DNA測序分析常見問題整理ppt課件

1、Applied Biosystems 3730/3730 xlDNA AnalyzersDNADNA測序分析常見問題整理測序分析常見問題整理1;.2測序結(jié)果測序結(jié)果峰圖峰圖四色圖譜：每一種顏色對應(yīng)一種堿基四色圖譜：每一種顏色對應(yīng)一種堿基ATC G3 引物引物 DNA模板模板 純化純化 困難模板困難模板 機(jī)器影響機(jī)器影響 影響測序質(zhì)量的主要因素影響測序質(zhì)量的主要因素4 一、引物對測序結(jié)果的影響一、引物對測序結(jié)果的影響 引物合成時多（少）一個堿基引物合成時多（少）一個堿基 引物不純引物不純 模板上沒有引物結(jié)合位點(diǎn)模板上沒有引物結(jié)合位點(diǎn) 引物二聚體引物二聚體 雙引物結(jié)合雙引物結(jié)合5合成時部分引物合成

2、時部分引物多一個堿基多一個堿基合成時部分引物合成時部分引物少一個堿基少一個堿基 現(xiàn)象：每個峰后面有個同樣熒光信號的小“尾巴”。 原因：合成時引物多一個堿基。 對策：重新合成引物 現(xiàn)象：每個峰前面有個同樣熒光信號的小“尾巴”。 原因：合成時引物多一個堿基。 對策：重新合成引物6引物（模板）不純引物（模板）不純 現(xiàn)象：整個峰圖噪音都比較高。（區(qū)別與小片段的干擾） 原因：引物（模板）純度太低，含有較多雜質(zhì) 對策：建議使用HPLC（柱子純化）或PAGE 純化的測序引物。脫鹽純化的引物純度較低，適合做普通PCR，但不建議用來測序。7模板上沒有引物結(jié)合位點(diǎn)模板上沒有引物結(jié)合位點(diǎn) 現(xiàn)象：沒有特異性的測序峰圖

3、 原因：引物無法結(jié)合模板 對策重新設(shè)計(jì)引物8引物二聚體引物二聚體 現(xiàn)象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚體片段小大在100bp左右） 原因：引物二聚體未去除干凈 對策：割膠純化9雙引物結(jié)合雙引物結(jié)合 現(xiàn)象：從一開始（區(qū)別于非單克?。┚统霈F(xiàn)兩套峰 原因：模板有兩個引物結(jié)合位點(diǎn)，同時和兩個引物結(jié)合 對策：重新設(shè)計(jì)單個引物10 二、模板對測序結(jié)果的影響二、模板對測序結(jié)果的影響 模板不純模板不純 點(diǎn)突變（點(diǎn)突變（SNP） 移碼突變移碼突變 雜合子雜合子 非單克隆非單克隆11噪音信號高噪音信號高終止峰PCR正常終止后面的噪音峰PCR正常終止正常模板與噪音正常模板與噪音12模板不純（非特異性模板

4、不純（非特異性PCR產(chǎn)物）產(chǎn)物） 現(xiàn)象：每個峰下面都有其它顏色 原因：PCR主帶與雜帶混在一起測序 對策：凝膠電泳回收主帶，重新測序割膠純化割膠純化13點(diǎn)突變（點(diǎn)突變（SNP）突變點(diǎn)突變點(diǎn)如果模板有單核苷酸（堿基）突變（如果模板有單核苷酸（堿基）突變（SNP），測序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的），測序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰峰形，然后突然在某一個位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示如圖中箭頭所示)。 14移碼突變移碼突變在450bp處因點(diǎn)突變導(dǎo)致移碼，在528bp處又因點(diǎn)突變恢復(fù)15雜合子雜合子雜合變點(diǎn)雜合變點(diǎn)雜合信號處的套峰強(qiáng)度大小相等，都相當(dāng)于正常峰值

5、的一半。16非單克隆非單克隆特征：特征：左邊清晰，右邊全部像雜合子左邊清晰，右邊全部像雜合子原因：挑克隆時兩個質(zhì)?；煸谝黄鹪颍禾艨寺r兩個質(zhì)?；煸谝黄饘Σ撸盒绿艨寺?，重新制對策：新挑克隆，重新制DNA17 三、純化對測序結(jié)果的影響三、純化對測序結(jié)果的影響 染料峰染料峰 酒精峰酒精峰 熒光物質(zhì)污染熒光物質(zhì)污染 釘子峰釘子峰 有機(jī)物污染（瀑布效應(yīng)）有機(jī)物污染（瀑布效應(yīng)）18染料峰染料峰特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是殘余的A、T、C、G、4個BigDye峰，其不影響其它序列的可靠性。19酒精峰酒精峰特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp堿基之間，圖譜被“透明”抬高，其同樣不影響其

6、它序列的可靠性。20熒光物質(zhì)污染熒光物質(zhì)污染 現(xiàn)象：紅色峰異常高。 原因：未知大分子熒光物質(zhì)污染，恰好是紅色，被軟件誤認(rèn)為紅色峰。 對策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。21“釘子釘子”峰峰 現(xiàn)象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形銳利。 原因：毛細(xì)管內(nèi)有氣泡、灰塵、尿素結(jié)晶等，對激光全反射。 對策 灌膠時，避免氣泡產(chǎn)生； 上樣前，樣品先離心； 毛細(xì)管、檢測窗口保持清潔； 膠內(nèi)有尿素結(jié)晶時，注意不要吸進(jìn)注射器； 樣品純化干凈。22有機(jī)物污染（瀑布效應(yīng)）有機(jī)物污染（瀑布效應(yīng)） 現(xiàn)象：基線從高處突然下降。 原因：有機(jī)物進(jìn)入毛細(xì)管，受激發(fā)產(chǎn)生一定波長的熒光，抬高基線。

7、 對策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。23 四、困難模板對測序結(jié)果的影響四、困難模板對測序結(jié)果的影響 特殊結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu) Ploy結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 高高GC 重復(fù)序列重復(fù)序列 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)24特殊結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu)25Poly結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)Poly在序列的前端對信號影響較小, Poly在序列的后端對信號影響較大。Poly-G/poly-C 很容易導(dǎo)致信號中斷和信號亂。26高高GCPoly-G/poly-C 是高是高GC的一種，很容易導(dǎo)致信號衰減。的一種，很容易導(dǎo)致信號衰減。局部高局部高GC一般會導(dǎo)致信號中斷和亂峰。一般會導(dǎo)致信號中斷和亂峰。27重復(fù)序列重復(fù)序列GT 重復(fù)導(dǎo)致信號衰減重復(fù)導(dǎo)致信號衰減A/G重復(fù)導(dǎo)致信號衰減重復(fù)導(dǎo)致信號衰減或信號亂或信號亂28回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)其他復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)也會導(dǎo)致衰