發(fā)酵工藝條件的確定

1、第第2 2章章 發(fā)酵工藝條件的確定發(fā)酵工藝條件的確定第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵生產(chǎn)用原料及培養(yǎng)基的處理發(fā)酵生產(chǎn)用原料及培養(yǎng)基的處理第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基的選擇和確定培養(yǎng)基的選擇和確定第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)條件的確定培養(yǎng)條件的確定第四節(jié)第四節(jié) 淀粉質(zhì)原料的處理淀粉質(zhì)原料的處理第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵生產(chǎn)用原料及培養(yǎng)基的處理發(fā)酵生產(chǎn)用原料及培養(yǎng)基的處理 微生物發(fā)酵其本質(zhì)本質(zhì)，可以理解為物質(zhì)形式的轉(zhuǎn)化過程，就是利用微生物生長(zhǎng)所需的底物轉(zhuǎn)化成特定的產(chǎn)物在這個(gè)過程中，有兩個(gè)問題是工業(yè)化需要解決的：（1）產(chǎn)物的社會(huì)效益，（2）物質(zhì)轉(zhuǎn)變過程中產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益，即：低價(jià)值的原材料、低能耗等 原先：凡是含有可發(fā)酵性糖或可轉(zhuǎn)化原先：凡

2、是含有可發(fā)酵性糖或可轉(zhuǎn)化為發(fā)酵性糖的物料。為發(fā)酵性糖的物料。 現(xiàn)在：現(xiàn)在： 用來(lái)轉(zhuǎn)化人們所需產(chǎn)物的主用來(lái)轉(zhuǎn)化人們所需產(chǎn)物的主要物料。要物料。一、原料的定義一、原料的定義二 選擇原料的依據(jù)1. 1. 滿足生產(chǎn)工藝的要求滿足生產(chǎn)工藝的要求 工藝條件的核心：微生物工藝條件的核心：微生物 不同不同 微生物微生物 可利用的原料不可利用的原料不同，如酒精發(fā)酵。同，如酒精發(fā)酵。n對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝無(wú)抑制作用的對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝無(wú)抑制作用的物質(zhì)物質(zhì)1.1.微生物的代謝產(chǎn)物無(wú)有害物質(zhì)微生物的代謝產(chǎn)物無(wú)有害物質(zhì) 2. 2. 滿足生產(chǎn)管理和經(jīng)濟(jì)上的要求滿足生產(chǎn)管理和經(jīng)濟(jì)上的要求n（1 1）原料資源要豐富

3、，因地制宜，就地取材，）原料資源要豐富，因地制宜，就地取材，要求原料內(nèi)碳水化合物含量較多，蛋白質(zhì)含要求原料內(nèi)碳水化合物含量較多，蛋白質(zhì)含量要適當(dāng)，適合微生物的需要和吸收利用。量要適當(dāng)，適合微生物的需要和吸收利用。n（2 2）便于收集和運(yùn)輸，貯藏）便于收集和運(yùn)輸，貯藏n（3 3）從產(chǎn)品的成本角度，綜合原料的價(jià)格，）從產(chǎn)品的成本角度，綜合原料的價(jià)格，加工過程經(jīng)常性消耗等，并盡可能采用非糧加工過程經(jīng)常性消耗等，并盡可能采用非糧食原料。食原料。n（4 4）產(chǎn)品的用途不同，選擇的原料就不同）產(chǎn)品的用途不同，選擇的原料就不同3. 3. 環(huán)境保護(hù)的要求環(huán)境保護(hù)的要求三三 原料的種類原料的種類常用的或具有潛在

4、能力的原料常用的或具有潛在能力的原料有（不包括特殊有（不包括特殊產(chǎn)品的前體）：產(chǎn)品的前體）：n1 1 淀粉質(zhì)原料（糧食原料）淀粉質(zhì)原料（糧食原料）n（1 1）薯類原料：甘薯、馬鈴薯、木薯、山）薯類原料：甘薯、馬鈴薯、木薯、山藥等。藥等。n（2 2）谷類原料：）谷類原料： 高粱、玉米、大米、谷子、高粱、玉米、大米、谷子、大麥、小麥、燕麥、黍和稷等。大麥、小麥、燕麥、黍和稷等。n2 2 糖質(zhì)原料：糖質(zhì)原料： 葡萄糖，麥芽糖等葡萄糖，麥芽糖等n 廢糖蜜：甜菜、甘蔗廢糖蜜：甜菜、甘蔗n 淀粉水解糖淀粉水解糖n3 3 纖維質(zhì)原料：纖維質(zhì)原料： 世界上含量最大的一類資源。世界上含量最大的一類資源。 包括：

5、森林，木材工業(yè)下腳料，農(nóng)作物包括：森林，木材工業(yè)下腳料，農(nóng)作物秸桿，秸桿， 城市纖維垃圾，工業(yè)下腳料等。城市纖維垃圾，工業(yè)下腳料等。n4 4 石油化工產(chǎn)品石油化工產(chǎn)品 乙酸，甲醇，乙醇等乙酸，甲醇，乙醇等n5 5 其他其他n 亞硫酸低漿廢液，亞硫酸低漿廢液，n 野生植物野生植物 橡子仁、葛根、土茯苓、橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金剛頭、香符子等。蕨根、石蒜、金剛頭、香符子等。 乳清乳清發(fā)酵原料的預(yù)處理原料不同處理方法也有所差異。1. 淀粉利用前需變成糊精或葡萄糖 方法：酸水解（高壓、耐酸）、酶水解法2. 糖蜜加熱殺菌和用水沖稀，也可加酸處理后再補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽3. 碳?xì)浠衔铮菏兔撓炓欢s分

6、的石油經(jīng)冷卻脫蠟而獲得的凝固點(diǎn)在-10的油，加入適量無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行接種發(fā)酵發(fā)酵工業(yè)節(jié)約糧食的途徑n1 1 抓發(fā)酵的穩(wěn)定性和高產(chǎn)量，控制染菌，提抓發(fā)酵的穩(wěn)定性和高產(chǎn)量，控制染菌，提高發(fā)酵單位和提取效率，使高發(fā)酵單位和提取效率，使單耗降低單耗降低，節(jié)糧的，節(jié)糧的關(guān)鍵。關(guān)鍵。n2 2 利用代用品，如廢糖蜜，葡萄糖廢母液，利用代用品，如廢糖蜜，葡萄糖廢母液，工業(yè)用葡萄糖等。工業(yè)用葡萄糖等。n3 3 轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換， 開拓新資源和微生物資源。開拓新資源和微生物資源。n4 4 廢物利用與污染的治理相結(jié)合。廢物利用與污染的治理相結(jié)合。培養(yǎng)基培養(yǎng)基(medium)(medium)n定義定義：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工

7、配制的、適合于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（混合養(yǎng)料）。n特點(diǎn)特點(diǎn)：任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的五大營(yíng)養(yǎng)要素，且應(yīng)比例適當(dāng)。一旦配成必須立即滅菌。n用途用途：促使微生物生長(zhǎng)；積累代謝產(chǎn)物；分離微生物菌種；鑒定微生物種類；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種保藏；制備微生物制品培養(yǎng)基的配制原則培養(yǎng)基的配制原則（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)（目的明確目的明確）（二）營(yíng)養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（二）營(yíng)養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)）（三）物理化學(xué)條件適宜（三）物理化學(xué)條件適宜（條件適宜條件適宜）（四）根據(jù)培養(yǎng)目的選擇原料及其來(lái)源（四）根據(jù)培養(yǎng)

