基因的定位克隆知識探索

1、 基因的定位克隆1風(fēng)音書屋千奇百怪的突變體這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢？這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢？突變體突變體:是某個性狀發(fā)生可遺傳變異的材料，或某個基因發(fā)生突變的材料。水稻水稻2風(fēng)音書屋（mapping）：3風(fēng)音書屋一、連鎖分析（一、連鎖分析（linkage analysislinkage analysis）1 1）概念：）概念： 基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位

2、。一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位。4風(fēng)音書屋2 2）重組值（）重組值（recombination fractionrecombination fraction） 是基因定位時兩個基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgancentimorgan，cmcm）交換值交換值(rf)(%)=重組重組型的配子數(shù)型的配子數(shù)/總配子數(shù)總配子數(shù)100% 重組值越大，說明兩基因間的距離越遠，基因間的連重組值越大，說明兩基因間的距離越遠，基因間的連鎖強度越??；重組值越小，說明基因間的距離越近，基因鎖強度越??；重組值越小，說明基因間的

3、距離越近，基因間的連鎖強度越大。間的連鎖強度越大。5風(fēng)音書屋 3）遺傳標記（）遺傳標記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進行基因定位需要已知的用連鎖分析發(fā)法進行基因定位需要已知的dna序列作為遺序列作為遺傳標記，這些標記按孟德爾方式遺傳，標記位點應(yīng)是多態(tài)的。傳標記，這些標記按孟德爾方式遺傳，標記位點應(yīng)是多態(tài)的。 4）遺傳多態(tài)性：）遺傳多態(tài)性：是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，且各個等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于基因，且各個等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。6風(fēng)音書屋二、三點測交(three-point testcross)與染

4、色體作圖 為了進行基因定位，摩爾根和他的學(xué)生sturtevant創(chuàng)造了三點測交方法，即將3個基因包括在同一次交配中。進行這種測交，一次實驗就等于3次兩點試驗。 已知在果蠅中棘眼(ec)、截翅(ct)和橫脈缺失(cv)這3個隱性突變基因都是x連鎖的。把棘眼、截翅個體與橫脈缺失個體交配,得到3個基因的雜合體ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列不代表它們在x染色體的真實順序)，取其中3雜合體雌蠅再與3隱性體ec ct cv/y雄蠅測交，測交后代如下表。7風(fēng)音書屋序號表型實得數(shù)1ec ct +2125親本型2+ + cv22073ec + cv273單交換i型4+ ct +2655e

5、c + +217單交換ii型6+ ct cv2237+ + +5雙交換型8ec ct cv3合計5318ec ct +/ + + cv ec ct cv/y測交后代數(shù)據(jù)8風(fēng)音書屋結(jié)果分析1、歸類2、確定正確的基因順序 用雙交換型與親本類型相比較，發(fā)現(xiàn)改變了位置的那個基因一定是處于中央的位置，因為雙交換的特點是旁側(cè)基因的相對位置不變，僅中間的基因發(fā)生變動。于是可以斷定這3 個基因正確排列順序是ec cv ct。親本型ec ct + + cv雙交換型+ + +ec ct cv9風(fēng)音書屋ec ct + + cvec + ct+ cv +ct ec + + cvec + + ct cvec cv ct

6、+ + +ct + + ec cv10風(fēng)音書屋3、計算重組值，確定圖距(1)、計算ctcv的重組值 忽視表中第一列(ec/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第二、三列：(ec) ct +2125非重組(+) + cv2207(ec) + cv273非重組(+) ct +265(ec) + +217重組(+) ct cv223(+) + +5重組(ec) ct cv3ctcv間重組率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8.4%=8.4cm11風(fēng)音書屋(3)、計算ecct的重組值 忽視表中第三列(+/cv)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、二列：ec ct (+)2125非重組+

7、 + (cv)2207ec + (cv)273重組+ ct (+)265ec + (+)217重組+ ct (cv)223+ + (+)5非重組ec ct (cv)3ecct間重組率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cm12風(fēng)音書屋(2)、計算eccv的重組值 忽視表中第二列(ct/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、三列：ec (ct) +2125非重組+ (+) cv2207ec (+) cv273重組+ (ct) +265ec (+) +217非重組+ (ct) cv223+ (+) +5重組ec (ct) cv3eccv間重組率=(273+265+

