小鼠代謝相關檢測

1、八、 小鼠代謝相關檢測 i.葡萄糖耐受實驗（gtt）試劑和儀器： ，生理鹽水（0.85 nacl） 糖 儀glucocard ii 葡萄糖（cat: g6125 sigma-aldrich） ，血series test meter arkray和血糖試紙glucocard test strip ii arkray。注意事項： ， 小鼠葡萄糖耐受實驗的葡萄糖使用量一般為 1.5g 或者 2g 每公斤體重（1.5 or 2 g/kg）根據(jù)具體的實驗要求配置合適的濃度的葡萄糖溶液。如葡萄糖使用量是 2g/kg，則用生理鹽水（saline）配置 20的葡萄糖溶液。操作步驟：1 小鼠準備：每組實驗（如不

2、同基因型或給藥組）小鼠數(shù)量不得少于 6 只，對照組必須是 同年齡、同性別的小鼠。于實驗前一天下午 5 點將小鼠換入干凈的籠子禁食，禁食 16 小時，至次日上午 9 點。禁食期間，小鼠保持正常的飲水；2 次日上午九點，開始葡萄糖耐受實驗。稱取每只小鼠的體重，并用標記筆在小鼠尾巴的 根部標記序號，以便在實驗過程中能快速的辨認所測小鼠；3 空腹基礎血糖的測定：將小鼠從籠子中取出，輕放于鐵網(wǎng)格之上，用剪刀剪去小鼠尾巴 末端約 1-2mm，輕輕擠壓小鼠尾巴，讓血液富集成一滴，用血糖儀測定空腹血糖，測定 值認定為 0min 的血糖值。操作盡量輕柔，使小鼠不至于過度驚嚇；4 讓小鼠適應 30min 之后，開

3、始準備腹腔注射葡萄糖（ip gtt）或灌胃葡萄糖 ogtt。5 ip gtt：將小鼠輕輕抓起，按照標準的腹腔注射操作用 1ml 注射器給小鼠注射葡萄糖溶 液。注射的體積根據(jù)小鼠的體重決定，每 g 體重注射 0.01ml。從注射完畢一刻起，開始 計時； ogtt：將小鼠輕輕抓起，按照標準灌胃操作用 1ml 注射器連接灌胃針給于小鼠葡萄糖溶 液。灌胃的體積根據(jù)小鼠的體重決定，每 g 體重灌胃 0.01ml。從灌胃完畢一刻起，開始 計時。 一般情況下，每只小鼠的操作間隔在 1min，這樣可以準確的按照所規(guī)定時間完成對每只 196 小鼠的血糖測定。6 在 15min，30min，60min，90min

4、，120min 按照步驟 3 的操作測定每只小鼠各個時間點 的血糖值；7 實驗完畢后，將每籠小鼠補充上飼料。用 excel 軟件分析實驗結果。 197 ii.胰島素耐受實驗（itt）試劑和儀器： 人胰島素（novolin r 40u/ml novo nordisk），生理鹽水（0.85 nacl），血糖儀glucocard ii series test meter arkray和血糖試紙glucocard test strip ii arkray。注意事項： 在胰島素耐受實驗中，胰島素的用量要根據(jù)小鼠的年齡和性別來決定，一般來講理想的胰島素用量應該使葡萄糖水平在注射 30min 后下降到注射前

5、的 40左右。小鼠胰島素耐受實驗的胰島素使用量一般為 0.5u 至 1.2u 每公斤體重 （0.5-1.2 u/kg），根據(jù)具體的實驗要求將胰島素稀釋到合適濃度。如胰島素使用量是 0.5u/kg，則用生理鹽水（saline）配置0.05u/ml 的胰島素溶液。操作步驟：1 小鼠準備：每組實驗（如不同基因型或給藥組）小鼠數(shù)量不得少于 6 只，對照組必須是 同年齡、同性別的小鼠。于上午 9 點將小鼠換入干凈的籠子禁食，禁食 4 小時，至下午 1 點。禁食期間，小鼠保持正常的飲水；2 下午 1 點，開始胰島素耐受實驗。稱取每只小鼠的體重，并用標記筆在小鼠尾巴的根部 標記序號，以便在實驗過程中能快速的