8、目的選擇原料及其來(lái)源（經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)節(jié)約節(jié)約）舉例舉例：n發(fā)酵生產(chǎn)常采用天然成分的液體培養(yǎng)基。而且，經(jīng)常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸稈，以及乙醇、醋酸等石化產(chǎn)品代替糧食來(lái)配制培養(yǎng)基。（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn) 即即根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基基。 不同不同營(yíng)養(yǎng)類型營(yíng)養(yǎng)類型的微生物，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的的微生物，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的需求差異很大。如需求差異很大。如自養(yǎng)型自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應(yīng)該）由簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物質(zhì)組成?？梢裕ɑ驊?yīng)該）由簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物質(zhì)組成。異養(yǎng)異養(yǎng)微生物微生物的培養(yǎng)基至少需要含

9、有一種有機(jī)物質(zhì)，的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機(jī)物質(zhì)，但有機(jī)物的種類需適應(yīng)所培養(yǎng)菌的特點(diǎn)。但有機(jī)物的種類需適應(yīng)所培養(yǎng)菌的特點(diǎn)。（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn) 按微生物的主要按微生物的主要類群類群來(lái)說(shuō)，它們所需要的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同：基成分也不同： 細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、 LB (Luria-Bertani) 放線菌： 高氏一號(hào)培養(yǎng)基 真菌： 查氏合成培養(yǎng)基、PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌； 麥芽汁（二）營(yíng)養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（二）營(yíng)養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)濃度過高濃度過高微生物的生長(zhǎng)起抑制作用，微

10、生物的生長(zhǎng)起抑制作用， 濃度過小濃度過小不能滿足微生物生長(zhǎng)的需要。不能滿足微生物生長(zhǎng)的需要。碳氮比（碳氮比（C/NC/N）直接影響微生物生長(zhǎng)與繁殖及代謝物的直接影響微生物生長(zhǎng)與繁殖及代謝物的形成與積累，故常作為考察培養(yǎng)基組成時(shí)的一個(gè)重要指形成與積累，故常作為考察培養(yǎng)基組成時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo)；標(biāo)；例例：谷氨酸生產(chǎn)中? C/N 4/1時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少； C/N3/1 時(shí)，菌體生長(zhǎng)受抑制，而谷氨酸大量增加。速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例各種金屬離子間的比例各種金屬離子間的比例 碳源中的碳原子的碳源中的碳原子的mol數(shù)數(shù)氮源中所含的

11、氮原子的氮源中所含的氮原子的mol數(shù)數(shù)C/N比值比值=用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）（三）物理化學(xué)條件適宜（三）物理化學(xué)條件適宜n（1）pH: 各類微生物的最適生長(zhǎng)pH值各不相同： 細(xì) 菌：7.08.0放線菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0霉 菌：4.05.8 在微生物的生長(zhǎng)和代謝過程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會(huì)發(fā)生改變，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對(duì)恒定，通常采用下列兩種方式：內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要不

12、斷向發(fā)酵液流加酸或堿液（三）物理化學(xué)條件適宜（續(xù)）（三）物理化學(xué)條件適宜（續(xù)）磷酸緩沖液：磷酸緩沖液：pHpH值從值從6.07.66.07.6之間之間加入加入CaCOCaCO3 3：培養(yǎng)基中所含氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)也可起培養(yǎng)基中所含氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)也可起到緩沖作用。到緩沖作用。K2HPO4+HCl KH2PO4+KClKH2PO4+KOH K2HPO4+H2OCO32 HCO3 H2CO3 CO2+H2O+H+H+H+H（2 2）滲透壓和）滲透壓和a aw wn滲透壓 等滲溶液適宜微生物生長(zhǎng) 高滲溶液細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離 低滲溶液細(xì)胞吸水膨脹，直至破裂 大多數(shù)微生物適合在等滲的環(huán)境下生

13、長(zhǎng)，而有的菌如金黃色葡萄球菌則能在3mol/L NaCl的高滲溶液中生長(zhǎng)。能在高鹽環(huán)境（2.86.2mol/L NaCl）生長(zhǎng)的微生物常被稱為嗜鹽微生物（Halophiles）。aw：水分活度（水分活度（water activity）各種微生物生長(zhǎng)的水分活度：各種微生物生長(zhǎng)的水分活度：0.60.99之間之間aw=PP0細(xì)菌細(xì)菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌微生物微生物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)的最低最低aw一般：一般：0.900.98嗜鹽菌：嗜鹽菌：0.75（約（約5.5mol/LNaCl）一般一般 ：0.870.91高滲酵母：高滲酵母：0.610.65（0.1V以上的環(huán)境中均能生長(zhǎng)).厭氧微生物：只能在 +0.1V以

14、下生長(zhǎng)兼性厭氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下發(fā)酵培養(yǎng)基是多氧化還原偶的復(fù)雜電化學(xué)系統(tǒng)，測(cè)出的Eh值僅代表其綜合結(jié)果。對(duì)微生物影響最大的是：分子氧和分子氫的濃度培養(yǎng)基中常用的還原劑：巰基乙酸、抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等。（四）根據(jù)培養(yǎng)基的（四）根據(jù)培養(yǎng)基的應(yīng)用目的應(yīng)用目的選擇原料及其來(lái)源選擇原料及其來(lái)源該培養(yǎng)基的應(yīng)用目的，即： 是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物？ 是實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？ 代謝產(chǎn)物是初級(jí)代謝產(chǎn)物還是次級(jí)代謝產(chǎn)物？用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產(chǎn)

15、物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）；若代謝產(chǎn)物是次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)要考慮是否加入特殊元素或特定代謝產(chǎn)物的前體物；當(dāng)所設(shè)計(jì)的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來(lái)源和價(jià)格，應(yīng)選擇來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉 的原料，提倡以粗代精，以廢代好。（四）根據(jù)培養(yǎng)基的（四）根據(jù)培養(yǎng)基的應(yīng)用目的應(yīng)用目的選擇原料及其來(lái)源選擇原料及其來(lái)源培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備附：培養(yǎng)基的滅菌附：培養(yǎng)基的滅菌n滅菌的原因：n在發(fā)酵過程中如混入其他微生物，將與菌種形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)發(fā)酵過程造成不良影響 。n舉例：n如果在谷氨酸發(fā)酵過程中混人放線菌，則放線菌分泌的抗生素就會(huì)使大量的谷氨酸棒狀桿菌死亡。如果在青霉素生產(chǎn)過程

16、中污染了雜菌，這些雜菌則會(huì)分泌青霉素酶，將合成的青霉素分解掉。培養(yǎng)基的消毒與滅菌工業(yè)上具體措施包括： 1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌； 2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理； 3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境； 4）培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過滅菌； 5）使用無(wú)污染的純粹種子。培養(yǎng)基與設(shè)備，管道培養(yǎng)基與設(shè)備，管道的滅菌條件的滅菌條件n殺菌鍋內(nèi)滅菌b種子罐，發(fā)酵罐，計(jì)量罐，補(bǔ)料罐等的空罐滅菌(127133 , 30 min)及管道和空氣過濾器滅菌(138143 , 4060 min)b發(fā)酵罐，種子罐實(shí)罐滅菌b發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌b消泡劑滅菌b其他物料滅菌 以上均為單獨(dú)滅菌，有些產(chǎn)品結(jié)合原料處理，如

