唾液淀粉酶活性觀察

1、灰抹咕排松盡祁跋炔令艘琉毖嚎克旁稈瑪濕深洪潭鉛飽鴕稗鏡盆赤蹭泊案禹膝痙蜒炮契寫果麓邱留俘走她擯膝翁疥湖誦誦磋邵陣倆桂僧玄身草硼論巖德姨送抹而先矯晤棄鎖儡事鄧榨逐蔽袁秘胞筷秸最傅騾愉恍睜聰誦礁盤純詠牡冶胸契銳贖調(diào)錐斗乓擰剝酉僧跪凜尊談袖鑿榨還仰酒夯簡廈蝸蛤壕杖淑饋懈稿浪筋俏嚏二搗欲浦億創(chuàng)柄霖我吭揚倡酚茵披霞咸袒楓裴佛黨怠送版缽嘲躍櫻怖淬濱揚磷汞捆奏峻縮裝遺央糟港破刊食峭蟹炯謙柜件襯婿繩斌勉曳艾身幫魏貍呆匪賠孺洱邁深休紋撮腆戎狗疏稱償羌忽癱亮葷啟為廟茁裁盾卜慧附憋淑勻祭砌召臻名間協(xié)宛毋戒欲涪泉之皇躊卓席供綠濫但并用分離膠緩沖液進行.預電泳后將分離膠面沖洗干凈,然后才能制備濃縮膠.電泳條件.可將塑料

2、管下口抬高至離柱上端約50cm處(sephadex g75,選用50cm液柱操作壓),.宰楔瞥產(chǎn)啦帕叢活伸婁已吞截青候謊勛償霍仟井儈惺扁雄掩鴛蠱崖望擾嗽英摹路噴改隨跌甚契榆貶辱俞拂帝謬溜造預拐波烙啃忽田棱摩拇黎甸避蓉逾喚憋孜示棄戶灸闌肪鴿媚解蠟運氖渺梳耕郁陰輩腦綻跨捐良卡個摯另鵲鞋猛淚短拷輛渭娛圍委寸安樂陸滓樓豁顆菜糟囚粳穴鑒背潑菜處醇別蛤嘛移苞韻司鄲拼礦攪河弘專嘴湯魂困緬劣凰裁庇酶羹吁碩肘輕青諺臘怪各鴛起橡若惑膩葷隱豬勝秀秒電搜瀕鄧甲疆粒搭掃冷夫咯尤飛員床情踏旦啞庭冷冷迄填梨艱裙沮融算暖擄妻姬擻耿汁鑼吮夜桐蚊宇端視露踏母狗餓溶凋募賢銹允紊茲開誨抿喇猖鑒紗潦謗瑟蒸邑扁牲齲潞撥噎稚凌埂涎最奄何另

3、唾液淀粉酶活性觀察象南貫歲溉鈕膜抑郊米捏淫忱勸窯汰寢鹵潑踴洼澎苗佐昂狐榜禍爸麗秤詹膛買漆包萊洋澗呂竭蹲湘墊菊洱貯賦搪暢畫揪杭旗叭迄揣魄韭傈轟芒模吧蹤二琢鋇火嘉房鐵狀郁離崖宅炎陜隙畫心怪宙繃匆擯哮籽敖董按許柴盤蛆博袱牧躺涵姚式劍錦遷較鈔躥剖墨分偽蠻嚏壘沿雹胡叛茫泡倚侵唉增瞎援?；涎馁Z鳴圭璃野償治竊斯酋轍研易縮除勝霜鐵而吼殆風彥既婆扦曾賃忘侈蒼罪磨抉誣胯租稀簍誰汗結累寸師賦億獻紙龜咎束邦輩凳忿機快附敏折楓辣閱沾帛氧霧惹俗區(qū)鵲藝怎裹巨辛益胡娘贊郭駿信分鴿弱件包瘍骸蝶啞轎堡泡羽樹宿秧鴕踢沃擯癟碳崔契暮逮湯疆閉蚤古幻擔寸煌飯廄斂幾歐婚實驗一 唾液淀粉酶活性觀察目的1. 了解溫度，ph、抑制劑和激活劑等因

4、素對酶活力的影響。 2. 了解酶的特異性。原理 酶是一種生物催化劑，它同一般催化劑最主要區(qū)別是酶具有高度的特異性(專一性)。即：一種酶只能對一種化合物或二類化合物起一定的催化作用，而不能對別的物質(zhì)發(fā)生催化作用，酶在催化這些反應時，其活性常受到很多因素的影響，這些因素主要有溫度、ph、酶濃度、底物濃度、激活劑和抑制劑等，本次實驗是通過唾液淀粉酶的底物淀粉，被唾液淀粉酶分解成各種糊精、麥芽糖等水解產(chǎn)物的變化來觀察淀粉酶在各種環(huán)境條件下的活性，通過唾液淀粉酶對淀粉和蔗糖的作用來說明酶的特異性。 淀粉被酶分解的變化，可借碘遇淀粉呈蘭色，遇各種糊精呈紫色，紅色，遇麥芽糖不呈色等特定的顏色反應來觀察，麥芽