6、辨認所測小鼠；3 將小鼠從籠子中取出，輕放于鐵網(wǎng)格之上，用剪刀剪去小鼠尾巴末端約 1-2mm，輕輕擠 壓小鼠尾巴，讓血液富集成一滴，用血糖儀測定血糖，測定值認定為 0min 的血糖值。 操作盡量輕柔，使小鼠不至于過度驚嚇；4 讓小鼠適應 30min 之后，開始準備腹腔注射胰島素溶液；5 將小鼠輕輕抓起，按照標準的腹腔注射操作用 1ml 注射器給小鼠注射胰島素溶液。注射 的體積根據(jù)小鼠的體重決定，每 g 體重注射 0.01ml。從注射完畢一刻起，開始計時。一 般情況下，每只小鼠的操作間隔在 1min，這樣可以準確的按照所規(guī)定時間完成對每只小 鼠的血糖測定；6 在 15min，30min，45mi

7、n，60min 按照步驟 3 的操作測定每只小鼠各個時間點的血糖值；7 實驗完畢后，將每籠小鼠補充上飼料。用 excel 軟件分析實驗結果。 198 iii.丙酮酸耐受實驗（pyruvate challenge test）試劑和儀器： ，生理鹽 水（0.85 nacl） 糖 儀glucocard ii series 丙酮酸（cat: pd0462 sangon） ，血test meter arkray和血糖試紙glucocard test strip ii arkray。注意事項：1. 丙酮酸是糖異生（gluconeogenesis）的底物，本實驗在腹腔注射入丙酮酸溶液后，通 過檢測血糖上升的

8、幅度，可以用來評估小鼠糖異生的能力。在本實驗中，選用丙酮酸或 丙酮酸鈉鹽進行實驗都可以；2. 小鼠丙酮酸耐受實驗的丙酮酸使用量一般為 1.5g 或者 2g 每公斤體重（1.5 or 2 g/kg）， 根據(jù)具體的實驗要求配置合適的濃度的丙酮酸溶液。如丙酮酸使用量是 2g/kg，則用生 理鹽水（saline）配置 20的丙酮酸溶液。操作步驟：1 小鼠準備：每組實驗（如不同基因型或給藥組）小鼠數(shù)量不得少于 6 只，對照組必須是 同年齡、同性別的小鼠。于實驗前一天下午 5 點將小鼠換入干凈的籠子禁食，禁食 16 小時，至次日上午 9 點。禁食期間，小鼠保持正常的飲水；2 次日上午九點，開始丙酮酸耐受實

9、驗。稱取每只小鼠的體重，并用標記筆在小鼠尾巴的 根部標記序號，以便在實驗過程中能快速的辨認所測小鼠；3 空腹基礎血糖的測定：將小鼠從籠子中取出，輕放于鐵網(wǎng)格之上，用剪刀剪去小鼠尾巴 末端約 1-2mm，輕輕擠壓小鼠尾巴，讓血液富集成一滴，用血糖儀測定空腹血糖，測定 值認定為 0min 的血糖值。操作盡量輕柔，使小鼠不至于過度驚嚇；4 讓小鼠適應 30min 之后，開始準備腹腔注射丙酮酸鈉溶液；5 將小鼠輕輕抓起，按照標準的腹腔注射操作用 1ml 注射器給小鼠注射丙酮酸溶液。注射 的體積根據(jù)小鼠的體重決定，每 g 體重注射 0.01ml。從注射完畢一刻起，開始計時。一 般情況下，每只小鼠的操作間

10、隔在 1min，這樣可以準確的按照所規(guī)定時間完成對每只小 鼠的血糖測定；6 在 15min，30min，60min，90min，120min 按照步驟 3 的操作測定每只小鼠各個時間點 的血糖值；7 實驗完畢后，將每籠小鼠補充上飼料。用 excel 軟件分析實驗結果。 199 iv.小鼠血清胰島素的測定（elisa）試劑和儀器： tm rat/mouse insulin elisa kit（cat: ezrmi-13k linco research） 酶標 sunrise ， 儀tecan。注意事項： 血液里胰島素的測定可以選用血漿或血清進行測定，我們所采用的是用血清來作為樣品，分析其中的胰島