17、蒸煮等也可達(dá)到同樣的目的。n高壓蒸氣滅菌高壓蒸氣滅菌 一般培養(yǎng)基一般培養(yǎng)基: : 1.05 Kg/cm 1.05 Kg/cm2 2, 121.3, 15-30 min, 121.3, 15-30 min 含糖培養(yǎng)基含糖培養(yǎng)基: : 0.56 Kg/cm 0.56 Kg/cm2 2, 112.6 , 15-30 min, 112.6 , 15-30 min 40%40%尿素尿素: : 0.2 Kg/cm 0.2 Kg/cm2 2, 105 , 5 min, 105 , 5 min 消泡劑消泡劑: : 1.049 Kg/cm 1.049 Kg/cm2 2, 120, 15min, 120, 15m

18、inn間歇滅菌，間歇滅菌，121121，20302030分鐘分鐘 1.1.連續(xù)滅菌，連續(xù)滅菌，137137，1530s1530s，在維持罐中，在維持罐中保溫保溫820820分鐘。分鐘。含葡萄糖培養(yǎng)基高溫滅菌n含葡萄糖的培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后,容易產(chǎn)生有害色素,其色素成分比較復(fù)雜俗稱焦糖色,主要是還原糖與氨類物質(zhì)高溫條件的美拉德反應(yīng)所致,所以一般培養(yǎng)基中的葡萄糖都要求單獨(dú)滅菌,溫度控制在115,15min。n微生物的含糖培養(yǎng)基滅菌時(shí),最好將培養(yǎng)基中葡萄糖在pH5.5時(shí)單獨(dú)滅菌或與非氨類的無(wú)機(jī)鹽共同滅菌,以減少色素的產(chǎn)生。三級(jí)氨水除菌過濾器 n氨是在高溫高壓條件下合成的一種無(wú)機(jī)物質(zhì),氨本身并不被雜菌污

19、染,但是我們?cè)诎l(fā)酵過程中所用的氨水是氨經(jīng)過配制而產(chǎn)生的一種氨和水的混合物質(zhì),其濃度較低,一般在1820%之間在氨水的配制、貯存、運(yùn)輸過程中所有的環(huán)節(jié)都不是無(wú)菌操作,這樣在整個(gè)過程中易遭受雜菌的侵入n如果氨水不經(jīng)過無(wú)菌處理就補(bǔ)入發(fā)酵液中,氨水的濃度被大大稀釋,在氨水中暫時(shí)被抑制的芽孢就會(huì)迅速?gòu)?fù)蘇并進(jìn)行繁殖,便會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵染菌,并且此菌繁殖較快嚴(yán)重影響發(fā)酵單位及發(fā)酵液濾速,對(duì)提取收率和產(chǎn)品質(zhì)量危害較大 說(shuō)明:n1#、2#均為砂芯濾器,為第一級(jí)過濾,其作用主要是除去氨水中的顆粒性物質(zhì)(可除去大于5微米的微粒,如懸浮的泥土等),這樣既可減輕無(wú)菌過濾器的負(fù)荷,又可提高除菌效率,延長(zhǎng)其使用壽命。n3#、4#

20、分別為1微米和0.45微米膜過濾器,分別作為第二級(jí)過濾和第三級(jí)過濾,在使用前可用蒸汽進(jìn)行消毒滅菌處理,滅菌處理后即可使用。分批滅菌操作要點(diǎn)分批滅菌操作要點(diǎn)n將配置好培養(yǎng)基打入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行實(shí)消，操作要點(diǎn)如下：n定期檢查設(shè)備、管道有無(wú)滲漏，主要是：冷卻管道，夾套。n培養(yǎng)基升溫時(shí)，打開所有排氣閥門，排掉空氣？當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到滅菌溫度時(shí)，進(jìn)入保溫操作階段，此時(shí)要求與反應(yīng)器相連的所有管道處于兩個(gè)狀態(tài)：進(jìn)汽或出汽，目的是對(duì)管道進(jìn)行滅菌。n培養(yǎng)基升溫時(shí)開動(dòng)攪拌系統(tǒng)，以使培養(yǎng)基內(nèi)部傳熱均勻，當(dāng)溫度升到100時(shí)，停止攪拌，是為了保護(hù)軸承，培養(yǎng)基的沸騰，可以起到攪拌作用。n注意輔助設(shè)備的滅菌：空氣過濾器、計(jì)量

21、罐、流加管道與流加液貯罐，空氣流量計(jì)等。n保溫期間，要求罐壓：0.090.10MPa，溫度：118121，時(shí)間：30分鐘。n滅菌結(jié)束后，需要立即引入無(wú)菌空氣?，保證罐內(nèi)壓力后方可冷卻，目的是防止培養(yǎng)基的冷卻使罐內(nèi)形成負(fù)壓，易染菌,甚至設(shè)備損壞。n配制培養(yǎng)基時(shí)，充分考慮培養(yǎng)基滅菌時(shí)的稀釋（體積的增加），通常體積可增加20%左右，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，體積增加越多。實(shí)消實(shí)消n實(shí)消系將配制好的培養(yǎng)基用泵打入發(fā)酵罐,密閉攪拌,通入飽和蒸汽加熱,達(dá)到滅菌溫度(121)后,保溫滅菌約0.5h,滅菌完畢通入無(wú)菌空氣維持罐壓,然后由夾套或冷卻盤管通入冷卻水,冷卻到發(fā)酵所需溫度,保壓待種。n實(shí)消過程分為三個(gè)階段:n升溫

22、(培養(yǎng)基從室溫升至滅菌溫度)n保溫滅菌n冷卻(從滅菌溫度冷卻至發(fā)酵溫度)n培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后應(yīng)盡快冷卻至接種溫度,冷卻時(shí)間越長(zhǎng),培養(yǎng)基破壞程度越高。1.冷卻過程涉及三個(gè)要素:冷卻水、傳熱面積和傳熱效率。實(shí)消實(shí)消工藝操作要點(diǎn)：n滅菌之前,通常先把發(fā)酵罐的分空氣過濾器滅菌并且用空氣吹干。n開始滅菌時(shí),應(yīng)放出夾套和蛇管中的冷水,開啟排氣管閥,通過空氣管向罐內(nèi)的培養(yǎng)基通入蒸汽進(jìn)行加熱，同時(shí)，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進(jìn)行間接加熱。n當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到70左右時(shí),從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽,培養(yǎng)基溫度達(dá)120,罐壓達(dá)1105Pa(表壓)時(shí),安裝在發(fā)酵罐封頭上發(fā)酵罐封頭上的接種、補(bǔ)料、消沫劑、酸、堿管道應(yīng)排汽,并調(diào)

23、節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門,使罐壓和溫度保持在這一水平進(jìn)行保溫3045min。工藝操作要點(diǎn)：n在保溫階段,凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道以及沖視鏡管都應(yīng)通入蒸汽,在液面上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽,這樣才能保證滅菌徹底,不留死角。n保溫結(jié)束后,依次關(guān)閉各排氣、進(jìn)汽閥門,待罐內(nèi)壓力略高于空氣壓力后,向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣,在引入無(wú)菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過濾器壓力，否則，培養(yǎng)基將倒流入過濾器內(nèi)。在夾套和蛇管中通入冷水,使培養(yǎng)基溫度降到所需溫度。n滅菌時(shí)，總蒸汽壓力要求不低于35個(gè)大氣壓，使用壓力不低于2個(gè)大氣壓。另外，還要避免死角。典型分批培養(yǎng)工藝流程圖 板式熱交換器滅菌裝置 事故n2002年9月5日衡陽(yáng)市