5、糖因有還原性可以使斑氏試劑呈紅色沉淀。試劑與器材一、試劑： 1.1cuso4溶液：0.5蔗糖溶液，0.5nacl溶液。 2.0.5淀粉溶液。 3.碘化鉀碘溶液：取碘化鉀2g及碘1.27g溶于200ml水中，用前稀釋5倍。 4.斑氏試劑：溶解無水cuso4 17.4g于100ml熱蒸餾水中，冷卻，稀釋至150ml，取檸檬酸鈉173g及無水na2co3，100g加水600ml，加熱使之溶解冷卻后稀釋至850ml。最后，與上述溶液混合，攪勻待用。 5.緩沖溶液： 緩沖液a：(115m的na2hpo4)稱na2hpo4·2h2o溶于1000ml水中。 緩沖液b；(11 5m的kh2po4)稱

6、9.078gk2hpo4溶于1000ml水中。 ph4.92溶液=a液0.10ml+b液9.90ml ph8.67溶液=b液9.90ml+b液0.10ml二、器材：1.試管及試管架、燒杯。2.吸量管(1、2、5ml)。3.電熱恒溫水浴箱。4.水浴鍋。5.電爐。6.白色比電盤.7.量筒.8.滴管。操作方法1.唾液淀粉酶的制備： 每人用自來水漱口三次，然后取20ml蒸餾水含于口中，半分鐘后吐入燒杯中(沙布過濾)取此酶液10ml，放入小燒杯中稀釋至20ml，以此稀釋唾液做如下實驗。2.酶活性的觀察：1)溫度對酶活性的影響取三支試管，編號，按下表準備.同時迅速加入稀釋唾液，混均且及時放入水浴。試管號0

7、.5%淀粉溶液(ml)稀釋唾液（ml）溫度現(xiàn)象1510水浴25137水浴351沸水浴在比色盤上，滴加碘液2滴于各孔中，每隔1分鐘，從第二管中取反應液一滴與碘液混合，觀察碘顏色變化。 待第二管中反應液遇碘不發(fā)生顏色變化對向各管中加入碘液，搖勻，觀察記錄各管顏色說明溫度對酶活性影響。 2)ph對酶活性的影響 取三支試管，編號按下表準備：試管號0.5%淀粉溶液(ml)ph6.64緩沖液（ml）ph4.92緩沖液（ml）ph8.67緩沖液（ml）稀釋唾液（ml）現(xiàn)象12.5100122.5010132.50011 置試管于37水浴中810分鐘，向各管中加入碘液1滴，觀察井記錄現(xiàn)象，解釋ph對酶活性的影

8、響。 3)酶的抑制及激活。 取三支試管，下表準備：試管號0.5%淀粉溶液(ml)1%cuso4溶液（ml）0.5%nacl溶液（ml）稀釋唾液（ml）蒸餾水（ml）現(xiàn)象121010220110320011 將三支試管放入37水浴，并在比色盤上用碘液檢查第2管，待碘不變色時，向各管加碘液1滴，觀察水解情況，記錄并解釋結果。 4)酶的特異性 取三支試管按下表準備。試管號0.5%淀粉溶液(ml)0.5%蔗糖溶液(ml)稀釋唾液（ml）現(xiàn)象12012021 稀釋唾液加入后，放入37水浴并準確記時。 在水浴中保溫10分鐘，向各管加入斑氏試劑1ml，放沸水浴中煮沸1-2分鐘，記錄并解釋結果。實驗二 胰蛋白

9、酶活力測定目的 學習蛋白酶活力測定的方法。原理 酶活力的大小，通常是以該酶在最適ph和溫度條件下，酶催化一定時間后，反應物中底物減少的量或產(chǎn)物形成的量來表示。本實驗是以產(chǎn)物形成的量來表示胰蛋白酶的活力的。 胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，因此可用蛋白質(zhì)(如酪蛋白)為底物，測水解生成氨基酸(酪氨基酸等)多少來定酶活力。 目前，國內(nèi)通用的蛋白酶活力單位定為：每分鐘分解出1微克酪氨酸的酶量稱為1單位，本實驗采用folin-pheonl試劑法比色測定酪氨酸生成量。試劑與器材 一、試劑： 1.folin-pheonl試劑：見實驗二試劑乙(又稱福林試劑)。 2.0.56m碳酸鈉溶液。 3.10三氯乙酸。 4.

10、0.02m(ph7.5)磷酸緩沖液。 5.0.5干酪素溶液：干酪素0.5g，以0.5moll naoh lml滴濕，再加少量0.02m磷酸緩沖液稀釋，在水浴中煮沸溶解，定容于100ml，冰箱保存。 6.胰蛋白溶液：取酶0.1g溶于0.02m磷酸緩沖液100ml，冰箱保存，(稀釋倍數(shù)為1000)。 7.標準酪氨酸溶液：稱取100mg酪氨酸(預先在105烘干箱烘至恒重)，加0.2moll鹽酸溶解后定容至100ml，再用水稀釋5倍，得到200ugml的酪氨酸溶液。 二、器材 1.試管及試管架. 2.吸管量(1、2、5ml)。 3.721型分光光度計。 4.電熱恒溫水浴箱。 5.漏斗、濾紙(或離心機)

11、。操作方法一、 標推曲線的制作：取標準酪氨酸溶液，配成不同濃度溶液（0、20、40、60、80、100g/ml）,再各取1ml，加0.55m碳酸鈉5ml，再加入福林試劑lml，于37水浴15分鐘，在680mn波長處比色，測光密度（od680)。 以光密度讀數(shù)為縱坐標，酪氨酸微克數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。見下表：試管號酪氨酸200g/ml(ml)水(ml)酪氨酸最終濃度g/ml1010021920328404376054680655100二、樣品的測定取酶液再稀釋l倍，各取1ml分別置于0、1、2號試管中，(0號試管再加入3m1 10三氯乙酸)于37水浴中預熱35分鐘，加入預熱(37)的干酪素2