11、素水平。操作步驟：1 根據(jù)實驗的具體需要（如 fast status fed status glucose-stimulation etc），采 集不同處理方式的小鼠的血樣進行分析。小鼠血清樣本的制備；b 用毛細管通過小鼠的眼眶采血約 50ul，將血液置于沒有抗凝劑的 0.5ml ep 管，將血樣 放置于 4冰箱，讓其凝結 2-4h；c 將凝結后的血樣在 4冷凍離心機用 4000g 的速度離心 15min；d 將上清液（血清）轉移到新的 ep 管中，進行后續(xù)的 elisa 實驗。如需要保存，則根據(jù) 需要將血清按合適體積分裝，保存于-80冰箱。切忌反復凍融； ；2 血清胰島素水平的測定（elis

12、a） 測定的具體的步驟根據(jù) elisa kit 所帶的使用說明書來進行。我們所使用的 linco 公司的 rat/mouse insulin elisa kit 的具體操做步驟如下；1 將 kit 中提供的 10× wash buffer 用 milli q h2o 稀釋到 1×的工作液。如 50ml 10× wash buffer 加入 450ml milli q h2o；2 取出合適數(shù)量的包被有胰島素單抗的 elisa strips 放入板架中，其它剩余的 elisa strips 放入包裝袋中，封好置于 4保存。將 elisa strips 的每個孔用 30

13、0ul 稀釋好 的 wash buffer 清洗 3 遍。清洗之后，倒掉 wash buffer，然后在衛(wèi)生紙上輕輕拍打， 以去掉孔中殘留的液體。但是注意在進行下一步操作之前，不要使孔完全干掉，以免影 響實驗結果；3 安排好空白對照，標準品，qc 以及樣品的加樣方式，即哪些孔加空白對照哪些孔加 qc 和標準品，哪些孔加樣品?？赡艿脑?，采用復孔的加樣方式；4 在空白對照的孔中，加入 10ul assay buffer 和 10ul matrix solution；在標準品和 200 qc 的孔中加入 10ul 不同濃度的標準品或 qc 和 10ul matrix solution，標準品濃度為：

14、 10ng/ml 5ng/ml 2ng/ml 1ng/ml 0.5ng/ml 0.2ng/ml；在樣品的孔中加入 10ul 所需檢測的血清樣品和 10ul assay buffer。加樣的過程要盡量的迅速，防止孔完全干 掉；5 向每個反應孔中加入 80ul detection antibody。為了得到最好的實驗結果，此加樣步 驟應該在 1h 內(nèi)完成。將加樣完畢的板架上的 elisa strips 用封口膜封好，置于脫色搖 床上以合適速度輕輕振搖，于室溫下孵育 2h；6 去掉封口膜，倒掉孔中反應的液體，在衛(wèi)生紙上輕輕拍打，以去掉孔中殘留的液體；7 將每個反應孔用 300ul 稀釋好的 wash

15、 buffer 清洗 3 遍。清洗之后，倒掉 wash buffer， 然后在衛(wèi)生紙上輕輕拍打，以去掉孔中殘留的液體；8 向每個反應孔中加入 100ul enzyme solution。然后將 elisa strips 用封口膜封好， 置于脫色搖床上以合適速度輕輕振搖，于室溫下孵育 30min；9 去掉封口膜，倒掉孔中反應的液體，在衛(wèi)生紙上輕輕拍打，以去掉孔中殘留的液體；10 將每個反應孔用 300ul 稀釋好的 wash buffer 清洗 6 遍。清洗之后，倒掉 wash buffer， 然后在衛(wèi)生紙上輕輕拍打，以去掉孔中殘留的液體；11 向每個反應孔中加入 100ul substrate

16、 solution，然后用錫箔紙將 elisa strips 封住， 以使每個反應孔避光。置于脫色搖床上以合適速度輕輕振搖，于室溫下孵育約 30min。 通過和底物的反應，反應孔中的液體會變成藍色，藍色的深淺程度與胰島素的含量成正 比。在此步驟中應隨時注意觀察顏色的變化，因為藍色的形成速度根據(jù)室溫的變化會加 快或變慢。根據(jù)藍色變化的快慢應精確控制孵育的時間，可能小于或大于 30min。評判 孵育時間的標準，是參考空白對照孔和最低濃度的標準品（0.2ng/ml）之間的藍色的差 異，等到這兩個反應孔之間的藍色深淺出現(xiàn)差異的時候，即可停止孵育；12 向每個反應孔中加入 100ul stop solu