24、某啤酒廠釀造車間一臺(tái)容積100m3的不銹鋼發(fā)酵糖在清洗過程中發(fā)生收縮變形而吸癟，造成直接經(jīng)濟(jì)損失22萬(wàn)元的重大設(shè)備事故。50m3發(fā)酵罐失穩(wěn)事故事故分析n1事故情況n 1998年安陽(yáng)市某化工廠車間一臺(tái)50m3發(fā)酵罐在空罐消毒后水冷卻過程中突然失穩(wěn)。無(wú)傷亡事故，直接經(jīng)濟(jì)損失20余萬(wàn)元。n2事故原因分析n 現(xiàn)場(chǎng)勘察發(fā)現(xiàn)，該罐進(jìn)汽口和出汽門閥門關(guān)閉。冷卻水閥門敞開。這說(shuō)明，失穩(wěn)是在冷卻過程中發(fā)生的。n 許用壓力計(jì)算 100以下罐體就會(huì)承受外壓。外壓值等于大氣壓與水的飽和蒸汽壓之差。70以下水的飽和蒸汽壓與罐內(nèi)負(fù)壓值見附表。 實(shí)測(cè)筒體許用外壓力0.0832MPa。 比較上表不難看出，當(dāng)罐內(nèi)溫度降到60

25、以下后，罐體失穩(wěn)隨時(shí)都有可能發(fā)生。附：器皿的滅菌及無(wú)菌室的消毒附：器皿的滅菌及無(wú)菌室的消毒器皿的滅菌器皿的滅菌： 干熱空氣：干熱空氣： 160， 2 小時(shí)小時(shí)無(wú)菌室的消毒無(wú)菌室的消毒： 紫外光紫外光 化學(xué)藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀化學(xué)藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀+甲醛）甲醛）第二節(jié) 培養(yǎng)基的選擇和確定一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分二、培養(yǎng)基的用途三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇四、培養(yǎng)基成分的營(yíng)養(yǎng)與作用五、培養(yǎng)基確定方法一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分n微生物的營(yíng)養(yǎng)活動(dòng)，是依靠向外界分泌大量的酶將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，再借助細(xì)胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營(yíng)養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 n所有發(fā)酵培養(yǎng)基都

26、必須提供微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成所需的能源，包括碳源、氮源、碳源、氮源、無(wú)機(jī)元素、生長(zhǎng)因子無(wú)機(jī)元素、生長(zhǎng)因子及及水、水、氧氣氧氣等。對(duì)于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，除考慮上述微生物的需要外，還必須重視培養(yǎng)基原料的價(jià)格原料的價(jià)格和和來(lái)源來(lái)源。 微生物的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源 n（1）能源n 自養(yǎng)菌：光；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞鐵鹽。n 異養(yǎng)菌：碳水化合物等有機(jī)物，石油天然氣和石油化工產(chǎn)品，如醋酸。（2 2） 碳源（最主要的組成）碳源（最主要的組成） 常用的碳源有糖類，油脂，有機(jī)酸，低碳醇常用的碳源有糖類，油脂，有機(jī)酸，低碳醇n 1 1）在特殊條件下，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物氨基酸也）在特殊條件下，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物氨基酸也可作為碳源?？?/p>

27、作為碳源。n2 2）菌種不同對(duì)不同碳源的利用速度和效率也）菌種不同對(duì)不同碳源的利用速度和效率也不同。不同。n3 3）葡萄糖是碳源中最易利用的糖，可作為加）葡萄糖是碳源中最易利用的糖，可作為加速微生物生長(zhǎng)的一種有效的糖速微生物生長(zhǎng)的一種有效的糖. .n4 4） 糖蜜可省去蒸煮，糖化糖蜜可省去蒸煮，糖化n5 5） 淀粉質(zhì)原料也是常用的碳源，一般要經(jīng)過淀粉質(zhì)原料也是常用的碳源，一般要經(jīng)過菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被吸收利用，菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被吸收利用，可以克服葡萄糖代謝過快帶來(lái)的弊病。可以克服葡萄糖代謝過快帶來(lái)的弊病。n6 6） 油和脂肪，作為能源和碳源，利用脂肪油和脂肪，作為能源

28、和碳源，利用脂肪時(shí)要供給比糖代謝更多的氧，還會(huì)使時(shí)要供給比糖代謝更多的氧，還會(huì)使pHpH下降。下降。n7 7） 有機(jī)酸，利用有機(jī)酸，會(huì)使有機(jī)酸，利用有機(jī)酸，會(huì)使pHpH上升。上升。n8 8）正烷烴已用于發(fā)酵工業(yè)中。）正烷烴已用于發(fā)酵工業(yè)中。（3 3） 氮源氮源n主要用于構(gòu)成菌體的細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，主要用于構(gòu)成菌體的細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)，核酸等）和含氮代謝物。蛋白質(zhì)，核酸等）和含氮代謝物。分為：有機(jī)氮分為：有機(jī)氮 無(wú)機(jī)氮無(wú)機(jī)氮有機(jī)氮源有機(jī)氮源n植物來(lái)源：玉米槳、豆餅粉、大豆、花生餅粉、棉子餅粉、Pharmamedia和Proflo(均為棉子餅粉制品)n動(dòng)物來(lái)源：蛋白胨，水解干酪素、屠宰場(chǎng)廢棄

29、物，魚粉和酵母膏等 n其他：尿素，酒糟，廢菌體n1 1）在微生物分泌的蛋白酶作用下，分）在微生物分泌的蛋白酶作用下，分解為氨基酸而被吸收利用。解為氨基酸而被吸收利用。n2 2）除了含豐富的蛋白質(zhì)，多肽和游離）除了含豐富的蛋白質(zhì)，多肽和游離氨基酸外，還有少量的糖，脂肪，無(wú)氨基酸外，還有少量的糖，脂肪，無(wú)機(jī)鹽，維生素及生長(zhǎng)因子。微生物利機(jī)鹽，維生素及生長(zhǎng)因子。微生物利用生長(zhǎng)旺盛。用生長(zhǎng)旺盛。n3 3）有些微生物對(duì)氨基酸有特殊需求，）有些微生物對(duì)氨基酸有特殊需求，可用有機(jī)氮來(lái)代替。可用有機(jī)氮來(lái)代替。n4 4） 氮源的來(lái)源對(duì)發(fā)酵影響很大，經(jīng)常氮源的來(lái)源對(duì)發(fā)酵影響很大，經(jīng)常需要搖瓶小試需要搖瓶小試。n尿

30、素：尿素： 常用的有機(jī)氮，相對(duì)單一。常用的有機(jī)氮，相對(duì)單一。 流加時(shí)溫度不宜過高，否則游流加時(shí)溫度不宜過高，否則游離氨過多，使離氨過多，使pHpH升高，一般在培養(yǎng)基冷升高，一般在培養(yǎng)基冷卻后加入。卻后加入。n有機(jī)氮有些還可作為產(chǎn)物的前體。有機(jī)氮有些還可作為產(chǎn)物的前體。無(wú)機(jī)氮源無(wú)機(jī)氮源n無(wú)機(jī)氮常用無(wú)機(jī)氮常用氨氣（氨水）氨氣（氨水）、銨鹽如硫酸銨或硝、銨鹽如硫酸銨或硝酸鹽。酸鹽。與有機(jī)氮相比，無(wú)機(jī)氮更容易吸收利用，另一方與有機(jī)氮相比，無(wú)機(jī)氮更容易吸收利用，另一方面，無(wú)機(jī)氮的利用會(huì)引起面，無(wú)機(jī)氮的利用會(huì)引起pHpH的變化。的變化。 在在銨離子銨離子被利用后，游離出酸，而使培養(yǎng)被利用后，游離出酸，而使

