循環(huán)DNA的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

1、循環(huán)dna的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展摘 要：循環(huán)dna（circulating dna）是存在于血液（血漿或血清）、滑膜液、腦脊液等體液中的細(xì)胞外dna，其量和性質(zhì)的改變?cè)谀[瘤、感染性疾病、產(chǎn)前診斷、創(chuàng)傷和自身免疫性疾病的診斷和預(yù)后判斷以及器官移植的監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義。關(guān)鍵詞：循環(huán)dna 診斷 預(yù)后早在1948年，法國(guó)學(xué)者mandel和metais1便發(fā)現(xiàn)了人類血液循環(huán)系統(tǒng)中游離于細(xì)胞外的核酸物質(zhì)循環(huán)dna的存在。但在其后的近30年時(shí)間內(nèi)，對(duì)于循環(huán)dna的研究只局限于自身免疫性疾病2，而且，其定量檢測(cè)也僅僅限于基于dna抗體的放射免疫技術(shù)3、4。1975年，steinman5等采用四種不同的檢測(cè)方

2、法確定正常成年人血漿血清dna含量在10-30ng/ml范圍內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)，循環(huán)dna含量高于100ng/ml提示疾病的存在。之后，隨著生物技術(shù)飛速發(fā)展，多種靈敏的dna定量檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，包括：缺口平移法6、競(jìng)爭(zhēng)pcr7、熒光檢測(cè)法8，紫外分光光度法9和實(shí)時(shí)熒光定量pcr8等。技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了循環(huán)dna的研究（圖1），大量文獻(xiàn)表明，各種類型疾病患者血漿血清dna存在量和性質(zhì)的改變，這些變化具有很大的臨床意義和診斷價(jià)值。圖1 pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)搜索循環(huán)dna相關(guān)文章，顯示其數(shù)量不斷增長(zhǎng)搜索詞：("dna/blood"mesh or "dna/cerebrospina

3、l fluid"mesh or "dna/secretion"mesh or "dna/urine"mesh)一、腫瘤循環(huán)dna的臨床應(yīng)用價(jià)值在腫瘤方面研究最多，特別是對(duì)于缺乏可靠診斷方法的實(shí)體瘤。方便無(wú)創(chuàng)的樣本取材使得循環(huán)dna成為最具發(fā)展前景的檢測(cè)對(duì)象。循環(huán)dna定量檢測(cè)1977年，leon等4首次報(bào)道腫瘤患者循環(huán)dna水平顯著高于正常人，且與病人的預(yù)后及療效有關(guān)。此后的大量研究都證實(shí)了這一點(diǎn)，并且顯示了一定的臨床意義（表1）。1983年，shapiro等10采用放射免疫法對(duì)良惡性胃腸道疾病患者血清dna進(jìn)行定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)惡性患者血清dna

4、含量（412 ng/ml）顯著高于良性患者（118 ng/ml），雖然其水平與腫瘤大小及部位無(wú)關(guān)，但聯(lián)合cea檢測(cè)，對(duì)于消化道腫瘤，特別是胰腺癌的診斷，具有很高的敏感性和特異性。1990年，maebo11采用斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)肺癌病人血漿dna含量，結(jié)果顯示，肺癌患者、良性肺疾病患者和正常人這三者之間存在顯著差異，且可用于療效監(jiān)測(cè)，當(dāng)聯(lián)合血清cea，檢測(cè)敏感性達(dá)78%。1995年，fourniÉ等12以缺口平移標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿dna含量顯著高于正常對(duì)照，iv期肺癌患者血漿dna含量顯著高于其他分期患者。雖然早期定量檢測(cè)技術(shù)的敏感性較低，但多數(shù)結(jié)果顯示了循環(huán)dna含量在正常與腫瘤