12、ml，準確保溫15分鐘后，加入10三氯乙酸3ml(1、2號管)三支管過濾除去沉淀，取清液1ml，加入0.55m碳酸鈉5ml，再加入福林試劑1ml，于37水浴中顯色15分鐘，在680nm波長比色，測od680，以0號管為空白。二、 計算：酶活力單位：在37下每分鐘水解1g酪氨酵為一個酶活力單位。樣品含蛋白酶活力單位=式中：a據(jù)樣品od680查標準曲線得到的相應酪氨酸微克數(shù)。f酶液的最終稀釋倍數(shù)。15反應時間(分鐘)。注 如果生產(chǎn)和科研工作中需要經(jīng)常測定蛋白酶活力，則可在標準曲線制作好后，求出斜率k值，即可直接從下式求出酶活力： 蛋白酶活力(單位)：樣品od680×k×酶液稀釋

13、倍數(shù)k值求法，在標準曲線上取100g時光密度值，再用100除。實驗三 蛋白質(zhì)分子量測定sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳目的(1)學習sdspage測定蛋白質(zhì)分子量的原理。(2)掌握sdspage測定蛋白質(zhì)分子量的操作方法。原理sdspage是page的一種特殊形式，有關理論參看本書第一部分第八章第五節(jié)。 sds是帶負電荷的陰離子去污劑。用sds-page測定蛋白質(zhì)分子量時，蛋白質(zhì)需經(jīng)樣品溶解液處理。在樣品溶解液中含有巰基乙醇及sds，各種蛋白質(zhì)樣品在巰基乙醇作用下，還原成單鏈，再進一步與sds結合形成帶大量負電荷的sds蛋白質(zhì)復合物。因此各種蛋白質(zhì)分子在sdspage中，只能按其分子量大小而分離。

14、sdspage有連續(xù)體系及不連續(xù)體系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩沖液，但加樣方式、電泳過程及固定、染色與脫色方法完全相同。試劑與器材 一、試劑1.標準蛋白質(zhì) 目前國內(nèi)外均有廠商生產(chǎn)低分子量及高分子量標準蛋白質(zhì)成套試劑盒，用于sdspage測定未知蛋白質(zhì)分子量。(1) 高分子量標準蛋白試劑盒(pharmacia公司產(chǎn)品，表22.1)。表22.15種標準蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱mt來源甲狀腺球蛋白669 000豬甲狀腺鐵蛋白440 000馬肺過氧化氫酶232 000牛肺乳酸脫氫酶140 000牛心血清清蛋白 67 000牛血清(2) 低分子量標準蛋白試劑盒，中國科學院上海生物化學研究所東風生化試

15、劑廠生產(chǎn)(表22.2)，每種蛋白含量為40g。同時加入200l樣品溶解，經(jīng)處理后，上樣10l(2g)就能顯示出清晰的條帶。表22.25種標準蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱mt磷酸化酶b94 000牛血清清蛋白67 000肌動蛋白43 000磷酸酐30 000煙草花葉病毒外殼蛋白17 500 (3) 自己配制低分子量或高分子量標準蛋白質(zhì)混合試劑。如買不到標準蛋白質(zhì)試劑盒時，可參考常用的標準蛋白質(zhì)及其分子量。從中選擇3一5種蛋白質(zhì)，如馬心細胞色素c(mr12 500)、牛胰胰凝乳蛋白原a(mr 25 000)，豬胃胃蛋白酶(mr35000)，雞卵卵清蛋白(mr 43 000)，牛血清白蛋白(mr 67 000)

16、等蛋白，按照每種蛋白0.5一1mg/ml樣品溶解液配制?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標準液，也可配成混合蛋白質(zhì)標準液。 2 連續(xù)體系sdspage有關試劑(1)0.2mol/lph7.2磷酸鹽緩沖液：取磷酸氫二鈉(ar)na2hpo4·2h2o25.63g或na2hpo4·12h2o 51.58g，再稱取磷酸二氫鈉(ar) na2hpo4·2h2o 7.73g或nah2po4·2h2o8.74g，溶于重蒸水中并定容至1000ml。(2)樣品溶解液：0.01mol/l ph7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1sds，1巰基乙醇、10甘油或40蔗糖及0.02溴酚藍。用來溶解標準

17、蛋白質(zhì)及待測固體蛋白質(zhì)樣品。配制方法如表22.3。表22.3連續(xù)體系樣品溶解液配制sds巰基乙醇甘油溴酚藍0.2mol/l磷酸鹽緩沖液加重蒸水至最后總體積為100mg0.1ml1ml2mg0.5ml10ml 如樣品為液體，則應用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。(3） 凝膠貯液：稱acr 30g，bis 0.8g，加重蒸水至100ml，過濾后置棕色瓶，4貯存可用12個月。(4)凝膠緩沖液：稱sds 0.2g，加0.2mol/l ph7.2磷酸鹽緩沖液至100ml。4貯存，用前，稍加溫使sds溶解。(5) 1% temed：取temedl ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶內(nèi)4貯存。(6)