31、培養(yǎng)液呈酸性；液呈酸性； 硝酸鹽硝酸鹽在被代謝后，則呈現(xiàn)堿性。在被代謝后，則呈現(xiàn)堿性。 硝酸銨硝酸銨首先由于銨被利用而呈現(xiàn)出酸性，首先由于銨被利用而呈現(xiàn)出酸性，硝酸鹽的同化作用被抑制，待銨耗盡后，才開始硝酸鹽的同化作用被抑制，待銨耗盡后，才開始利用硝酸根作氮源，培養(yǎng)基呈現(xiàn)堿性。利用硝酸根作氮源，培養(yǎng)基呈現(xiàn)堿性。n生理酸性物質(zhì)生理酸性物質(zhì) 經(jīng)微生物代謝后形成酸性物質(zhì)的經(jīng)微生物代謝后形成酸性物質(zhì)的無(wú)機(jī)氮源，如硫酸銨。無(wú)機(jī)氮源，如硫酸銨。n生理堿性物質(zhì)生理堿性物質(zhì) 經(jīng)微生物代謝后形成堿性物質(zhì)的經(jīng)微生物代謝后形成堿性物質(zhì)的無(wú)機(jī)氮源，如硝酸鈉無(wú)機(jī)氮源，如硝酸鈉n正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對(duì)穩(wěn)定和正確使用生

32、理酸堿性物質(zhì)，對(duì)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pHpH有積極作用。有積極作用。如：制備液體曲，選用NaNO3 曲霉生產(chǎn)糖化型淀粉酶，選用(NH4)2SO4n氨水除了作氨水除了作N N源外，也起調(diào)節(jié)源外，也起調(diào)節(jié)pHpH的作用，的作用，且堿性較強(qiáng)，其中有嗜堿微生物，使且堿性較強(qiáng)，其中有嗜堿微生物，使用前應(yīng)過濾。用前應(yīng)過濾。（4 4） 碳氮比（碳氮比（C/N)C/N)n碳元素總量與氮元素總量之比。碳元素總量與氮元素總量之比。nC/NC/N影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的代謝，還能調(diào)節(jié)影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的代謝，還能調(diào)節(jié)pHpH。所以碳源與氮源的應(yīng)用應(yīng)有一個(gè)合適的比例。所以碳源與氮源的應(yīng)用應(yīng)有一個(gè)合適的比

33、例。n 例如例如：黃源膠（：黃源膠（Xanthan GumXanthan Gum發(fā)酵）：前期，較低的發(fā)酵）：前期，較低的C/NC/N，目的是強(qiáng)化菌體的生長(zhǎng)和增殖：但是，在黃源膠的，目的是強(qiáng)化菌體的生長(zhǎng)和增殖：但是，在黃源膠的生物合成期，則需要較高的生物合成期，則需要較高的C/NC/N，假如在這一時(shí)期，培養(yǎng)，假如在這一時(shí)期，培養(yǎng)基中氮源仍然很高，其導(dǎo)致的發(fā)酵結(jié)果是，底物消耗了基中氮源仍然很高，其導(dǎo)致的發(fā)酵結(jié)果是，底物消耗了但產(chǎn)物的產(chǎn)率卻很低。但產(chǎn)物的產(chǎn)率卻很低。 n不同菌種，不同時(shí)期（生長(zhǎng)階段），甚不同菌種，不同時(shí)期（生長(zhǎng)階段），甚至不同培養(yǎng)方式，對(duì)至不同培養(yǎng)方式，對(duì)C/NC/N的要求不同。的要

34、求不同。n最適最適C/NC/N還與最適還與最適pHpH有關(guān)。有關(guān)。（5 5） 無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽n微生物在生長(zhǎng)繁殖和代謝中，都需要無(wú)機(jī)鹽，微生物在生長(zhǎng)繁殖和代謝中，都需要無(wú)機(jī)鹽，無(wú)機(jī)鹽提供多種金屬元素和非金屬元素。無(wú)機(jī)鹽提供多種金屬元素和非金屬元素。nP, Mg, S, K, Na, Fe, Cl, Mn, Zn, CoP, Mg, S, K, Na, Fe, Cl, Mn, Zn, Co等作等作為生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)為生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物，一般在低濃度時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成物，一般在低濃度時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用，但高濃度時(shí)常表現(xiàn)出明顯的抑制有促進(jìn)

35、作用，但高濃度時(shí)常表現(xiàn)出明顯的抑制作用。作用。n磷（磷（P P）n 培養(yǎng)基中特別重要的元素，是構(gòu)成培養(yǎng)基中特別重要的元素，是構(gòu)成核酸，磷脂的成分，并參與核酸，磷脂的成分，并參與ATP,GTPATP,GTP的能量的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)。轉(zhuǎn)移反應(yīng)。n 一般需添加磷酸鹽，如一般需添加磷酸鹽，如KHKH2 2POPO4 4, K, K2 2HPOHPO4 4, , NaHNaH2 2POPO4 4, (NH, (NH4 4) )2 2HPOHPO4 4n硫：硫：n 含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸）等的組成部分，輔酶的活性基。蛋氨酸）等的組成部分，輔酶的活性基。n 一般添加一

36、般添加NaNa2 2SOSO4 4, MgSO, MgSO4 4, , nK, Na, CaK, Na, Ca 雖不參與細(xì)胞的組成，卻是培養(yǎng)基雖不參與細(xì)胞的組成，卻是培養(yǎng)基中的重要成分。中的重要成分。 Na Na 與維持細(xì)胞的滲透壓有關(guān)，促使某與維持細(xì)胞的滲透壓有關(guān)，促使某些酶的產(chǎn)量。些酶的產(chǎn)量。 K K 與滲透壓有關(guān)，并且是許多酶的激與滲透壓有關(guān)，并且是許多酶的激活劑，還可促進(jìn)糖代謝。活劑，還可促進(jìn)糖代謝。nCaCa2+2+ 以離子狀態(tài)控制細(xì)胞透性和調(diào)節(jié)酸度。以離子狀態(tài)控制細(xì)胞透性和調(diào)節(jié)酸度。 CaCOCaCO3 3的作用：的作用：n CaCa2+2+ 對(duì)淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等多種酶對(duì)淀粉

37、酶，蛋白酶，脂肪酶等多種酶活性起到十分重要的穩(wěn)定和活化作用?；钚云鸬绞种匾姆€(wěn)定和活化作用。n常用常用CaCOCaCO3 3, CaCl, CaCl2 2提供鈣，一般不與提供鈣，一般不與K K2 2HPOHPO4 4一一起使用。起使用。n使用時(shí)，使用時(shí)， CaCOCaCO3 3是單獨(dú)滅菌，在培養(yǎng)基調(diào)到是單獨(dú)滅菌，在培養(yǎng)基調(diào)到中性后才加入，在酸性培養(yǎng)基中易被分解，中性后才加入，在酸性培養(yǎng)基中易被分解，失去其緩沖能力。失去其緩沖能力。nMgMgn 某些細(xì)胞的葉綠素成分，是許多重要某些細(xì)胞的葉綠素成分，是許多重要酶的激活劑，常用酶的激活劑，常用MgSOMgSO4 4，注意在堿性溶液注意在堿性溶液中