5、之間的差異，為后期的研究奠定了基礎(chǔ)?？萍嫉难该桶l(fā)展為循環(huán)dna定量研究提供了嶄新的技術(shù)平臺(tái)，1996年，heid13研究報(bào)道了用于核酸定量檢測(cè)的新技術(shù)熒光定量pcr（real time quantitative pcr）。二十一世紀(jì)，以實(shí)時(shí)熒光定量pcr為主要技術(shù)的dna定量方法已被廣泛應(yīng)用。2002年，thijssen 8等同時(shí)采用熒光定量法和實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)定量測(cè)定結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者血清血漿dna水平，發(fā)現(xiàn)血清dna含量升高與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，而根據(jù)血漿dna水平可判斷患者的預(yù)后。2003年，sozzi等14以htert基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)衡量肺癌患者循環(huán)dna水平，結(jié)果顯示，肺癌患者血漿dna平均

6、含量（24.3ng/ml）高于正常對(duì)照（3.1ng/ml），roc曲線下面積為0.94，能很好的區(qū)分腫瘤與正常。2004年，allen 15和gal16則針對(duì)人類-globin基因分別確定前列腺癌和乳腺癌患者循環(huán)dna含量，前者研究表明，循環(huán)dna水平可作為良惡性前列腺疾病診斷的指標(biāo)，以1000 ge/ml為cutoff值，診斷敏感性為85%，特異性為73%；而以血清dna含量221 ng/ml為cutoff值，可作為乳腺癌患者預(yù)后指標(biāo)。同年，對(duì)肺癌患者血漿dna研究17顯示血漿dna定量檢測(cè)可作為肺癌的篩查實(shí)驗(yàn)；gautschi等的研究18表明非小細(xì)胞肺癌患者血漿dna與臨床分期及生存相關(guān)；

7、camps herrero c等19采用分光光度法對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血清dna定量檢測(cè)的結(jié)果亦與臨床分期有關(guān)。然而，最近的研究結(jié)果不容樂(lè)觀。2005年，分別對(duì)前列腺癌20、胸部惡性腫瘤21及乳腺癌患者22循環(huán)dna的定量研究顯示，標(biāo)本的收集和處理、dna提取及檢測(cè)方法對(duì)于dna定量結(jié)果影響很大，而且由于缺乏高敏感性和特異性，僅能作為輔助檢測(cè)方法，卻無(wú)臨床診斷價(jià)值。表1 腫瘤循環(huán)dna定量研究結(jié)果疾病類型樣本類型檢測(cè)方法dna含量(ng/ml)臨 床 意 義文獻(xiàn)時(shí)間正常人血漿熒光檢測(cè)法13.9 ± 3.7 mg/liter1601972正常成年人血漿、血清二苯胺法溴乙非啶法 雜交法逆向

8、免疫電泳法 二苯胺法（27）：10 溴乙非啶法（16）：5 雜交法（16）：0.1 逆向免疫電泳法（24）：0.05循環(huán)dna含量高于100ng/ml提示疾病的存在51975各種類型腫瘤血清放射免疫法腫瘤患者（173）：180正常人（55）：13與腫瘤轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后及療效相關(guān)，但50%腫瘤患者的dna水平在正常人群范圍內(nèi)，因此該檢測(cè)方法診斷價(jià)值不高。41977胃腸道良惡性疾病血清放射免疫法良性（186）：118惡性（200）：412 惡性患者血清dna含量顯著高于良性患者；該方法對(duì)于胰腺癌的檢測(cè)靈敏度高；聯(lián)合cea可提高敏感性和特異性101983肺癌血漿斑點(diǎn)雜交法肺癌（45）：？良性肺疾?。?

9、4）：？正常（59）：？肺癌患者血漿dna含量顯著高于良性疾病患者及正常人；良性疾病患者血漿dna含量顯著高于正常人；以80 ng/ml 為截點(diǎn)，71%肺癌患者血漿dna高于此值，良性患者為37% ，所有正常人均低于80 ng/ml；聯(lián)合cea，檢測(cè)敏感性達(dá)78%；與療效相關(guān)111990肺癌血漿斑點(diǎn)雜交法肺癌（68）：30 正常（？）：10 肺癌患者血漿dna含量顯著高于正常對(duì)照；與患者分期有關(guān)；與血清ldh、nse相關(guān)；與患者生存相關(guān)；超過(guò)100 ng/ml提示預(yù)后差121995結(jié)直腸腫瘤血漿、血清實(shí)時(shí)熒光定量pcr熒光定量檢測(cè)結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移（26）：？正常（28）：？血清dna含量明顯高