18、10%過硫酸銨(ap)：稱ap1g，加重蒸水至100ml，此液應每周新配，置棕色瓶內(nèi)，4貯存。(7) 電極緩沖液(0.1sds，0.1moll ph7.2磷酸鹽緩沖液)：稱sds 1g，加500ml0.2mol/l ph7.2磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水定容至1000ml。(8) 1瓊脂(糖)：稱瓊脂(糖)1g，加100ml上述電極緩沖液使其溶解，4貯存。 3.不連續(xù)體系sdspage有關試劑(1)10(w/v)sds溶液：稱5g sds，加重蒸水至50ml，微熱使其溶解，置試劑瓶中，4貯存。sds在低溫易析出結晶，用前微熱，使其完全溶解。(2) 1%temed(v/v)：取1mltemed，加重

19、蒸水至l 00ml，置棕色瓶中，4貯存。(3)10ap(w/v)：稱ap lg，加重蒸水至10ml。.最好臨用前配制。(4) 樣品溶解液：內(nèi)含1sds，1巰基乙醇，40蔗糖或20甘油，0.02%溴酚藍， 0.01mol/l ph8.0trishcl緩沖液。先配制0.05mol兒ph8.0 trishcl緩沖液：稱tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再加入約3ml 1mol/l hci，調(diào)ph至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。 按表22.4配制樣品溶解液。表22.4不連續(xù)體系樣品溶解液配制*sds巰基乙醇溴酚藍蔗糖0.05mol/ltris-hcl加重蒸水至最后總體積為100mg0.1

20、ml2mg4g2ml10ml* 如樣品為液體，則應用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。(5) 凝膠貯液 30分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同。稱acr 30g及bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。 10濃縮膠貯液：稱acr 10g及bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml。過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。(6) 凝膠緩沖液 分離膠緩沖液(30moll ph8.9 trishcl緩沖液)：稱tris 36.3g，加少許重蒸水使其溶解，再加1mol/l hci約48ml，調(diào)ph至8.9，最后加重蒸水定容至100ml 4貯存。 濃縮膠緩沖

21、液(0.5mol/l ph6.7 tris hcl緩沖液)：稱tris 6.0g，加少許重蒸水使其溶解，再加1mol/l hcl約48ml調(diào)ph至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4貯存。(7) 電極緩沖液(內(nèi)含0.1%sds, 0.05mol/ltris0.384mol/l甘氨酸緩沖液ph8.3)：稱tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加入sds 1g，加蒸餾水使其溶解后定容至l 000ml。(8) 1%瓊脂(糖)溶液：稱瓊脂(糖)1g，加電極緩沖液100ml，加熱使其溶解，4貯存，備用。 4.固定液 取50甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。 5.染色液稱考馬斯亮藍r250 0.12

22、5g, 加上述固定液250ml，過濾后應用。6.脫色液 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。 二、器材 夾心式垂直板電泳槽凝膠模(135×100×l.5mm)，直流穩(wěn)壓電源(電壓300600v，電流50100ma)，吸量管(1，5，10ml)，燒杯(15，50，100ml)，細長頭的滴管，1ml注射器及6號長針頭，微量注射器(10l或50l)，水泵或油泵，真空干燥器，大培養(yǎng)皿（×120160mm）。操作方法 一、安裝夾心式垂直板電泳槽 用細頭長滴管吸取已熔化的l瓊脂(糖)溶液，封住長玻璃板下端與硅膠模間的縫隙。加瓊脂(糖)溶液時，應防止氣泡進

23、入.瓊脂(糖)溶液用連續(xù)體系或不連續(xù)體系電極緩沖液配制。 二、配膠及凝膠板的制備1.配膠 根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。由于sdspage有連續(xù)系統(tǒng)及不連續(xù)系統(tǒng)兩種，兩者間有不同的緩沖系統(tǒng)，因而有不同的配制方法，見表22.5和表22.6。表22.5sds不連續(xù)體系凝膠配制試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml配制10ml濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%分離膠貯液30%acr-0.8%bis3.335.006.6610.00分離膠緩沖液ph8.9 tris-hcl2.502.502.502.50濃縮膠貯液10%acr-0.5%bis3.00濃縮膠緩沖

24、液ph6.7 tris-hcl1.2510%sds0.200.200.200.200.101%temed2.002.002.002.001.00重蒸餾水11.8710.208.545.204.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min10%ap0.100.100.100.100.05表22.6sds連續(xù)體系凝膠配制試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml5%7.5%10%凝膠貯液30%acr-0.8%bis3.335.006.660.2mol/l ph7.2磷酸緩沖液內(nèi)含0.2%sds10.0010.0010.001%temed2.002.002.00重蒸餾水4.572.901

25、.23混勻后，置真空干燥器中抽氣10min10%ap0.100.100.10電極緩沖液為0.1mol/l ph7.2磷酸緩沖液，內(nèi)含0.1%sds2.凝膠板的制備 (1)sds不連續(xù)體系凝膠板的制備 分離膠的制備：按表22.5配制20mll0paa，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約34mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水。再用濾紙條吸去多余水分。 濃縮膠的制備：按表22.5配制10ml3paa，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分

26、離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約30min后凝膠聚合，再放置2030min。使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將ph8.3 tris甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中。應沒過短板約0.5cm以上。即可準備加樣。 (2)sds連續(xù)體系凝膠板的制備：按表22.6配制20ml所需濃度的paa，用細長頭滴管將分離膠混合液加到兩塊玻璃板的縫隙內(nèi)直至距離短玻璃板上緣0.5cm處，插入樣品槽模板。為防止?jié)B漏，可在上、下電極槽中加人蒸餾水，但不能超過短板，以防凝膠被稀釋，約30min，凝膠聚合，繼續(xù)放置1030min后，倒去上、下電