8、5+3)/5318=10.2%=10.2cm13風(fēng)音書屋4、繪染色體圖eccvct10.28.418.418.6在計算eccv和cvct的重組值時都利用了雙交換值，可是計算ecct時沒把它計在內(nèi)，因為它們間雙交換的結(jié)果并不出現(xiàn)重組。所以ecct之間的實際雙交換值應(yīng)當(dāng)是重組值加2倍雙交換值。即18.4%+20.1%=18.6%。當(dāng)三點測交后代出現(xiàn)8種表型時,表明有雙交換發(fā)生,此時需用2倍雙交換值來作校正。若3個基因相距較近，往往不出現(xiàn)雙交換類型,后代只有6種表型,無需校正。標記標記1標記標記2目標基因目標基因14風(fēng)音書屋 三、圖位克隆 圖位克?。╩ap-based cloning）又稱定位克隆，

9、該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法，其原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對穩(wěn)定的基因座，在利用分子標記技術(shù)對目的基因進行精確定位的基礎(chǔ)上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標記篩選dna文庫，從而構(gòu)建的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步行（chromosome walking）逼近目的基因或通過染色體登陸（chromosome landing）（tanksley et al.，1995）的方法最終找到包含目的基因的克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證最終確定目的基因的堿基序列。15風(fēng)音書屋 圖位克隆的特點是無需預(yù)先知道基因的dna順序，也無需預(yù)先知道其表

10、達產(chǎn)物的有關(guān)信息，但應(yīng)有以下兩方面兩方面的基本情況。 一是一是有一個根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體,即定位群體，如：f2、dh、bc、ri等。16風(fēng)音書屋 二是二是開展以下幾項工作：（1）首先找到與目的基因緊密連鎖的分子標記；（2）用遺傳作圖和物理作圖將目標基因定位在染色體上的特定位置；（3）構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫；（bac或yac）；（4）以與目的基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫；（5）用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；（6）通過染色體步行、登陸或跳躍獲得帶有目的基因的大片段克??；（7）通過亞克隆獲得帶有目的基因的小片段克??；（8）通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證最終

11、確定目標基因的堿基序列17風(fēng)音書屋m1m2構(gòu)建遺傳圖譜構(gòu)建物理圖譜染色體步移： chromosome walking 篩選基因組文庫序列分析與功能鑒定對于基因組還未測序的物種可通過染色體步移的方法進行定位，但是對于基因組還未測序的物種可通過染色體步移的方法進行定位，但是比較費時費力，而對于水稻、擬南芥等基因組測序工作已經(jīng)完成的物比較費時費力，而對于水稻、擬南芥等基因組測序工作已經(jīng)完成的物種，則不在利用染色體步移的方法進行定位，直接從構(gòu)建遺傳圖譜到種，則不在利用染色體步移的方法進行定位，直接從構(gòu)建遺傳圖譜到構(gòu)建物理圖譜，最后確定目標基因的候選基因，再通過互補實驗進行構(gòu)建物理圖譜，最后確定目標基因

12、的候選基因，再通過互補實驗進行驗證。驗證。18風(fēng)音書屋四、分子標記n分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是dna水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。n現(xiàn)在dna分子標記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。 19風(fēng)音書屋分子標記的種類 n一、基于分子雜交技術(shù)的分子標記技術(shù)一、基于分子雜交技術(shù)的分子標記技術(shù)：限制性片斷限制性片斷長度多態(tài)性長度多態(tài)性(restriction fragment length (restriction fragment length polymorphismpolymorphism，rf

13、lprflp) )n二、基于二、基于pcrpcr技術(shù)的分子標記技術(shù)：隨機擴增多態(tài)技術(shù)的分子標記技術(shù)：隨機擴增多態(tài)性性dna (random amplified polymorphism dnadna (random amplified polymorphism dna，rapdrapd ) )簡單重復(fù)序列簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat(simple sequence repeat，ssrssr) )n三、基于限制性酶切和三、基于限制性酶切和pcrpcr技術(shù)的技術(shù)的dnadna標記標記 ：擴增擴增片段長度多態(tài)性片段長度多態(tài)性(amplified fragment le

14、ngth (amplified fragment length polymorphismpolymorphism，aflpaflp ) ) n四、基于四、基于dnadna芯片技術(shù)的分子標記技術(shù)芯片技術(shù)的分子標記技術(shù) ：核苷酸多態(tài)核苷酸多態(tài)性性(single nucleotide polymorphism(single nucleotide polymorphism，snpsnp) ) 20風(fēng)音書屋 ssr即微衛(wèi)星dna，是一類由幾個（多為1-5個）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的dna序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（ca）n、（at）n、（ggc）n等重復(fù)。不同