10、于血清，可能與凝血有關(guān)；血清dna含量升高與間接的，腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)；而血漿dna水平更能真實(shí)的反映體內(nèi)情況82002肺癌血漿實(shí)時(shí)熒光定量pcr非小細(xì)胞肺癌（100）：24.3正常（100）：3.1肺癌患者血漿dna含量高于正常吸煙對(duì)照組，可用于肺癌診斷，并具有篩查價(jià)值142003前列腺癌血漿實(shí)時(shí)熒光定量pcr良性前列腺增生（10）：936 ge/ml前列腺腺癌（15）：1734 ge/ml前列腺內(nèi)皮增生（12）：1780 ge/ml有助于良惡性前列腺疾病的診斷，以1000 ge/ml為cutoff值，診斷敏感性為85%，特異性為73%152004乳腺癌血清實(shí)時(shí)熒光定量pcr乳腺癌（96）：221

11、正常（24）：63乳腺癌患者血清dna含量高于正常；與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與病理及分期無(wú)關(guān)；以血清dna含量221 ng/ml為cutoff值，可作為乳腺癌患者預(yù)后指標(biāo)162004肺癌血漿熒光免疫法（pico green dsdna quantitation kit）肺癌（67）：110.7良性肺疾病（36）：45.5正常（44）：11.6肺癌患者、良性肺疾病患者和正常人血漿dna含量均有顯著性差異；血漿dna定量檢測(cè)可作為肺癌的篩查實(shí)驗(yàn)172004非小細(xì)胞肺癌血漿、血清實(shí)時(shí)熒光定量pcr肺癌（185）：？正常（46）：？肺癌患者血漿dna含量與血清ldh水平、臨床分期及生存相關(guān)；血清d

12、na含量與白細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)182004非小細(xì)胞肺癌血清紫外分光光度法肺癌（78）： 408.75(stage iiib) 478.74(stage iv)血清dna含量與腫瘤分期相關(guān)；與年齡、組織學(xué)類型、療效及生存無(wú)關(guān)；以500ng/ml為cutoff值，可判斷患者預(yù)后；此檢測(cè)方法特異性低，無(wú)診斷價(jià)值192005前列腺癌血清實(shí)時(shí)熒光定量pcr前列腺活檢（152）正常（25） 202005胸腔惡性腫瘤血漿實(shí)時(shí)熒光定量pcr食管癌（58）：819（20 banked samples）；13.0肺癌（25）：14.6(38 prospectively collected samples)胃食管返流?。?/p>

13、51）：432 (23 banked samples)；10.5 (28 prospectively collected samples)正常（11）：10.6回顧性實(shí)驗(yàn)（banked samples）顯示，食管癌患者血漿dna含量顯著高于胃食管返流??；而前瞻性實(shí)驗(yàn)（prospectively collected samples)表明，正常對(duì)照與腫瘤患者血漿dna含量無(wú)差異；血漿dna定量檢測(cè)對(duì)于腫瘤的診斷無(wú)價(jià)值212005乳腺癌血漿？無(wú)臨床意義，僅能作為輔助檢查222005肺癌血漿熒光免疫法（dna dipstick tm kit)肺癌（84）: 318 正常（43）：18與患者性別、年齡、

14、組織學(xué)類型及分期無(wú)關(guān)，但與預(yù)后有關(guān)；有診斷和預(yù)后判斷價(jià)值166i2001各種類型腫瘤血漿競(jìng)爭(zhēng)性pcr腫瘤（30）：219 正常（2）：3.7無(wú)臨床相關(guān)性，可能與樣本含量小及腫瘤類型不均一有關(guān)72001乳腺癌血漿？乳腺癌（126）：211正常（92）：21與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)。92001遺傳性和表觀遺傳性改變的檢測(cè)自從stroun等23通過(guò)生物化學(xué)特性的研究，證實(shí)了循環(huán)dna的腫瘤細(xì)胞源性，癌基因抑癌基因的突變24、25、微衛(wèi)星改變26、染色體重排27及dna甲基化28-35等標(biāo)志性事件在各種類型腫瘤患者循環(huán)dna中相繼被發(fā)現(xiàn)。腫瘤特異性分子遺傳和表觀遺傳改變?yōu)槟[瘤的早期診斷開辟