38、會(huì)生成沉淀。中會(huì)生成沉淀。nFeFen 細(xì)胞色素，細(xì)胞色素氧化酶，過氧化細(xì)胞色素，細(xì)胞色素氧化酶，過氧化氫酶的成分，對(duì)代謝產(chǎn)物的合成有較大影氫酶的成分，對(duì)代謝產(chǎn)物的合成有較大影響。響。nClCln 氯離子不具營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)一些含氯代氯離子不具營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)一些含氯代謝物的發(fā)酵，還需加入謝物的發(fā)酵，還需加入0.1%KCl0.1%KCl補(bǔ)充。補(bǔ)充。n其他一些微量元素，其他一些微量元素，n Mn, Zn, CoMn, Zn, Co等，一般不需再加入等，一般不需再加入（6 6） 生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子n 凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)都稱為生長(zhǎng)因子。n 包括：維生素，生物素，嘌呤堿，嘧啶堿，氨基酸等。n維

39、生素，主要是B族維生素的硫胺素，核黃素，泛酸，吡哆素，煙酰胺，葉酸，環(huán)己六醇，生物素，多為輔基，輔酶。n發(fā)酵工業(yè)廣泛使用的大多是天然原料，如玉米漿，麥芽汁，豆芽汁，酵母膏等，既是N源，又可提供生長(zhǎng)因子。n除了水以外，以上是培養(yǎng)基的基本組成，包括四個(gè)方面。（7 7） 前體促進(jìn)劑和抑制劑前體促進(jìn)劑和抑制劑n 發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入不促進(jìn)微發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，只是有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，生物的生長(zhǎng)，只是有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，這些添加的物質(zhì)包括前體，抑制劑和促進(jìn)劑。這些添加的物質(zhì)包括前體，抑制劑和促進(jìn)劑。前體物質(zhì)前體物質(zhì)n指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能被指某些化合物加入

40、到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，其自身結(jié)構(gòu)并無(wú)多大變化，但產(chǎn)量中去，其自身結(jié)構(gòu)并無(wú)多大變化，但產(chǎn)量卻因前體的加入有較大提高。卻因前體的加入有較大提高。n前體加入量可以通過計(jì)算確定。前體加入量可以通過計(jì)算確定。抑制劑抑制劑n加入后會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，使另一途加入后會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，使另一途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種代謝產(chǎn)物，徑活躍，從而獲得人們所需要的某種代謝產(chǎn)物，或使正常代謝的某一代謝中間物積累。或使正常代謝的某一代謝中間物積累。n最初應(yīng)用于甘油發(fā)酵，抗生素工業(yè)應(yīng)用最多。最初應(yīng)用于甘油發(fā)酵，抗生素工業(yè)應(yīng)用最多

41、。促進(jìn)劑促進(jìn)劑n指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物，又不是前體，但能指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物，又不是前體，但能提高產(chǎn)量的添加劑，如酶生產(chǎn)中的誘導(dǎo)物提高產(chǎn)量的添加劑，如酶生產(chǎn)中的誘導(dǎo)物或表面活性劑等?；虮砻婊钚詣┑?。n誘導(dǎo)劑能增加細(xì)胞的產(chǎn)酶速度，提高產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑能增加細(xì)胞的產(chǎn)酶速度，提高產(chǎn)酶量量n但不能從根本上改變細(xì)胞原有的蛋白質(zhì)模但不能從根本上改變細(xì)胞原有的蛋白質(zhì)模板，包括酶的底物，底物類似物，及被轉(zhuǎn)板，包括酶的底物，底物類似物，及被轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)物的前體物質(zhì)?；癁檎T導(dǎo)物的前體物質(zhì)。n表面活性劑（洗滌劑，吐溫等）表面活性劑（洗滌劑，吐溫等） 可以增加酶的產(chǎn)量，機(jī)理不十分清楚，可以增加酶的產(chǎn)量，機(jī)理不十分清楚，一般認(rèn)為是因

42、為：一般認(rèn)為是因?yàn)椋簄 1 1 改變了細(xì)胞膜的通透性改變了細(xì)胞膜的通透性n 2 2 同時(shí)增強(qiáng)了氧的傳遞速度，改變了菌同時(shí)增強(qiáng)了氧的傳遞速度，改變了菌體對(duì)氧的有效利用。體對(duì)氧的有效利用。促進(jìn)劑的作用（舉例）促進(jìn)劑的作用（舉例）1 1 可能起生長(zhǎng)因素的作用，如某些植物刺激劑可能起生長(zhǎng)因素的作用，如某些植物刺激劑可促進(jìn)某些放線菌的生長(zhǎng)發(fā)育?？纱龠M(jìn)某些放線菌的生長(zhǎng)發(fā)育。2 2 鏈霉素發(fā)酵時(shí)，加入巴比妥藥物，可提高菌鏈霉素發(fā)酵時(shí)，加入巴比妥藥物，可提高菌絲抗自溶能力，推遲菌體自溶。絲抗自溶能力，推遲菌體自溶。3 3 抑制某些合成其他產(chǎn)物的途徑，如四環(huán)素發(fā)抑制某些合成其他產(chǎn)物的途徑，如四環(huán)素發(fā)酵中加入酵中

43、加入NaBrNaBr抑制金霉素的生成。抑制金霉素的生成。4 4 有的降低了產(chǎn)生菌的呼吸，使之有利于抗有的降低了產(chǎn)生菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成。如四環(huán)素發(fā)酵中加入硫氰化生素的合成。如四環(huán)素發(fā)酵中加入硫氰化芐。芐。5 5 有的可改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣有的可改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣效果。效果。6 6 有的與抗生素形成復(fù)鹽，從而降低發(fā)酵液有的與抗生素形成復(fù)鹽，從而降低發(fā)酵液中抗生素的濃度，促進(jìn)抗生素的合成。中抗生素的濃度，促進(jìn)抗生素的合成。 發(fā)酵過程中發(fā)酵過程中促進(jìn)劑促進(jìn)劑的用量極微，的用量極微，而且專一性較強(qiáng)，往往不可相互而且專一性較強(qiáng)，往往不可相互套用。套用。二、培養(yǎng)基的用途

44、n篩選菌種篩選菌種n保藏菌種保藏菌種n檢驗(yàn)雜菌檢驗(yàn)雜菌n培養(yǎng)種子培養(yǎng)種子n發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)n孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基n孢子培養(yǎng)基是供制備孢子用的.要求此培養(yǎng)基能使孢子迅速發(fā)芽和生長(zhǎng),能形成大量的孢子,但不引起菌種變異.n一般孢子培養(yǎng)基中的基質(zhì)濃度(特別是有機(jī)氮)要低些,否則影響孢子的形成.無(wú)機(jī)鹽濃度適量,否則影響孢子的數(shù)量和質(zhì)量.n種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基 n種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)繁殖用的.要求營(yíng)養(yǎng)成分易被菌體吸收利用,同時(shí)還要比較豐富和完整,其中氮源和維生素含量略高一些.n在設(shè)計(jì)種子培養(yǎng)基時(shí)還要考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基組成的關(guān)系,這樣種子進(jìn)入發(fā)酵罐后很快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境.n發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基n發(fā)酵培