17、tion，用手輕輕拍打板架使液體充分混勻，并去 除氣泡。這是反應孔中的顏色會由藍色變成黃色。然后，在 5min 中內(nèi)，用酶標儀讀取 各個孔在以 450nm 波長下的光吸收值；13 用 excel 軟件分析實驗結果，根據(jù)標準品的濃度值和光吸收數(shù)值，取對數(shù)值做標準曲線， 根據(jù)標準曲線換算出檢測樣品的濃度值。 201 v.小鼠機體脂肪含量分析（dexa 檢測）試劑和儀器： 三溴乙醇（cat: 90710 sigma-aldrich）麻醉劑（50×貯液，配制方法：將 25g 三溴 ，37水浴放置約 1h 直至溶解完乙醇溶于 15.5ml 叔戊醇（cat: a-1685 sigma-aldri

18、ch）全，期間不時搖動以促進溶解。將貯液用生理鹽水稀釋成 1×的工作液），piximus ii dualenergy x-ray absorptiometry dexa system lunar ge medical system。注意事項：1. 小鼠的麻醉要充分，避免在掃描過程中移動； 需要將在實驗開始前將小鼠禁食 16 小時以上。2. 如果要通過 dexa 進行小鼠的骨密度分析，操作步驟：1 接通電源，打開 piximusii dexa 儀器和所連接的電腦，雙擊電腦桌面上的 lunar pixi 程序圖標以打開 dexa 程序；2 在 dexa 程序主界面按 f6 鍵，打開“qu

19、ality control”的界面；3 按照提示，將 qc phantom 置于托盤中，確認擺放方向位置正確，然后放至 dexa 儀器的 檢測位置；4 確認后按 f3 鍵開始 qc 掃描，掃描過程中不要點擊鼠標或鍵盤上的任何鍵；5 qc 通過之后，按 f8 推出 qc 程序，回到 dexa 程序主界面。只有在 qc 通過之后，才能進 行小鼠的掃描分析。如果 qc 沒有通過，注意調(diào)整 phantom 的擺放位置，重新開始 qc 掃 ，直 描（即步驟 2-4） 到 qc 通過為止；6 準備需要檢測的小鼠，稱取小鼠體重，按照體重腹腔注射相應劑量的麻醉劑（0.01ml/g bw），比如 20g 體重的

20、小鼠，腹腔注射三溴乙醇麻醉劑（1×）0.2ml。因為三溴乙醇的 麻醉時間比較短，所以建議麻醉一只，掃描檢測一只；7 在 dexa 程序主界面按 f3 鍵，打開掃描程序界面。輸入需要填寫的相關信息，比如小鼠 的 id，出生日期，體重，操作人姓名等等。確認后按“enter”鍵完成信息輸入；8 將麻醉好的小鼠置于托盤上，確認擺放方向位置正確，然后放至 dexa 儀器的檢測位置。9 確認后按 f3 鍵開始掃描，掃描過程中不要點擊鼠標或鍵盤上的任何鍵；10 掃描完成后，取出小鼠，放入籠內(nèi)。在完成的界面顯示一個小鼠的掃描影像及其外周 的綠色方框。連續(xù)按 3 下 f3 鍵進入分析程序界面。通過箭頭

21、鍵調(diào)整綠色方框的大小和 202 位置，使其圈住小鼠的除了頭部和尾巴的整個軀干部分，然后按“enter”鍵確認，得 到分析的結果。分析結果有綠色方框內(nèi)的小鼠軀干部分的總重量，lean 的重量，脂肪的 重量，以及計算得到的脂肪含量（脂肪的重量/總重量）；11 結果分析完畢后，連續(xù)按 2 次 f8 推出結果分析界面而回到 dexa 程序主界面。按照步 驟 7-10 進行下一只小鼠的掃描檢測。 203 vi.小鼠胰島的分離純化試劑和儀器： ，histopaque 1077（cat: 10771 collagenase type v（cat: c9263 sigma-aldrich） ，sigma-al

22、drich） rpmi 1640 medium ， （含 11mm d-glucose cat: 22400 invitrogen gibco） （nacl 114mm kcl 4.7mm kh2po4 1.2mm mgso4 1.16mm hepes 20mm cacl2 2.5mm nahco3hbss 。體視變焦顯微鏡（smz800 nikon）冷 凍25.5mm adjust the ph to 7.2-7.4 by naoh） ，離心機（5810r eppendorf）。注意事項：1. 在分離胰腺時，通過膽總管的灌注部分很重要，一定要使胰腺，尤其是胰尾部分要膨脹 充分；2. 在操作中