15、了新天地。癌基因抑癌基因的突變1994年，vasioukhin36和sorenson37分別在骨髓增生綜合征、急性髓細(xì)胞白血病和胰腺癌患者血漿dna中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞特異性n-ras和k-ras2基因點(diǎn)突變的存在。此后的研究表明，k-ras基因突變經(jīng)常存在于消化系統(tǒng)惡性腫瘤（包括胰腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌等）患者的血清血漿中，其檢測(cè)對(duì)于腫瘤的早期診斷38-43、預(yù)后判斷44-45、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)46及療效評(píng)估47都有重要的臨床意義。p53基因是一種抑癌基因，它在細(xì)胞分裂增殖生長(zhǎng)過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中p53基因的多個(gè)外顯子存在突變。循環(huán)dna p53基因突變最先在一例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者

16、的腦脊液中被檢測(cè)到48，此后，在膀胱癌患者尿液中亦發(fā)現(xiàn)突變的存在49。對(duì)結(jié)腸癌患者血清dna中腫瘤特異性遺傳改變的研究50發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織存在p53突變的10例患者中，有7例其對(duì)應(yīng)的血清dna中亦存在相同的改變；另項(xiàng)研究51亦在17例大腸癌患者中有3例血漿dna p53突變陽(yáng)性。隨后的大量研究表明，乳腺癌52、58、60、肺癌52、55、63、頭頸部惡性腫瘤53、59、結(jié)直腸癌54、64、肝癌56、57、61、62等多種惡性實(shí)體腫瘤患者循環(huán)dna的p53基因存在點(diǎn)突變。最新的一項(xiàng)研究65采用電噴霧電離光譜分析技術(shù)，針對(duì)肝細(xì)胞癌患者血漿中p53基因發(fā)生突變的dna進(jìn)行定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)以2500co

17、py/ml為正常值上限，具有臨床診斷價(jià)值。dna的甲基化改變5末端區(qū)域啟動(dòng)子高甲基化與多種抑癌基因表達(dá)失活有關(guān)66，這些抑癌基因包括p14arf、p16、dapk、gstp-1、mgmt、apc、e-cadherins、rassf1a等，他們?cè)诩?xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂增殖及細(xì)胞凋亡中起至關(guān)重要的作用。1999年，esteller等67首次對(duì)肺癌患者血清dna中多種抑癌基因（p16、dapk、gstp1、mgmt）啟動(dòng)子甲基化進(jìn)行了研究，同時(shí)研究了其與多種臨床參數(shù)（臨床分期、組織病理、復(fù)發(fā)及臨床結(jié)局）的相關(guān)性，研究表明，肺癌患者血清dna中存在抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化改變，且與組織dna中高甲基化高

18、度一致，然而，由于樣本含量較?。╪22），未能發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)性。從此，關(guān)于腫瘤循環(huán)dna甲基化及其臨床意義的文獻(xiàn)報(bào)道紛至而出68-74，所有研究（無(wú)論血漿或血清標(biāo)本）表明，腫瘤循環(huán)dna中存在多種抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化改變，其中，也不乏得到臨床相關(guān)性的報(bào)道（表）。sanchez-cespedes等71分析了95例頭頸部腫瘤患者血清dna中4種抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)與腫瘤分期、腫瘤大小、部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，研究表明，啟動(dòng)子甲基化與否和腫瘤的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（p<0.05），并且預(yù)示著腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)；lecomte等72聯(lián)合p16甲基化和k-ras突變研究顯示與結(jié)直腸癌患者的預(yù)

19、后相關(guān)；zou等74發(fā)現(xiàn)p16甲基化與結(jié)直腸腫瘤分期有關(guān)。然而，僅僅根據(jù)高甲基化現(xiàn)象，我們依然無(wú)法對(duì)腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確有效的診斷、分期及預(yù)后判斷。1999年，lo等75首次將熒光定量pcr與msp結(jié)合并嘗試對(duì)腫瘤組織dna甲基化進(jìn)行定量測(cè)定；2000年，eads等76發(fā)展了更為敏感的甲基化定量檢測(cè)技術(shù)methylight,從而為腫瘤循環(huán)dna甲基化定量檢測(cè)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。2002年,usadel等77采用熒光定量msp技術(shù)檢測(cè)了肺癌患者血漿血清中apc基因啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化改變的dna水平，文中衡量甲基化dna水平的標(biāo)準(zhǔn)是甲基化率（熒光強(qiáng)度甲基化apc：熒光強(qiáng)度內(nèi)參照基因myod1×100