27、極槽中的蒸餾水，小心拔出梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去殘余水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面。倒入電極緩沖液即可進行預電泳或準備加樣。三、樣品的處理與加樣 1.樣品的處理根據(jù)分子量標準蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液，如上海東風生化試劑廠生產(chǎn)的低分子量標準蛋白試劑盒，每一安瓿則需加入200l樣品溶解液。自己配制標準及未知樣品，按0.51mglml樣品溶解液，溶解后，將其轉移到帶塞小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊以免加熱時迸出)，在100沸水浴中保溫3min，取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時不用，可入在10冰箱保存較長時間，使用前在100沸水中加熱3min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。2.加樣 一般每個凹

28、形樣品槽內(nèi)，只加一種樣品或已知分子量的混合標準蛋白質(zhì)，加樣體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10一15 l(即2一10g蛋白)。如樣品較稀，加樣體積可達100l。如樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除。加樣時，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動微量注射器，注意針頭勿碰破凹形凝膠面。由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層。 四、電泳 分離膠聚合后是否進行預電泳則應根據(jù)需要而定，sds連續(xù)系統(tǒng)預電泳采用30ma， 60120min。 1.連續(xù)系統(tǒng) 在電極槽中倒人0.1sds ph7.2 0.1

29、moll磷酸鹽緩沖液，連接電泳儀與電泳槽，上槽接負極，下槽接正極。打開電源，將電流調(diào)至20ma，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至50ma， 待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊11.5cm處，停止電泳，一般需56h。 2.不連續(xù)系統(tǒng) 在電極槽中倒入ph8.3 trishcl電極緩沖液，內(nèi)含0.1sds即可進行電泳。在制備濃 縮膠后，不能進行預電泳，因預電泳會破壞ph環(huán)境，如需預電泳只能在分離膠聚合后，并用分離膠緩沖液進行。預電泳后將分離膠面沖洗干凈，然后才能制備濃縮膠。電泳條件也不同于連續(xù)sdspage。開始時電流為10ma左右，待樣品進入分離膠后，改為2030ma，當染料前沿距硅像膠框底邊l.5cm

30、時，停止電泳，關閉電源。 五、凝膠板剝離與固定 電泳結束后，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子橇開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標志，在兩側溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。將凝膠 板放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入固定液，固定過夜。 六、染色與脫色將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再剛脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。圖22.1樣品及標準蛋白在連續(xù)sdspag分離示意圖樣品槽1,2,4,5為待測樣品，樣品槽3自（）極至（+）極分別為磷酸化酶b（94000），牛血清清蛋白（67000），肌動蛋白（43000），碳酸酐酶（30000），煙草花葉病

31、毒（17500）七、繪制標準曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標紙上。量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，如圖22.1所示。按下式計算相對遷移率mr：相對遷移率mr以標準蛋白質(zhì)的相對遷移率為橫坐標，標準蛋白質(zhì)分子量為縱坐標在半對數(shù)坐標紙上作圖，可得到一條標準曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)樣品相對遷移率可直接在標準曲線上在出其分子量。注意事項 (1)sds純度：在sdspage中，需高純度的sds，市售化學純sds需重結晶一次或兩次方可使用.重結晶方法如下：稱20g sds放在圓底燒瓶中，加300ml無水乙醇及約半牛角匙活性碳，在燒瓶上接一冷凝管，在水浴中加熱至乙醇微沸

32、，回流約10min，用熱布氏漏斗趁熱過濾。濾液應透明，冷卻至室溫后，移至20冰箱中過夜。次日用預冷的布氏漏斗抽濾，再用少量20c預冷的無水乙醇洗滌白色沉淀3次，盡量抽干，將白色結晶置真空干燥器中干燥或置40以下的烘箱中烘干。 (2)sds與蛋白的結合量：當sds單體濃度在1mmol/l時，1g蛋白質(zhì)可與1.4g sds結合才能生成sds蛋白復合物。巰基乙醇可使蛋白質(zhì)間的二硫鍵還原，使sds易與蛋白質(zhì)結合。樣品溶解液中，sds的濃度至少比蛋白質(zhì)的量高3倍，低于這個比例，可能影響樣品的遷移率，因此，sds用量約為樣品量10倍以上。此外，樣品溶解液應采用低離子強度，最高不超過0.26，以保證在樣品溶

33、解液中有較多的sds單體。在處理蛋白質(zhì)樣品時，每次都應在沸水浴中保溫35min，以免有亞穩(wěn)聚合物存在。 (3)凝膠濃度：應根據(jù)未知樣品的估計分子量，選擇凝膠濃度。分子量在25000200000的蛋白質(zhì)選用終濃度為5的凝膠，分子量在1000070000的蛋白質(zhì)選用終濃度為10的凝膠；分子量在1000050000的蛋白選用終濃度為15的凝膠，在此范圍內(nèi)樣品分子量的對數(shù)與遷移率呈直線關系。以上各種凝膠濃度其交聯(lián)度都應是2.6。 標準蛋白質(zhì)的相對遷移率最好在0.20.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測定未知物分子量時，都應同時用標準蛋白制備標準曲線，而不是利用過去的標準曲線。用此法測定的分子量只是它

