滅菌工藝驗證

1、1濕熱滅菌工藝的微生物學驗證知識濕熱滅菌工藝的微生物學驗證知識2概念與方式概念與方式n基礎概念基礎概念n滅菌工藝滅菌工藝 n無菌無菌n藥品達到無菌要求的兩種方式藥品達到無菌要求的兩種方式 n無菌生產(chǎn)工藝無菌生產(chǎn)工藝n最終滅菌最終滅菌 3兩種生產(chǎn)方式的比較兩種生產(chǎn)方式的比較n無菌生產(chǎn)工藝的局限無菌生產(chǎn)工藝的局限n通常的無菌保證水平（通常的無菌保證水平（10-3至至10-6） n影響因素較多影響因素較多n最終滅菌工藝的優(yōu)點最終滅菌工藝的優(yōu)點n賦予產(chǎn)品更高的無菌保證水平賦予產(chǎn)品更高的無菌保證水平 n生產(chǎn)中可變因素少，出現(xiàn)偏差的概率低生產(chǎn)中可變因素少，出現(xiàn)偏差的概率低 n幾乎能殺滅產(chǎn)品中的所有微生物幾

2、乎能殺滅產(chǎn)品中的所有微生物 4制藥工藝中常用的滅制藥工藝中常用的滅/除菌方式除菌方式n熱力滅菌熱力滅菌 n濕熱滅菌濕熱滅菌 （118-134）-蒸汽、過熱水蒸汽、過熱水n干熱滅菌（干熱滅菌（160-320 ）-熱空氣熱空氣 n氣體滅氣體滅-環(huán)氧乙烷環(huán)氧乙烷n離子輻射滅菌離子輻射滅菌-輻射和電子束輻射輻射和電子束輻射n過濾除菌法過濾除菌法-過濾名義孔徑小于等于過濾名義孔徑小于等于0.2m 5熱力滅菌的基本原理熱力滅菌的基本原理n濕熱滅菌濕熱滅菌導致細胞內(nèi)關鍵性蛋白質(zhì)導致細胞內(nèi)關鍵性蛋白質(zhì)和酶發(fā)生熱變性或凝固和酶發(fā)生熱變性或凝固.濕度對該破壞濕度對該破壞性過程起促進作用性過程起促進作用.n干熱滅菌

3、干熱滅菌-使微生物氧化而不是蛋白使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性質(zhì)變性. 6細菌細胞結(jié)構細菌細胞結(jié)構 n細胞質(zhì)膜細胞質(zhì)膜n細胞壁細胞壁n莢膜莢膜n異染顆粒異染顆粒n線毛線毛n鞭毛鞭毛n色素體色素體n脂質(zhì)顆粒脂質(zhì)顆粒n中體中體n核糖體核糖體n擬核擬核n模隔壁模隔壁7濕熱滅菌的熱力學基礎濕熱滅菌的熱力學基礎水-蒸汽系統(tǒng)處在飽和狀態(tài)時的性質(zhì)溫度壓力Bar焓（內(nèi)部熱量）J/g水hLh*蒸汽hV1001.013419225626751151.692483221626991201.987504220227061212.026508219927071252.32252521882713飽和蒸汽表h = hV-h

4、L，凝結(jié)或汽化潛熱，1 Atmosphere = 1.013 bar = 14.71 psia8熱力滅菌設備熱力滅菌設備n過熱水滅菌釜過熱水滅菌釜n干熱滅菌釜干熱滅菌釜n蒸汽滅菌釜蒸汽滅菌釜9濕熱滅菌工藝研發(fā)與確認濕熱滅菌工藝研發(fā)與確認滅菌工藝的驗證工藝研發(fā)階段工藝確認階段方法設計裝載類型工藝類型工藝開發(fā)性能確認連續(xù)控制非產(chǎn)品特異性滅菌工藝(過度殺滅法) 產(chǎn)品特異性滅菌工藝蒸汽不可透過型物品(液體型) 蒸汽可透過型物品飽和蒸汽型 預真空式 重力式空氣超壓型 蒸汽/空氣混和方式 過熱水方式確定參數(shù) 升溫階段 保溫階段 降溫階段物理學方法 溫度分布 熱穿透生物學方法日常放行 工藝評估 系統(tǒng)適用性再