20、）。研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中apc啟動(dòng)子高甲基化陽(yáng)性率高達(dá)96%（95/99），血漿血清dna中高甲基化檢測(cè)敏感性雖不如組織，亦達(dá)到47%（42/89），而健康對(duì)照人群（n=50）全部陰性，顯示了100%的特異性；另一方面，甲基化陽(yáng)性標(biāo)本的甲基化率平均值：腫瘤組織為7.33（0.001-346.8）、血漿血清為0.36（0.01-11.5），雖然平均值差別很大，但比較這兩類標(biāo)本甲基化率，并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此，筆者認(rèn)為，血漿血清apc啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)比定性檢測(cè)更能真實(shí)的反映組織的甲基化情況，從而為腫瘤臨床提供更準(zhǔn)確可靠的信息。臨床相關(guān)性研究表明，肺癌組織甲基化水平與患者預(yù)后有關(guān)（p=0.

21、006），而血漿血清中未能發(fā)現(xiàn)該相關(guān)性，這可能與標(biāo)本的不均一（既有血漿又有血清）有關(guān)。2004年，hoque78對(duì)腎癌患者血清及尿液中游離dna的多種抑癌基因（cdh1、apc、mgmt、rassf1a、gstp1、p16、rar-2和arf）啟動(dòng)子高甲基化進(jìn)行半定量研究，由于采用多基因聯(lián)合檢測(cè)，其敏感性（9416/17）明顯高于以往僅僅針對(duì)單個(gè)基因的報(bào)道；而甲基化dna相對(duì)定量結(jié)果顯示，腎癌患者血清及尿液中抑癌基因啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化改變的dna水平明顯高于正常對(duì)照組，然而，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何臨床意義。同年，wong等79采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)鼻咽癌病人血漿中游離dna的多種抑癌基因（cdh1、dapk1

22、、p15、p16、rassf1a和mlh1）啟動(dòng)子高甲基化進(jìn)行絕對(duì)定量測(cè)定，并研究其與患者性別、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果也無(wú)相關(guān)性。雖然最近的研究80再次證明了多基因聯(lián)合檢測(cè)的高敏感性（57%），并且發(fā)現(xiàn)與腫瘤分期的相關(guān)性，但是，這些都僅僅限于定性結(jié)果，而定量結(jié)果好像是多余的，毫無(wú)意義的。微衛(wèi)星改變和染色體重排對(duì)于腫瘤微衛(wèi)星改變的研究目前存在很多爭(zhēng)議。首先，其檢測(cè)方法多種多樣，缺乏可比性，檢測(cè)敏感性較低，可能是由于檢測(cè)樣本中正常dna背景太高的緣故；其次，有研究發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組和腫瘤組織微衛(wèi)星改變陰性的患者循環(huán)dna中存在微衛(wèi)星的改變81-85，這種假陽(yáng)性被認(rèn)為與循環(huán)dna的低水平有關(guān)

23、；第三，微衛(wèi)星改變對(duì)于腫瘤診斷缺乏特異性。雖然存在的問(wèn)題很多，但不乏臨床相關(guān)性的報(bào)道。在對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血漿dna微衛(wèi)星改變的研究86中發(fā)現(xiàn)，i期及病灶小于2cm的患者其陽(yáng)性檢出率分別為43%和45%，為臨床早期診斷提供依據(jù)，該檢測(cè)敏感性為61%（30/49），特異性達(dá)86%（30/35）。一項(xiàng)肺癌前瞻性研究87表明，在13例支氣管活檢陽(yáng)性患者中，有12例血漿dna亦存在相同的微衛(wèi)星改變，診斷陽(yáng)性率高達(dá)92%（12/13），支氣管活檢及血漿dna檢測(cè)敏感性分別為30%（13/44）和41%（12/29）。而對(duì)黑素瘤患者血漿dna微衛(wèi)星改變的研究88顯示其預(yù)后判斷及臨床指導(dǎo)的作用。最近的一篇報(bào)