45、養(yǎng)基是供菌體生長(zhǎng)繁殖和合成大量代謝產(chǎn)物用的.要求此培養(yǎng)基的組成豐富完整,營(yíng)養(yǎng)成分濃度適中,利于菌體生長(zhǎng)及合成大量的代謝產(chǎn)物.n發(fā)酵培養(yǎng)基還應(yīng)考慮在發(fā)酵過程中的各種生化代謝的協(xié)調(diào),使發(fā)酵液的PH保持相對(duì)穩(wěn)定.（一）、培養(yǎng)基的分類n（1）按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分 合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基。n（2）按物理性質(zhì) 固體，液體n（3）按用途 選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基等n（1）天然培養(yǎng)基n是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不恒定的各種植物和動(dòng)物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)(例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等)制成的。n適合于各類異養(yǎng)微生物生長(zhǎng)，而一般自養(yǎng)微生物都不能生長(zhǎng)。（2）合成培養(yǎng)基

46、n是用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，可以減少不能控制的因素n 適用于在實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析等定量研究工作。n 但一般微生物在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，有些微生物營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，在合成培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。（3）半合成培養(yǎng)基n多數(shù)培養(yǎng)基配制是采用一部分天然有機(jī)物作碳源、氮源和生長(zhǎng)因子的來(lái)源，再適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品以補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽成分，使其更能充分滿足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要。n大多數(shù)微生物都能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。因此，在微生物工業(yè)生產(chǎn)上和試驗(yàn)研究中被廣泛使用。n 液體培養(yǎng)基：常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及生理代謝等基本理論研究工作。n發(fā)酵工業(yè)多

47、用作培養(yǎng)種子和發(fā)酵的培養(yǎng)基。n根據(jù)微生物對(duì)氧的要求情況，分別作靜止或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。n在菌種篩選工作和菌種培養(yǎng)工作中，也常用液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)n微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的情況有時(shí)也可用作鑒定菌種的參考。生理代謝菌種篩選種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)n 固體培養(yǎng)基n分類：斜面試管、平板等n是在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑配成的，最常用的凝固劑是瓊脂。n作用作用：n固體培養(yǎng)基在菌種的分離、保藏、菌落特征的觀察、活菌計(jì)數(shù)和鑒定菌種方面是不可缺少的。n在制曲、酶制劑、檸檬酸等生產(chǎn)中，用來(lái)培養(yǎng)霉菌等的固體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基是由麩皮等農(nóng)作物加無(wú)機(jī)元素等制成的。n增殖培養(yǎng)基：可以配制成適合某種微生物生長(zhǎng)而不適合其他微生物生長(zhǎng)，

48、從而達(dá)到從自然界分離這種微生物的目的。n鑒別培養(yǎng)基：是根據(jù)微生物能否利用培養(yǎng)基中某種營(yíng)養(yǎng)成分，借助指示劑的顯色反應(yīng)，以鑒別不同種類的微生物。n選擇培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基內(nèi)加入某種化學(xué)物質(zhì)以抑制不需要菌的生長(zhǎng)，而促進(jìn)某種需要菌的生長(zhǎng)。n加富培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基中加入某些特殊的營(yíng)養(yǎng)物，如血、血清、動(dòng)、植物組織液或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（或生長(zhǎng)因子）的一類營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來(lái)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的微生物，或用以富集（數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)）和分離其中微生物.（二）、發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基類型 n工業(yè)發(fā)酵中培養(yǎng)基往往是依據(jù)生產(chǎn)流程和作用分為：n斜面培養(yǎng)基n種子培養(yǎng)基n發(fā)酵培養(yǎng)基n搖瓶培養(yǎng)基1斜面培養(yǎng)基n作用：這是供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)繁

49、殖用的，包括細(xì)菌，酵母等的斜面培養(yǎng)基以及霉菌、放線菌產(chǎn)孢子培養(yǎng)基或麩曲培養(yǎng)基等。這類培養(yǎng)基主要作用是供給細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。n特點(diǎn)：n1.富含有機(jī)氮源，少含或不含糖分。有機(jī)氮有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，能獲得更多的細(xì)胞。n2.對(duì)于放線菌或霉菌的產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，則氮源和碳源均不宜太豐富，否則容易長(zhǎng)菌絲而較少形成孢子。n3.斜面培養(yǎng)基中宜加少量無(wú)機(jī)鹽類，供給必要的生長(zhǎng)因子和微量元素。2 2種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基( (包括搖瓶種子和小罐種包括搖瓶種子和小罐種子培養(yǎng)基子培養(yǎng)基) )： n培養(yǎng)種子的目的：n擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量；n同時(shí)也必須培養(yǎng)出強(qiáng)壯、健康、活性高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進(jìn)行分裂或菌絲

50、快速生長(zhǎng)。n種子培養(yǎng)基特點(diǎn)：n1. 必須有較完全和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別需要充足的氮源和生長(zhǎng)因子。n2. 種子培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高。供孢子發(fā)芽生長(zhǎng)用的種子培養(yǎng)基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源碳源和氮源。n3. 種子培養(yǎng)基成分還應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。3發(fā)酵培養(yǎng)基n發(fā)酵培養(yǎng)基是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基，它不僅耗用大量的原材料，而且也是決定發(fā)酵生產(chǎn)成功與否的重要因素。n（1）根據(jù)產(chǎn)物合成的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基： 對(duì)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類型，充分滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最大的產(chǎn)物。 對(duì)于生產(chǎn)氨基酸等含氮的化合物時(shí)，它的發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加

51、足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的利用率，增加經(jīng)濟(jì)效益。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此，原料來(lái)源、原材料的質(zhì)量以及價(jià)格等必須予以重視。三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 n(1)必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分基本成分。n(2)有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。n(3)有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。n(4)有利于提高產(chǎn)物的合成速度提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期

52、。n(5)盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化。n(6)原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。n7)所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗。n(8)有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng) n 1提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分：培養(yǎng)基成分必須滿足細(xì)胞生長(zhǎng)，代謝活動(dòng)和合成產(chǎn)物所需的基本要求。n2配制合適的濃度：可以從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有關(guān)生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和基質(zhì)利用物料平衡的關(guān)系中大致推算所需原料或大致計(jì)算出所需主要原料的需要量。n3. 主成分與其他成分的配比。n4控制合適的pH：微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)物的合成往往需要定的pH環(huán)境，在最適pH

53、值下有利于加快各種酶的反應(yīng)。因此在整個(gè)發(fā)酵過程中應(yīng)使培養(yǎng)基的pH適合于微生物生長(zhǎng)或產(chǎn)物合成所需。發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng) pHpH的具體控制方法的具體控制方法n（1）. 可以在微生物培養(yǎng)過程中加入酸或堿或流加某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，但更應(yīng)在配制培養(yǎng)基時(shí)考慮所用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成成分，使其pH值適合該微生物生長(zhǎng)或合成代謝產(chǎn)物的需要。n（2）. 還要注意有些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用后培養(yǎng)基的pH變化情況.n（3）. 控制pH最常用的方法是在培養(yǎng)基中添加具有一定緩沖能力的物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物，如以磷酸鹽作為磷的成分；或者避免使用容易產(chǎn)生生理酸性或堿性使培養(yǎng)基pH波動(dòng)太大的物質(zhì)。n（4）避免產(chǎn)生微生物不能利用