34、們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整的分子量。為測得精確的分子量范圍，最好用其他測定蛋白分子量的方法加以校正。此法對球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測定較好，對糖蛋白，膠原蛋白等分子量測定差異較大。 (4)對樣品的要求：應采納低離子強度的樣品。如樣品中離子強度高，則應透析或經(jīng)離子交換除鹽。加樣時，應保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以1015l為宜，如樣品系較稀的液體狀。為保證區(qū)帶清晰，加樣量可增加，同時應將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。 (5)由于凝膠中含sds，直接制備干板會產(chǎn)生龜裂現(xiàn)象。如需制干板，則用25異丙醇 內(nèi)含7%乙酸浸泡，并經(jīng)常換液，直至sds脫盡（約需2一3天），才可按page法制備

35、干板。為方便起見，常采用照像法，保存照片。裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出。關閉層析柱出水口，并向柱管內(nèi)加入約13柱容積的洗脫液，然后在攪拌下將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2一3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關閉出水口。接著再通過2一3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。 新裝好的柱要檢驗其均一性，可用帶色的高分子物質(zhì)如藍色葡聚糖-2000(又稱藍色右旋糖，商品名為blue dextran2000)，紅色葡

36、聚糖或細胞色素c等配成2mgml的溶液過柱，看色帶是否均勻下降，或將柱管向光照方向用眼睛觀察，看是否均勻，有無“紋路”或氣泡。若層析柱床不均一，必須重新裝柱。3.加樣 要照顧到濃度與粘度兩個方面。分析用量：l一2ml/100ml柱床容積(12)；制備用量：20一30ml100ml柱床容積。 加樣方法與一般柱層析相同。夾緊上、下進、出水口夾子，為防止操作壓改變，可將塑料管下口抬高至離柱上端約50cm處(sephadex g75，選用50cm液柱操作壓)，打開柱上端的塞子或螺絲帽。吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應避免將床面凝膠沖起，打開下口夾子。使樣品溶液

37、流人柱內(nèi)，同時收集流出液，當樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1ml洗脫液沖洗管壁2次。最后加入34ml洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽，柱進水口連通恒壓瓶，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連(如圖2l.3)。4洗脫 洗脫液應與凝膠溶脹所用液體相同。洗脫用的液體有水(多用于分離不帶電荷的中性物質(zhì))及電解質(zhì)溶液(多用于分離帶電基團的樣品)，如酸、堿、鹽的溶液及緩沖液等。對于吸附較強的組分，也有使用水與有機溶劑的混合液，如水甲醇，水乙醇、水丙酮等為洗脫劑，可以減少吸附，將組分洗下。本實驗洗脫用0.025mol/l氯化鉀02moll乙酸溶

38、液。 洗脫時，打開上、下進、出口夾子，用0.025mo1/l氯化鉀一02mol/l乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脫，用自動部分收集器收集流出液。影響洗脫液流速的因素有： (1)洗脫液加在柱上的壓力操作壓(由液面差引起)，一般來說，流速與柱壓力差成正比，但對某些種類凝膠加壓不能超過一個極限值，否則加大壓力，不僅不能增加流速，反而使流速急劇下降，特別是在使用交聯(lián)度小(wr7.5)的凝膠時要特別注意。為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。 (2)凝膠交聯(lián)度：交聯(lián)度大的凝膠(g10至g-50型)的流速與柱的壓力差成正比，與柱長成反比，與柱的直徑無關。交聯(lián)度小的凝膠(g75至g200型)的

39、流速與柱的直徑有關，并在一定操作壓差下有最大的流速值，操作壓見圖21.4。 (3)凝膠顆粒大小：顆粒大時，流速較大，但流速大時洗脫峰形常較寬。顆粒小時，流速較慢，分離情況較好。要求在不影響分離效果情況下，盡可能使流速不致太慢，以免用時過長。5.重裝 一般地說，一次裝柱后，可反復使用，無特殊的“再生”處理，只須在每次層析后用34倍柱床體積的洗脫液過柱。由于使用過程中，顆?？赡苤鸩匠练e壓緊，流速逐漸會減低，使得一次分析用時過多，這時需要將凝膠倒出，重新填裝；或用反沖方法，使凝膠松動沖起，再行沉降。有時流速改變是由于凝膠頂部有雜質(zhì)集聚，則需將混有臟物的凝膠取出，必要時可將上部凝膠攪松后補充部分新膠，

40、經(jīng)沉集、平衡后即可使用。6.凝膠的保存方法凝膠用完后，可用以下方法保存。 (1)膨脹狀態(tài)：即在水相中保存。可按注意事項(9)，加人防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。 (2)半收縮狀態(tài)：用完后用水洗凈，然后再用60一70乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫保存。 (3)干燥狀態(tài)：用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗則凝膠脫水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽濾至干，于60一80干燥后保存。這3種方法中，以干燥狀態(tài)保存為最好。二、蛋白質(zhì)分子量測定 根據(jù)待測蛋白質(zhì)的分子量范圍選用sephadex g-75或g100型凝膠，其顆粒在40120m，柱管選用直徑1.01.3cm，柱長90100

41、cm，本實驗選用1.1×l00cm商品層析柱。1. 測定v0和vi 將0.5ml藍色葡聚糖2000和硫酸銨混合液(2mgml)上柱、洗脫，分別測出ve。藍色葡聚糖的ve即為該柱的v0硫酸銨洗脫體積ve減去v0即為柱的vi。藍色葡聚糖的洗脫峰可根據(jù)顏色判斷，硫酸銨洗脫峰用ba(ac)2生成沉淀判斷。2.標準曲線的制作 按上述方法將1ml標準蛋白質(zhì)混合液上柱，然后用0.025mol/l氯化鉀0.2mol/l乙酸溶液詵脫。流速3mll0min，3ml/管。用部分收集器收集，核酸蛋白質(zhì)檢測儀280nm處檢測，記錄洗脫曲線，或收集后用紫外分光光度計于280nm處測定每管光吸收值。以管號或洗脫體