24、道89顯示了尿液dna中微衛(wèi)星改變與膀胱癌患者復(fù)發(fā)的關(guān)系。染色體重排與遺傳的關(guān)系更為密切，常發(fā)生于血液系統(tǒng)惡性腫瘤。frickhofen等90報(bào)道了非霍杰金淋巴瘤和急性前b淋巴母細(xì)胞性白血病患者血漿血清dna中免疫球蛋白基因序列的重排。循環(huán)dna定性及定量結(jié)果與臨床分期之間的相關(guān)性為預(yù)后判斷和治療方案奠定了理論基礎(chǔ)，隨訪研究亦為患者的生存及療效判斷提供了理論依據(jù)，循環(huán)dna為腫瘤的無(wú)創(chuàng)檢查提供了全新的思路。二、感染性疾病外源性病原體，特別是病毒感染是威脅人類健康的一類疾病。包括愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒（epstein-barr virus, ebv）91-98、人乳頭瘤病毒（human papill

25、omavirus）99-101及乙型肝炎病毒（hepatitis b virus , hbv）102-105等在內(nèi)的常見的病毒感染性疾病與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，因此，對(duì)于這些外源性病毒dna的載量檢測(cè)，可以為臨床診斷、預(yù)后及療效判斷提供幫助。鼻咽癌在中國(guó)南方和東南亞發(fā)病率很高，幾乎所有的患者都有eb病毒感染。1999年，lo等91、92采用實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)定量檢測(cè)鼻咽癌患者血漿中的eb病毒dna，并對(duì)接受放療的患者進(jìn)行了長(zhǎng)期隨訪研究。其中一項(xiàng)研究91顯示，95%（55/57）的患者血漿ebv dna陽(yáng)性（平均含量：2105 copies/ml），其水平與疾病分期相關(guān),而正常對(duì)照組陽(yáng)

26、性率僅為7%（3/43平均含量：0 copies/ml）；在15例放療患者中，有7例腫瘤消退病情好轉(zhuǎn)，其血漿ebv dna含量由治療前的陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，而另外8例治療無(wú)效的患者中，6例血漿hbv dna持續(xù)在高水平。另項(xiàng)研究92亦表明了循環(huán)ebv dna含量的變化與患者預(yù)后、療效及復(fù)發(fā)的關(guān)系。最近的報(bào)道98則顯示了血漿ebv dna對(duì)于霍杰金淋巴瘤的無(wú)創(chuàng)診斷價(jià)值。人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌的重要原因之一，隨著病毒dna整合到人基因組中，腫瘤不斷進(jìn)展，同時(shí)也為采用pcr技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)帶來(lái)了難題。采用傳統(tǒng)的pcr基因擴(kuò)增技術(shù)，dong等99在232例宮頸癌中，僅檢測(cè)到4.8%的血漿hpv dna陽(yáng)性，可

27、能與基因整合導(dǎo)致擴(kuò)增位點(diǎn)的消失有關(guān)。2003年的兩項(xiàng)研究100、101表明早期宮頸癌患者血清hpv dna陽(yáng)性提示預(yù)后較差，可作為疾病復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。乙型肝炎病毒感染與肝細(xì)胞性肝癌的關(guān)系很早就被闡明，血漿血清hbv dna載量與患者惡性轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)102、103，且可提示患者的預(yù)后情況104。循環(huán)病毒dna的檢測(cè)顯示了廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值，特別是eb病毒dna在血漿血清中含量高，檢出陽(yáng)性率高，為相關(guān)性惡性腫瘤的診斷、預(yù)后判斷提供了新的手段。三、產(chǎn)前診斷傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷需要通過(guò)羊膜穿刺或絨毛膜來(lái)采集胎兒樣本，易對(duì)胎兒造成創(chuàng)傷。1997年，lo等106首先在孕婦血漿血清中檢測(cè)到來(lái)自胎兒的dna，且在孕