5、確認變更控制10最終滅菌產(chǎn)品無菌的標準最終滅菌產(chǎn)品無菌的標準.無菌檢查結(jié)果合格-存在局限性批檢不合格率、實際污染率和取樣量之間的相互關系取樣量實際污染率0.1151015100.010.090.400.660.80200.020.180.650.890.9650 0.050.340.920.991000.090.630.993000.260.9530000.9511最終滅菌產(chǎn)品無菌的標準最終滅菌產(chǎn)品無菌的標準n通過物理通過物理/生物學方法證明，單位產(chǎn)生物學方法證明，單位產(chǎn)品內(nèi)微生物存在的概率不超過百萬品內(nèi)微生物存在的概率不超過百萬分之一分之一(即批產(chǎn)品的污染概率不超過即批產(chǎn)品的污染概率不超過百

6、萬分之一百萬分之一). 可實現(xiàn)參數(shù)放行可實現(xiàn)參數(shù)放行12影響滅菌效果的因素影響滅菌效果的因素n物理化學條件物理化學條件 .環(huán)境因子環(huán)境因子 .芽孢是否處于被包裹狀態(tài)芽孢是否處于被包裹狀態(tài)n濕度濕度n微生物的熱致死特性微生物的熱致死特性13適于濕熱滅菌工藝驗證的微生物適于濕熱滅菌工藝驗證的微生物菌種名稱D121 值范圍(min)嗜熱脂肪芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilus 1.5-3.0枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis0.3-0.7凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans 0.4-0.8梭狀芽孢桿菌Clostridum sporogenes0

7、.4-1.0 14實現(xiàn)無菌要求的標準手段實現(xiàn)無菌要求的標準手段n熱穩(wěn)定性產(chǎn)品熱穩(wěn)定性產(chǎn)品(過度殺滅過度殺滅) 美國美國 產(chǎn)品滅菌工藝的產(chǎn)品滅菌工藝的F0值不低于值不低于12分鐘分鐘; 歐盟歐盟 12115分鐘分鐘n熱敏感性產(chǎn)品熱敏感性產(chǎn)品 控制產(chǎn)品在滅菌前的帶菌量控制產(chǎn)品在滅菌前的帶菌量 產(chǎn)品滅菌工藝的產(chǎn)品滅菌工藝的F0值不低于值不低于8分鐘分鐘. 15藥典要求藥典要求nEP 對過度殺滅法的工藝要求：對過度殺滅法的工藝要求： 對溶液的滅菌條件至少為對溶液的滅菌條件至少為121oC 15 分鐘；分鐘；也可采用其它組合條件，但滅菌效果須與上也可采用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。述相等效。

8、 目標：無菌保證值（目標：無菌保證值（SAL，污染概率的負對數(shù)），污染概率的負對數(shù)）大于等于大于等于12。16藥典要求藥典要求nUSP 對過度殺滅法的工藝要求：對過度殺滅法的工藝要求： 對溶液的滅菌條件需達到對溶液的滅菌條件需達到12D ，至少為，至少為12 分分鐘。鐘。n設計目的：設計目的： 使使D121=1分鐘，數(shù)量為分鐘，數(shù)量為106的微生物經(jīng)過滅的微生物經(jīng)過滅菌后達到菌后達到SAL= 10-6。17滅菌程序的開發(fā)與設計滅菌程序的開發(fā)與設計n根據(jù)滅菌前帶菌量進行設計根據(jù)滅菌前帶菌量進行設計 基于對滅菌前產(chǎn)品所含微生物的耐熱特性和數(shù)量以及產(chǎn)品的基于對滅菌前產(chǎn)品所含微生物的耐熱特性和數(shù)量以及

9、產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性 滅菌后產(chǎn)品的污染概率須小于滅菌后產(chǎn)品的污染概率須小于10-6。n過度殺滅法過度殺滅法 基于工藝程序能殺滅更加耐熱微生物，并且再加上基于工藝程序能殺滅更加耐熱微生物，并且再加上 一定的安全系數(shù)；一定的安全系數(shù)； 理論上對生物指示劑孢子的殺滅能力達到理論上對生物指示劑孢子的殺滅能力達到10-12。n將兩者相結(jié)合將兩者相結(jié)合 兼顧產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和無菌要求。兼顧產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和無菌要求。18滅菌程序的效力測定滅菌程序的效力測定n生物學手段（生物學手段（FBiological） 用特定的生物指示劑作為標準微生物制劑用特定的生物指示劑作為標準微生物制劑 數(shù)據(jù)直接反映滅菌效果數(shù)據(jù)直接