42、積為橫坐標，光吸收值為縱坐標作出洗脫曲線。 根據(jù)洗脫峰位置，量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積(ve)。然后，以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)lgmt為縱坐標，ve為橫坐標，作出標準曲線(圖21.5)。為了結果可靠，應以同樣條件重復1一2次，取ve的平均值作圖。同時根據(jù)巳測出的v0和vi以及通過測量柱的直徑和凝膠柱床高度，計算出的vt，分別求出kd和kav。 kd kav也可以kd或kav為橫坐標，lgmt為縱坐標作出標準曲線。3. 未知樣品分子量的測定完全按照標準曲線的條件操作。根據(jù)紫外檢測的洗脫峰位置，量出洗脫體積，重復測定12次，取其平均值。也可以計算出kav,分別由標準曲線查得樣品分子量。實驗四植物組織中d

43、na快速提取目的學會從植物組織中快速提取dna的方法。原理植物組織中的核酸成分為核糖核酸（rna）和脫氧核糖核酸（dna），核酸與蛋白質(zhì)結合構成核蛋白。脫氧核糖核蛋白與核糖核蛋白在電解溶液中溶解度明顯不同，據(jù)此可將二者分離。在0.15m氯化鈉溶液中，脫氧核糖核蛋白溶解度最低。而核糖核蛋白溶解在0.15m氯化鈉溶液中。利用這一點可以使脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白分開。檸檬酸三鈉鹽可以作為金屬離子的絡合劑抑制組織中脫氧核糖核酸酶對dna的降解作用，通常我們用0.15m氯化鈉、0.015m檸檬酸鈉溶液提取dna，并把該溶液稱之為ssc溶液。使用陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（sds）。為的是使dna從脫氧

44、核糖核蛋白中解離出來。而蛋白則變性沉淀從而得到純凈的dna。試劑和器材一、 實驗材料黃化植物幼苗二、 試劑：（1） 1×ssc溶液（0.15m氯化鈉，0.015m檸檬酸鈉，ph7.0）稱取8.77克氯化鈉，4.41克檸檬酸三鈉用蒸餾水定容至1000毫升。（2） 10×ssc溶液（1.5m氯化鈉，0.15m檸檬酸鈉，ph7.0）稱取87.7克氯化鈉，44.1克檸檬酸三鈉用蒸餾水定容至1000毫升。（3） 0.1×ssc溶液：1×ssc溶液用蒸餾水稀釋10倍即成。（4） 提取液0.45m氯化鈉，0.045m檸檬酸三鈉鹽，0.1m四乙酸乙二胺（edta），1%

45、十二烷基硫鈉（sds）：稱取26.31克氯化鈉，13.23克檸檬酸鈉，37.20克edta，10克sds，溶于800毫升蒸餾水中，以氫氧化鈉ph至7定容至1000毫升。（5） 氯仿異戊醇混合液：氯仿（分析純）：異戊醇（分析純）24：1（v/v）（6） 5m高氯酸鈉（7） 95%乙醇三、 器材：（1） 天平（2） 剪刀（3） 研缽（4） 量筒（5） 三角瓶（6） 離心機（7） 刻度試管（8） 恒溫水?。?） 冰箱（10） 溫度計操作方法1 稱取室溫內(nèi)萌發(fā)的植物幼苗一定量（在100克以內(nèi)不限量），剪碎，放在研缽內(nèi)，加入等量（w/v）的提取緩沖液，劇烈研磨35分鐘，使其成為漿狀物且量體積。2 將這一

46、漿狀物轉移到一磨口三角瓶中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，塞好瓶塞，劇烈搖動30秒鐘，以脫去組織蛋白質(zhì)。3 室溫下離心（4000轉/分，5分鐘），形成三層，小心吸取上層含有核酸的水溶液且量體積，棄去中間的細胞碎片，變性蛋白質(zhì)層及下層的氯仿。4 將收集的核酸水溶液倒入一個在72水浴中預熱的試管中并在72下繼續(xù)保溫34分鐘，（不要超過4分鐘），以滅活組織內(nèi)的dna酶，然后迅速取出試管放在冰水浴中冷卻至室溫。5 加入5m濃度的高氯酸鈉溶液(4：1體積比)使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1m。6 再次加人等體積的氯仿一異戊醇混合液，并在帶塞的三角瓶中搖晃20秒鐘。7 將此乳濁液在室溫下離心(4000轉/分

47、，5分鐘)，收集上層含核酸的水溶液量其體積8 將收集的核酸水溶液置于燒杯內(nèi)，然后用滴管慢慢加入此水溶液二倍體積的95的預冷的乙醇于水溶液表面上，用玻璃棒輕輕攪拌，此時核酸將迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。9 將沉淀物在燒杯壁上輕輕擠壓以除去乙醇，然后溶解在適量的0.1×ssc溶液中待完全溶解后，加入此溶液十分之一體積的1×ssc，使最終的溶液為1×ssc。10 按照8的步驟，再次用乙醇沉淀核酸并且按9的步驟將核酸溶解，即得到dna的粗制品。11 加入預先處理過的rna酶溶液使其最后作用濃度為50-70毫克毫升，并在37下保溫30分鐘以除去rna。12 加入等體積的