28、三個(gè)月胎兒dna就存在于母體循環(huán)系統(tǒng)中，其含量隨著妊娠時(shí)間的延長(zhǎng)而升高107，從而為產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)診斷開辟了新的途徑。同時(shí)，胎兒dna在孕婦循環(huán)血漿中占的比例遠(yuǎn)高于在母體血細(xì)胞中所占比例108，因此更適合作為檢測(cè)的對(duì)象。y染色體是最先被檢測(cè)的母體血漿中胎兒dna標(biāo)志物106，通過(guò)定量測(cè)定孕婦血漿中的y染色體基因片段，可確定來(lái)自男性胎兒的dna含量，母體血漿中胎兒dna含量的異常與疾病存在相關(guān)，其量的異常已經(jīng)被證實(shí)與多種疾病相關(guān)，如早產(chǎn)109、110、胎兒染色體異常111-113、先兆子癇110、114-120、羊水過(guò)多121、異位胎盤110、122、妊娠劇吐123等。通過(guò)對(duì)母體血漿中胎兒dna rh

29、d特異性序列的檢測(cè)，可確定rhd陰性孕婦胎兒的rhd血型124、125，2001年，該項(xiàng)技術(shù)已被英格蘭國(guó)家血液中心應(yīng)用于臨床126。隨著研究的深入，越來(lái)越多的疾病可通過(guò)循環(huán)胎兒dna檢測(cè)，如地中海貧血127、軟骨發(fā)育不全128、肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良129、囊性纖維變性130及先天性腎上腺增生131、132等。孕婦血漿血清中胎兒dna檢測(cè)使產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)診斷成為可能，隨著對(duì)循環(huán)胎兒dna本質(zhì)的不斷探索133、134，在不久的未來(lái)必將成為產(chǎn)前臨床重要的檢測(cè)手段。 四、外傷與中風(fēng)循環(huán)dna含量與外傷患者的傷勢(shì)嚴(yán)重程度相關(guān)135，亦與中風(fēng)患者嚴(yán)重程度相關(guān)136。還有研究表明，醫(yī)院死亡率與血漿dna高水平有關(guān)13

30、7，該檢測(cè)指標(biāo)可用于急診科室。2006年，chiu tw等的一項(xiàng)對(duì)燒傷病人的前瞻性研究138顯示，血漿dna含量的升高與患者嚴(yán)重程度（包括燒傷面積和深度等）及住院時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，laktionov等亦發(fā)現(xiàn)外傷患者血漿dna含量與外傷后器官衰竭有關(guān)139。lam等研究發(fā)現(xiàn)，血漿dna早期及持續(xù)升高提示外傷病情的嚴(yán)重程度141。血漿特異性dna，如線粒體dna140含量亦在發(fā)生外傷后顯著升高。在一項(xiàng)對(duì)84例外傷患者的研究142中發(fā)現(xiàn)，外傷后4h以內(nèi)，患者血漿dna含量明顯升高，平均為正常對(duì)照的60倍，在外傷患者中，并發(fā)ali及ards或死亡的患者血漿dna含量平均為傷勢(shì)較輕患者的11-12倍，以2.

31、3×105 copy/ml為cut off值，預(yù)測(cè)敏感性80%-100%，特異性100%。通過(guò)分類回歸分析（the classification and regression tree），血漿dna與其他各類外傷指標(biāo)，如損傷評(píng)分143-145、白細(xì)胞記數(shù)146、休克指數(shù)143、147等聯(lián)合，可很好的預(yù)測(cè)外傷患者的病情預(yù)后。五、自身免疫性疾病及器官移植1966年，tan148首先發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者具有高水平循環(huán)dna，而其他自身免疫性疾病患者循環(huán)系統(tǒng)中亦含有游離的dna，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎149。隨后的研究證實(shí)了上述觀點(diǎn)150-155，并認(rèn)為，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清dna含量升高 血