54、的物質(zhì)或形成沉淀n葡萄糖與銨鹽或氨基酸的氨基在滅菌高溫下作用形成深褐色物質(zhì)。這種物質(zhì)不被微生物利用。因此這兩類營(yíng)養(yǎng)物不宜直接配在一起進(jìn)行滅菌，而應(yīng)采用分開滅菌后再加入發(fā)酵罐內(nèi)。n硫酸銨中的SO42-與鈣鹽易形成難溶的硫酸鈣，因此二者也不宜直接配成培養(yǎng)基。5注意代謝調(diào)節(jié)物的影響：n有些物質(zhì)存在于培養(yǎng)基中往往能明顯地促進(jìn)或抑制發(fā)酵產(chǎn)物的形成。前體物質(zhì)誘導(dǎo)劑阻遏物抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng) (1)添加有關(guān)前體物質(zhì)：n前作物質(zhì)：是指當(dāng)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化學(xué)物質(zhì)基本上不改變其分子結(jié)構(gòu)而直接進(jìn)入產(chǎn)物中的小分子物質(zhì)，從而在一定條件下控制產(chǎn)物的合成方向和提高產(chǎn)量。n在發(fā)酵中添加前體物質(zhì)將有利于

55、產(chǎn)物的合成和顯著提高產(chǎn)量，如苯乙酸及其衍生物被認(rèn)為是青霉素的前體物質(zhì)。(2)添加誘導(dǎo)物：n目前工業(yè)用微生物酶多數(shù)為誘導(dǎo)酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。n誘導(dǎo)物的存在能大大強(qiáng)化誘導(dǎo)酶的生物合成。n酶的正常底物或底物的類似物都可作為誘導(dǎo)物。n在各種微生物酶的發(fā)酵培養(yǎng)基中必須加入誘導(dǎo)物，例如淀粉、糊精或麥芽糖是淀粉酶或糖化酶的誘導(dǎo)物。只有添加這些物質(zhì)的培養(yǎng)基，才能獲得高產(chǎn)。(3)注意阻遏物或抑制劑的影響n培養(yǎng)基中存在反饋?zhàn)瓒粑锘蚍纸庾瓒粑锞苡绊懨傅暮铣?，降低發(fā)酵產(chǎn)量。n有些酶的抑制劑卻能提高某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，最早利用抑制劑提高中間代謝物產(chǎn)量的例子是甘油發(fā)酵中加入亞硫酸鈉。n在培養(yǎng)基配制時(shí)必須注

56、意加入有益的抑制劑，而避免混入有害的抑制物。n6. 金屬離子的影響：n有些種類的發(fā)酵生產(chǎn)對(duì)金屬離子相當(dāng)敏感，因?yàn)橛行┙饘匐x子是中間代謝酶的抑制劑或激活劑。n因此對(duì)于有重大影響的金屬離子必須嚴(yán)格控制。如檸檬酸發(fā)酵中鐵、錳和鋅離子都能明顯影響產(chǎn)量，鈣離子對(duì)細(xì)菌淀粉酶的生產(chǎn)有促進(jìn)作用，而鈷離子對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的發(fā)酵是必需的，這些在培養(yǎng)基配制時(shí)都必須予以注意。發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng) 四、培養(yǎng)基確定方法n（1）首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來(lái)源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營(yíng)養(yǎng)要求。n工業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求既有共性，也有各自的特性，應(yīng)根據(jù)不

57、同類型微生物的生理特性考慮培養(yǎng)基的組成。n（2）其次，對(duì)生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養(yǎng)基時(shí)做到心中有數(shù)。n（3）最好先選擇一種較好的化學(xué)合成培養(yǎng)基做基礎(chǔ)，開始時(shí)先做一些搖瓶試驗(yàn);n然后進(jìn)一步做小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，摸索菌種對(duì)各種主要有機(jī)碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。n注意培養(yǎng)過程中的pH變化，觀察適合于菌種生長(zhǎng)繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的兩種不同pH，不斷調(diào)整配比來(lái)適應(yīng)上述各種情況。n（4）注意每次只限一個(gè)變動(dòng)條件。有了初步結(jié)果以后，先確定一個(gè)培養(yǎng)基配比。n其次再確定各種重要的金屬和非金屬離子

58、對(duì)發(fā)酵的影響，即對(duì)各種無(wú)機(jī)元素的營(yíng)養(yǎng)要求，試驗(yàn)其最高、最低和最適用量。n在合成培養(yǎng)基上得出一定結(jié)果后，再做復(fù)合培養(yǎng)基試驗(yàn)。n最后試驗(yàn)各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。培養(yǎng)基內(nèi)pH可由添加碳酸鈣來(lái)調(diào)節(jié)，其他如硝酸鈉、硫酸銨也可用來(lái)調(diào)節(jié)。n（5） 有些發(fā)酵產(chǎn)物，如抗生素等，除了配制培養(yǎng)基以外，還要通過中間補(bǔ)料法，一面對(duì)碳及氮的代謝予以適當(dāng)?shù)目刂疲幻骈g歇添加各種養(yǎng)料和前體類物質(zhì)，引導(dǎo)發(fā)酵走向合成產(chǎn)物的途徑。n（6）根據(jù)生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要選擇培養(yǎng)基n 工業(yè)上，液體深層培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)具有占地面積小、發(fā)酵效率高、操作方便、易于機(jī)械化相自動(dòng)化生產(chǎn)、降低勞動(dòng)強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)。所以，發(fā)酵工業(yè)中大多采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)種

59、子和進(jìn)行液體發(fā)酵n根據(jù)微生物對(duì)氧氣的要求，分別作表面靜止培養(yǎng)或深層通氣培養(yǎng)。n實(shí)驗(yàn)室或制種車間進(jìn)行固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)常采用試管、扁瓶和培養(yǎng)皿。工業(yè)生產(chǎn)中也常采用固體原料，如小米、大米、麩皮、馬鈴薯等直接制作斜面，或在茄子瓶表面培養(yǎng)霉菌、放線菌。n具有設(shè)備簡(jiǎn)單、投資少、易推廣等優(yōu)點(diǎn)。n大規(guī)模生產(chǎn)中，固體培養(yǎng)的缺點(diǎn)是占地面積多，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)穩(wěn)定性差。n(7)根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益選擇培養(yǎng)基原料n考慮經(jīng)濟(jì)節(jié)約，盡量少用或不用主糧，努力節(jié)約用糧，或以其他原料代糧。n糖類是主要的碳源。碳源的代用方向主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業(yè)葡萄糖代替食用葡萄糖。n石油作為碳源的微生物

60、,發(fā)酵不但可以生產(chǎn)以糧食為碳源的發(fā)酵產(chǎn)品。n有機(jī)氮源的節(jié)約和代替:主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質(zhì)的原料。n代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業(yè)下腳料等。這些代用品大多蛋白質(zhì)含量豐富，貨源充足，價(jià)格低廉，便于就地取材，方便運(yùn)輸。第三節(jié) 培養(yǎng)工藝的確定方法 n一、培養(yǎng)條件n二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)一、培養(yǎng)條件溫度 pH值 氧種齡接種量1溫度 n通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10，生長(zhǎng)速度就加快一倍，溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。 n機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核