23、要注意除了 rpmi 1640 medium 所有的溶液在使用中都要提前預冷；3. 在最后用 20ul 移液器挑取胰島時，在室溫進行即可，但速度要盡可能的快；4. 正常情況下，每只小鼠能夠抽提出大約 60-80 個左右的中等大小的胰島，根據(jù)不同的實 驗需要安排所需要抽提的小鼠數(shù)目。操作步驟：1 將小鼠用引頸法處死，快速打開腹腔，在體式顯微鏡下找到膽總管，在靠近十二腸的部 分用手術線將膽總管結扎；2 將肝臟上翻，分離膽總管，將其上附著的脂肪輕輕剝離。用顯微鑷夾住膽總管的上端（靠 近肝臟），然后用 4 號半的醫(yī)用頭皮針插入膽總管，用 5ml 注射器連接頭皮針通過膽總 。 管往胰腺灌注預冷的 col

24、lagenase 溶液（1mg/ml collagenase in hbss ice-cold） 一般推注 2-3ml collagenase 溶液可以使小鼠的胰腺充分膨脹；3 將充分膨脹的胰腺分離出來，放入 50ml 離心管中，再加入 collagenase 溶液 2ml，置于 37水浴消化 28min。消化期間，輕輕搖動管子，使消化充分。注意：消化的時間和水 浴溫度都很重要，要盡可能準確；4 消化結束后，把管子置于漩渦振蕩器上振搖 10s，此時胰腺已經(jīng)被分解成糜狀的組織， 加入 15ml 預冷的 hbss，搖勻以終止消化；5 在 4，用 eppedorf 5810r 離心機以 1000rp

25、m 離心 30s，倒掉上清液；6 將沉淀用 10ml 預冷的 hbss 重懸洗滌，不要用漩渦振蕩器，用 1ml 移液器輕輕將沉淀重 204 懸。 在 用 將重懸后的懸濁液移入 10ml 離心管中。 4， eppedorf 5810r 離心機以 1000rpm 離心 30s，倒掉上清液；7 將上一步所得的沉淀用 5ml histopaque 1077 重懸，不要用漩渦振蕩器，用 1ml 移液器 輕輕將沉淀重懸。然后用 10ml 注射器輕輕加入 5ml 預冷的 hbss，加入的速度要輕柔， 使 hbss 沿著管壁輕輕滑下。加完后，下面 5ml 為 histopaque，上面 5ml 為 hbss，

26、因為 兩種液體密度的差異，中間能形成清晰地界面；8 在 4，用 eppedorf 5810r 離心機以 2200rpm 離心 30min。注意：在此步驟的離心中， 需要將離心機的加速和減速都調(diào)整到最慢速度。且用水平轉子不能用角轉子；9 離心結束后，取出管子，可以看見在管子中央，不同的密度液體的界面處分布著一層沙 狀的白色小顆粒，即為初步分離純化的胰島。用巴氏吸管小心的吸出中間層的胰島，用 預冷的 hbss 洗滌：將吸出的胰島置于 5ml 預冷的 hbss 中，用手輕輕敲打管子，使胰島 分散均勻。然后在 4，以 1000rpm 離心 30s，將上清棄掉。用預冷的 hbss 按上述步驟 重復洗滌一

27、遍；10將洗滌后的胰島用含有 10胎牛血清的 rpmi 1640 培養(yǎng)基重懸，然后放置于 6-cm 培養(yǎng) 皿中。在體視顯微鏡下，用 20ul 移液器挑取胰島，對胰島進行進一步的分選。注意： 之所以要進行此步驟，是因為初步分離的胰島中含有少量的消化下來的胰腺的外分泌細 胞；11將挑取出來的胰島放入含有 10胎牛血清的 rpmi 1640 培養(yǎng)基中，用 6-cm 培養(yǎng)皿在 95 air5 co2 的環(huán)境下 37于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以進行下一步的實驗。 205 vii.分離胰島的胰島素分泌（gsis）試劑和儀器： krebs-ringer buffer（nacl 115mm kcl 5.4mm cacl2 2.38mm mgso4 0.8mm na2hpo4 ， （cat: a8806 sigma-aldrich） rat/mouse insulin1mm hepes 10mm） bsa fatty acid free ， （ ， 糖（glucose） （1m）精氨酸elisa kit cat: ezrmi-13k linco research）葡萄 貯液 ， （arginine）貯液（0.5m），krb buffer krebs-ringer buffer0.2 fatty