32、清dna含量升高與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。2001年，chen等156采用瓊脂糖凝膠電泳方法分析了系統(tǒng)性硬化癥患者循環(huán)dna特征，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組之間的不同條帶，為其診斷提出了新的思路。1998年，lo等157發(fā)現(xiàn)不同性別肝、腎移植者血漿中含有來(lái)自供者的dna。有研究表明，血漿dna與細(xì)胞死亡有關(guān)158，因此，移植受者血漿中來(lái)自供者的dna可作為移植排斥、巨細(xì)胞病毒、血管并發(fā)癥等的指標(biāo)159。六、問(wèn)題及展望1正常參考范圍早在1972年，richard等160通過(guò)對(duì)186名健康人血漿dna定量檢測(cè)，確定其正常平均值為13.9 ± 3.7 mg/liter，此后，大量關(guān)于循環(huán)dna的研究報(bào)道都

33、檢測(cè)正常人血漿血清dna水平。1975年，steinman5等確定正常成年人血漿血清dna含量在10-30ng/ml范圍內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)，循環(huán)dna含量高于100ng/ml提示疾病的存在。目前大多數(shù)研究表明，正常人血漿dna平均含量在10ng/ml左右5、12、14、17、21，而血清dna平均含量則顯著高于血漿，且各個(gè)研究結(jié)果差異較大4、16、20、161。雖然血漿dna正常值研究結(jié)果較為統(tǒng)一，但多數(shù)報(bào)道都只是將正常人循環(huán)dna含量作為患者的對(duì)照，因此樣本含量少，年齡范圍窄，不能代表健康人群的全體。wu等161定量檢測(cè)了100名大學(xué)生血清dna含量，平均值為57.1ng/ml，95%可信區(qū)件間上限

34、為118.3ng/ml；同時(shí)測(cè)定了不同年齡段健康體檢者血清dna含量，確定中國(guó)臺(tái)北地區(qū)男性和女性正常值上限分別為86.6 ng/ml 和81.8 ng/ml。鑒于循環(huán)dna在各種病理疾病狀態(tài)下含量的升高，對(duì)于其在健康人群中正常范圍的確定非常必要，這就需要大范圍大樣本的研究，甚至進(jìn)行流行病學(xué)的調(diào)查。2來(lái)源、性質(zhì)及清除1995年，fourniÉ12檢測(cè)其他肺癌腫瘤標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌患者的nse、血清ldh水平與dna含量成正相關(guān)，推測(cè)血漿dna含量的升高與細(xì)胞死亡有關(guān)，并從兩點(diǎn)證明了血漿dna的腫瘤源性：小細(xì)胞癌患者血漿dna含量與來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的nse相關(guān)，帶有人源性腫瘤的裸鼠血漿

35、dna與人腫瘤細(xì)胞dna可雜交。但是，dna釋放的機(jī)制未明。2001年，jahr163通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，證實(shí)凋亡和壞死會(huì)引起明顯的循環(huán)dna水平升高，推測(cè)腫瘤特異性dna通過(guò)上述兩種狀態(tài)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)；同時(shí)運(yùn)用熒光定量msp技術(shù)檢測(cè)30例腫瘤患者血漿dna中cdkn2a啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)高甲基化cdkn2a含量從3%-93%不等（這可能與腫瘤類型的不同有關(guān)），綜合前述報(bào)道77-80，推測(cè)不同程度癌細(xì)胞的壞死凋亡（可能由于病人自身免疫水平不同或腫瘤類型不同引起）決定了腫瘤特異dna釋放的多寡。然而，凋亡和壞死是否腫瘤特異dna唯一來(lái)源？是否還存在其他未知的影響因素？最新報(bào)道164提出：腫瘤特異循環(huán)dna主要來(lái)自活躍的而不是凋亡和壞死的癌細(xì)胞。如果真是如此，我們有必要重新審視腫瘤特異循環(huán)dna的臨床意義。3研究方法的統(tǒng)一 標(biāo)本的選擇和采集研究循環(huán)dna所采用的標(biāo)本包括血漿和血清，目前普遍認(rèn)為，血清dna含量明顯高于血漿3、18、69，推測(cè)可能由于血液凝固過(guò)程中白細(xì)胞破壞引起的dna釋放，因此，血漿dna水平能真實(shí)的反映體內(nèi)情況8，比血清更適合作為研究的標(biāo)本對(duì)象。循環(huán)dna是游離于細(xì)胞外的dna，如何確保血漿收集過(guò)程中血細(xì)胞（主要是白細(xì)胞）的有效去除是保證實(shí)