15、遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了ssr長度的高度變異性，這一變異性正是ssr標記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星dna分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計一對特異引物，通過pcr技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星dna序列擴增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即ssr標記。 ssr21風(fēng)音書屋五、基因初步定位 目的基因的初步定位(mapping the target gene)是利用分子標記技術(shù)在一個目標性狀的分離群體中把目的基因定位于染色體的一定區(qū)域內(nèi)。 初定位通常使用近等基因系法(near-isogenic lines, nils)或群組分離分析法

16、(bulk segregant analysis, bsa)。22風(fēng)音書屋n近等基因系是指只有目標性狀基因有差異，其它性狀基因相同的2個群體，可以通過連續(xù)回交的途徑獲得。n由于近等基因系需要連續(xù)的回交，所需的時間較長，因此michelmore等(1991)提出了群組分離分析法（bsa法），將分離群體中研究的目標性狀根據(jù)其類型(如抗病、感病)分成2組，將每組內(nèi)一定數(shù)量的植株dna 等量混合，形成兩個池，這兩個池僅在目標性狀(如抗病性)上有差異。利用分子標記技術(shù)尋找兩個池的擴增譜帶的差異，這種多態(tài)性極可能與目標基因連鎖。再用所有的分離后代單株，驗證該多態(tài)性是否真正與目標基因連鎖及連鎖距離的確定。2

17、3風(fēng)音書屋六、精細定位 在初步定位基礎(chǔ)上，設(shè)計并篩選離親本更近且在兩親本之間表現(xiàn)多態(tài)性的引物，然后利用f2群體中的突變體檢測篩選到的親本間多態(tài)性引物，逐步縮小范圍，將目的基因定位到染色體上一個很小的物理區(qū)間內(nèi)。24風(fēng)音書屋 舉例說明：利用ssr標記進行水稻drawf1基因的定位25風(fēng)音書屋基本實驗方法nf2定位群體構(gòu)建n植物總dna的提取npcr反應(yīng)n聚丙烯酰胺凝膠電泳n引物設(shè)計26風(fēng)音書屋f2群體構(gòu)建27風(fēng)音書屋引物設(shè)計常用軟件及網(wǎng)站設(shè)計軟件： primer3.0/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiprimer5.0（尋

18、找酶切位點，設(shè)計引物）webprimer/cgi-bin/web-primer序列分析軟件：dnastar（分析序列特征，引物質(zhì)量，編輯序列）28風(fēng)音書屋基因的初步定位（bsa法）篩選親本間多態(tài)性引物篩選池間多態(tài)性引物 小群體驗證29風(fēng)音書屋初步定位帶型分析正常親本突變親本突變池正常池rm1（親本之間有多態(tài)，池間無多態(tài)）30風(fēng)音書屋rm2(親本和池之間均有多態(tài)）正常親本突變親本突變池正常池31風(fēng)音書屋 總結(jié)：如果親本與池之間同時存在多態(tài)性的引物很有可能和目標基因連鎖，因此再通過小群體進行驗證（重組交換值應(yīng)該小于50%），則可將目標基因定位到與其

19、連鎖的標記所在的染色體上。我們初步定位的結(jié)果是否準確呢？接下來就要用我們初步定位的結(jié)果是否準確呢？接下來就要用一些突變體進行驗證，看一下我們所選定的標記與目一些突變體進行驗證，看一下我們所選定的標記與目標基因是否真正連鎖標基因是否真正連鎖32風(fēng)音書屋遺傳距離=（單交換+雙交換2）/（突變體總數(shù) 2） 100引物名稱連鎖植株數(shù)目單交換植株數(shù)目雙交換植株數(shù)目rm1150191rm2158111rm316280rm4155150怎樣判斷目標基因與這些標記之間的位置關(guān)系及距離怎樣判斷目標基因與這些標記之間的位置關(guān)系及距離遠近呢？遠近呢？33風(fēng)音書屋 a p + - 5 10 18a p + - 6 11 12 16rm2rm334風(fēng)音書屋 交換率越高的標記離目標基因越遠，反之離目標基因越近，即對應(yīng)的交換株越多的標記離目標基因遠，交換株越少的標記離目標基因越近。35風(fēng)音書屋rm1rm2drawf1rm3rm43.8cm2.4cm2.4cm2.0cmchr.6markerdist.