10、反映滅菌效果 有時可取代物理手段的不足有時可取代物理手段的不足(如探頭無法放入安瓿瓶如探頭無法放入安瓿瓶) 局限性：較難進行統(tǒng)計學分析局限性：較難進行統(tǒng)計學分析n物理物理/數(shù)學手段（數(shù)學手段（FPhysical） 用滅菌值用滅菌值F0作為評價標準作為評價標準 精確測定熱分布和熱穿透狀況精確測定熱分布和熱穿透狀況 便于準確計算不同滅菌條件下的滅菌效果便于準確計算不同滅菌條件下的滅菌效果 測量數(shù)據(jù)便于統(tǒng)計學分析測量數(shù)據(jù)便于統(tǒng)計學分析19滅菌工藝驗證滅菌工藝驗證n確認（確認（IQ、OQ） 滅菌設備的運行符合設計要求滅菌設備的運行符合設計要求n驗證（驗證（PQ） 產(chǎn)品滅菌程序的有效性和重現(xiàn)性產(chǎn)品滅菌程

11、序的有效性和重現(xiàn)性n評估評估 滅菌時產(chǎn)品可能發(fā)生的變化給滅菌效果帶來滅菌時產(chǎn)品可能發(fā)生的變化給滅菌效果帶來的影響的影響20滅菌工藝驗證滅菌工藝驗證-IQ/OQ n檢查設備構造、控制檢查設備構造、控制/監(jiān)測系統(tǒng)、運行系統(tǒng)、安全系統(tǒng)及所監(jiān)測系統(tǒng)、運行系統(tǒng)、安全系統(tǒng)及所有零部件均與采購要求相同；有零部件均與采購要求相同；n控制控制/監(jiān)測儀表的校驗，包括程序控制器、溫度、壓力和時監(jiān)測儀表的校驗，包括程序控制器、溫度、壓力和時間控制設備，以及計時器、記錄測量儀等；間控制設備，以及計時器、記錄測量儀等；n試車試車空載熱分布試驗空載熱分布試驗 溫度探頭溫度探頭10-20支；探頭精確度支；探頭精確度0.5 o

12、C; 須有探頭與腔室原探頭并列放置須有探頭與腔室原探頭并列放置; 檢測報警和安全系統(tǒng)的可靠性檢測報警和安全系統(tǒng)的可靠性; 真空系統(tǒng)的可靠性真空系統(tǒng)的可靠性(產(chǎn)生的效率、維持時間等產(chǎn)生的效率、維持時間等); 滅菌溫度下，各點間最大溫差（腔室內(nèi)的）滅菌溫度下，各點間最大溫差（腔室內(nèi)的） = 2 oC；同一點的最大溫；同一點的最大溫差差1.0 oC; 重復試驗至少重復試驗至少3次以證明重現(xiàn)性次以證明重現(xiàn)性21滅菌工藝驗證滅菌工藝驗證PQ (一一) n每種裝載方式下的熱穿透試驗每種裝載方式下的熱穿透試驗 證明特定滅菌程序殺滅微生物的均一性和有效性證明特定滅菌程序殺滅微生物的均一性和有效性; 重復性試驗

13、證明滅菌程序的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性重復性試驗證明滅菌程序的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性; 證明滅菌程序?qū)Ρ粶缇锲返南嗳菪宰C明滅菌程序?qū)Ρ粶缇锲返南嗳菪? n容器內(nèi)部產(chǎn)品的熱穿透試驗容器內(nèi)部產(chǎn)品的熱穿透試驗 證明在每種裝載方式下各點的均一性、程序的重現(xiàn)證明在每種裝載方式下各點的均一性、程序的重現(xiàn)性性 證明最冷點處所獲得的滅菌效果符合既定要求。證明最冷點處所獲得的滅菌效果符合既定要求。22滅菌工藝驗證滅菌工藝驗證PQ (二二) n生物指示劑試驗生物指示劑試驗 結(jié)果與熱穿透試驗保持一致結(jié)果與熱穿透試驗保持一致 所有測試點均應確保所有測試點均應確保SAL 不低于不低于6 試驗次數(shù)足以符合統(tǒng)計學要求（至少重復試驗次數(shù)足

14、以符合統(tǒng)計學要求（至少重復3次試驗，指示劑數(shù)量次試驗，指示劑數(shù)量10 20 支支/次）。次）。23再驗證和變更管理再驗證和變更管理n再驗證再驗證 進行再驗證的條件進行再驗證的條件 設備、產(chǎn)品、工藝有重大改變，或設備有重大維修設備、產(chǎn)品、工藝有重大改變，或設備有重大維修 定期的常規(guī)再驗證（一次定期的常規(guī)再驗證（一次/12-24 月）月） 驗證方法驗證方法 通常與初次通常與初次PQ 方案相同。方案相同。n變更管理變更管理 有相關有相關SOP 來評價變更對工藝的潛在影響來評價變更對工藝的潛在影響 根據(jù)變更評估結(jié)果確定再驗證的范圍根據(jù)變更評估結(jié)果確定再驗證的范圍24無菌的影響因素無菌的影響因素nNt