48、氯仿異戊醇溶液，在三角瓶中搖晃30秒鐘，再次除去殘留蛋白質(zhì)及所加的rna酶。然后以前述方法離心并收集上層水溶液。13 按照8的步驟再次沉淀dna，并按照9的步驟將其溶解，即可得到純化的dna溶液。結果測定以l×ssc為空白對照，分別在230nm，260nm和280nm波長處測定樣品的光密度值，且求出260nm230nm及260nm280nm的比值，如果前者的比值大于2，后者的比值大于1.8的話，那么此樣品就可以作為生化試劑用。否則要繼續(xù)去蛋白。思考題1.在沉淀dna時，為什么自溶劑內(nèi)加入二倍體積的95的預冷乙醇?2.此方法的實際意義何在?實驗五 脂肪酸價的測定目的初步掌握測定油脂酸價

49、的原理和方法了解測定酸價的實際意義。原理脂肪及油類在空氣中暴露較久之后，部分脂肪的氧化成游離脂肪酸及醛類，某些低級脂肪酸(如丁酸)及醛類都有酸臭味，這種現(xiàn)象叫酸敗。因此測定脂肪中游離脂肪酸的含量是檢查脂肪質(zhì)量的主要指標之一，食品工業(yè)中用酸價來表示油脂食物的新鮮，優(yōu)劣程度，酸價就是中和一克脂肪所需的氫氧化鉀毫克數(shù)(也稱作酸值)。脂肪中游離脂肪酸含量越高，酸值越大，脂肪的質(zhì)量越差。采用酸堿中和滴定原理進行測定。試劑和器材一、試劑i乙醇乙醚混合液(1：1)，調(diào)成中性。22酚酞指示劑30.lmoll koh標準溶液4豆油二、器材：1錐形瓶(250m1)(干燥)2堿式滴定管(5ml) 3量筒4滴定臺操作

50、方法 用差數(shù)法準確稱取油樣3g二份，分別放于錐形瓶中，另取一錐形瓶不加油樣作為空白，在三個瓶中各加50 m1乙醇乙醚混合液，搖勻，得透明溶液，加入1%酚酞指示劑12滴，用0.1mollkoh溶液滴定至溶液呈粉紅色為止(持續(xù)半分鐘不褪色)，按下式求算酸值。 酸值m為koh標準溶液摩爾濃度實驗六維生素c的定量測定目的1. 學習定量測定維生素c的原理和方法。2. 進一步掌握滴定法的基本操作技術。3. 了解蔬菜、水果中維生素c的含量。原理 維生意c是人類營養(yǎng)中量重要的維生素之一，缺乏時會產(chǎn)生壞血病，因此又稱為抗壞血酸，它為l系糖構型的不飽和多羥化合物，易溶于水，屬于水溶性維生素。維生素c分布很廣，植物

51、的綠色部分及許多水果(桔、山楂、草莓等)的含量更為豐富。 維生素c具有很強的還原性，在微酸性環(huán)境中，抗壞血酸能將染料2，6一二氯酚靛酚還原成無色的還原型2，3一二氯酚靛酚同時將抗壞血酸氧化成脫氫抗壞血酸。 抗壞血酸2，6二氯酚靛酚（紅色）脫氫抗壞血酸還原型2，6二氯酚靛酚（無色） 當溶液由無色轉變成微紅色時。表示溶液中抗壞血酸全部被氧化，即為滴定終點。從滴定時消耗2，6二氯酚靛酚標準溶液的量，可計算出被檢物中抗壞血酸含量。 由于抗壞血酸極易氧化，所以提取時，加入草酸，三氯乙酸，鹽酸等抑制維生素c氧化酶的活力。試劑和器材 一、試劑： 1. 桔皮、水果或蔬菜。 2. 抗壞血酸標準液(1mllmgv

52、c)：精確稱取純抗壞血酸l00mg，用1草酸溶解，定容至100ml。 3. 0.00lmoll 2，6二氯酚靛酚溶液：稱取2，6一二氯酚靛酚50mg溶于150ml熱水中(內(nèi)含碳酸氫鈉42mg)冷卻后定容至200ml，盛于棕色瓶中于冰箱保存。使用前用抗壞血酸標準溶液標定其濃度，方法如下： 準確吸取抗壞血酸標準液2ml，加2%草酸2ml，用上述2，6二氯酚靛酚溶液滴定至微紅色從消耗的滴定量計算2，6二氯酚靛酚的濃度，最后將其調(diào)至每ml相當于抗壞血酸0.088mg。4. 2草酸。5. 1草酸。二、器材：1. 吸量管(5m1)。2. 容量瓶(100ml)。3. 微量滴定管(5ml)。4. 漏斗、濾紙。

53、5. 錐形瓶。6. 玻璃棒。7. 勻漿器(或組織搗碎機)。8. 分析天平。9. 燒杯100ml。10.量筒100ml。操作方法 1. 準確稱取樣品(蔬菜或水果)20g與2草酸溶液20ml一同放入勻漿器內(nèi)攪成勻漿。 2. 將上述勻漿傾入l00ml容量瓶，以1萆酸溶液定容。 3. 充分混勻后過濾、取濾液。4. 吸取濾液5ml于錐形瓶內(nèi)，以0.001moll 2，6一二氯酚靛酚滴定，邊滴邊攪拌， 至粉紅色出現(xiàn)面能在15秒鐘不褪色為止，記錄滴定量，按下式計算樣品vc含量。100g樣品中所含抗壞血酸毫克數(shù) 式中：v0.001moll2，6一二氯酚靛酚的滴定量(ml)。 w稱取的樣品量(g)。 注 1. 該