就可使親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的種親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的種間遺傳信息進(jìn)行交換和重組間遺傳信息進(jìn)行交換和重組。另外由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另外由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以穩(wěn)定地整合外源基因，并在合適的組織表達(dá)，可以穩(wěn)定地整合外源基因，并在合適的組織表達(dá)，還能將這種性狀遺傳給后代，這樣就可以生產(chǎn)出生還能將這種性狀遺傳給后代，這樣就可以生產(chǎn)出生長(zhǎng)快、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)奶更多而耗料極少的轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)快、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)奶

12、更多而耗料極少的轉(zhuǎn)基因家畜，為家畜改良提供一條重要的途徑。家畜，為家畜改良提供一條重要的途徑。改良和培育動(dòng)物新品種改良和培育動(dòng)物新品種一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液、腹水等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。為醫(yī)藥、食品及畜牧業(yè)的發(fā)展開辟了極為廣闊的天地。動(dòng)物生物反應(yīng)器動(dòng)物乳腺動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性

13、表達(dá)的啟動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物, 指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá), 并從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳液中獲取重組蛋白。動(dòng)物乳腺有廣泛表達(dá)外源基因的能力，可以生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)和多肽，從小分子肽到大分子蛋白質(zhì)，從分泌型蛋白到內(nèi)膜蛋白、多聚蛋白、二價(jià)抗體等，顯示動(dòng)物乳腺是一種很好的生物反應(yīng)器，在生產(chǎn)高附加值蛋白質(zhì)方面有廣泛用途。用動(dòng)物乳腺生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品還有產(chǎn)品活性高、產(chǎn)量高、產(chǎn)品易于純化、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。據(jù)專家估計(jì)，用細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)1藥物蛋白，成本8005000美元，而乳腺生物反應(yīng)器方法只需0.020.50美元；傳統(tǒng)藥物的研制生產(chǎn)周期是1520年，乳腺生物反應(yīng)器方法一般為5年。生物反應(yīng)器技術(shù)已成為當(dāng)今生物工程技術(shù)

14、的制高點(diǎn)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)熱點(diǎn)。我國(guó)是從1984年開始轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的，并于同年獲得了含人-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用顯微注射法，1985年和1986年又分別獲得了含人生長(zhǎng)激素（MT-hGH）基因的轉(zhuǎn)基因泥鰍和小鼠。1987年獲得含有大腸桿菌galk和gpt基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。以后又相繼獲得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、含促紅細(xì)胞生成素（EPO）和HbgAg 2種基因乳腺特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因山羊、含人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊、含人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛、乳腺表達(dá)“生物鋼”蛋白基因的轉(zhuǎn)基因老鼠30。2003年3月，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)取得我國(guó)首例轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛成功31。同年10月，第二頭轉(zhuǎn)有人巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因的體細(xì)胞克隆牛出生，這標(biāo)志著我國(guó)已經(jīng)成熟掌握了轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛的技術(shù)體系，在該領(lǐng)域的研究躋身世界前列（人民網(wǎng)）。2004年，利用精子載體法制備乳腺生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因兔模型獲得成功，該項(xiàng)目由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院主持，獲得F代轉(zhuǎn)基因兔184只，通過鑒定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因陽性后代89只，陽性率48.4%動(dòng)物基因工程研究現(xiàn)狀盡管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)展迅速，對(duì)人們的健康生活起了巨大作用，但是目前仍存在一些問題。首先，轉(zhuǎn)基因技術(shù)支撐體系不夠完善主要表現(xiàn)為目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率不高，體細(xì)胞克隆等技術(shù)環(huán)節(jié)還有待完善。并且有些技術(shù)會(huì)對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生危害，這就需要研究者在轉(zhuǎn)基因技術(shù)