15、= N0 -NR PNSU = N0 -DR Nt 滅菌后微生物殘存量；滅菌后微生物殘存量； PNSU -非無菌品概率；非無菌品概率； N0 -滅菌前微生物含量；滅菌前微生物含量； N0 -滅菌前產(chǎn)品的污染滅菌前產(chǎn)品的污染水平；水平； NR -滅菌時的殺滅量。滅菌時的殺滅量。 DR -滅菌時的殺滅水平。滅菌時的殺滅水平。25熱力滅菌的基本規(guī)律熱力滅菌的基本規(guī)律n在一定溫度下微生物數(shù)量的對數(shù)在一定溫度下微生物數(shù)量的對數(shù)值與滅菌時間的線性關系值與滅菌時間的線性關系微生物數(shù)量的對數(shù)值隨滅菌時間的增加而減少微生物數(shù)量的對數(shù)值隨滅菌時間的增加而減少26耐熱參數(shù)耐熱參數(shù)D 值的定義值的定義nD 值指一定溫

16、度下，將微生物殺滅值指一定溫度下，將微生物殺滅90（即（即下降一個對數(shù)單位）所需要的時間（下降一個對數(shù)單位）所需要的時間（Time for decimal reduction）27D T值的影響因素值的影響因素n.挑戰(zhàn)微生物的種類挑戰(zhàn)微生物的種類n.挑戰(zhàn)微生物的貯存條件挑戰(zhàn)微生物的貯存條件n.挑戰(zhàn)微生物的恢復生長和培養(yǎng)條件挑戰(zhàn)微生物的恢復生長和培養(yǎng)條件n.滅菌釜的滅菌工藝溫度滅菌釜的滅菌工藝溫度n.DT值測定開始前的起始溫度值測定開始前的起始溫度n.懸浮液和恢復生長用培養(yǎng)基種類懸浮液和恢復生長用培養(yǎng)基種類n.滅菌結(jié)束后的放置溫度與時間滅菌結(jié)束后的放置溫度與時間n.蒸汽的飽和度蒸汽的飽和度n.原

17、始包裝材料原始包裝材料28耐熱參數(shù)耐熱參數(shù)Z 值的定義值的定義nZ 值是指當某種微生物的值是指當某種微生物的D值下降（或上升）值下降（或上升）一個對數(shù)（一個對數(shù)（log ）單位時，其溫度應升高）單位時，其溫度應升高（或降低）的度數(shù)。（或降低）的度數(shù)。29滅菌率的概念滅菌率的概念n滅菌率滅菌率(L值值)系指在某溫度下滅菌系指在某溫度下滅菌1分鐘所分鐘所相應的標準滅菌時間相應的標準滅菌時間(分鐘分鐘)，即，即F0和和FT的的比值比值(LF0/FT)。當。當Z10時，不同溫度下時，不同溫度下的的L值是不同的。值是不同的。30商購生物指示劑的確認商購生物指示劑的確認n1. 進行形態(tài)學和純度確認進行形態(tài)

18、學和純度確認(至少鑒別至菌屬至少鑒別至菌屬) n2. 芽孢計數(shù)復核芽孢計數(shù)復核-蒸汽滅菌工藝用蒸汽滅菌工藝用BI，95-100下暴熱預處理下暴熱預處理15 分分鐘鐘-環(huán)氧乙烷和干熱滅菌工藝用環(huán)氧乙烷和干熱滅菌工藝用BI，80-85下暴熱預下暴熱預處理處理10 分鐘分鐘-預處理后迅速轉(zhuǎn)移至冰水浴內(nèi)預處理后迅速轉(zhuǎn)移至冰水浴內(nèi)-合格標準：合格標準：Log( 實測值實測值)在在0.3-1.48Log( 標示值標示值)之間之間3. D值復核值復核(視實驗室能力而定視實驗室能力而定) 31F0的定義及其意義的定義及其意義nF0是指在某特定溫度下所產(chǎn)生的滅菌效果與在是指在某特定溫度下所產(chǎn)生的滅菌效果與在121.1oC下相等效時所需要的滅菌時間（分鐘）下相等效時所需要的滅菌時間（分鐘）.n121.1 oC 或或250 oF表示表示100 KPa 飽和蒸汽的溫度飽和蒸汽的溫度, 為為標準滅菌溫度；標準滅菌溫度；nF 0值用于評價熱（濕值用于評價熱（濕/干熱）滅菌工藝的對微生物的殺滅干熱）滅菌工藝的對微生物的殺滅效果效果. nF0值可用來比較不同溫度下的滅菌效果值可用來比較不同溫度下的滅