兔腎VX2移植瘤模型的建立及其超聲顯像檢測(cè)

1、兔腎VX2移植瘤模型的建立及其超聲顯像檢測(cè) 作者：王子明，佘軍軍，程偉，李小鵬，李謙，車(chē)向明，韓水平，白卓亞 【關(guān)鍵詞】 超聲技術(shù) 摘要：目的 比較建立兔腎VX2移植瘤模型的不同方法的優(yōu)劣。方法 分別用瘤液穿刺法、瘤塊液種植法、瘤塊包埋法建立兔腎VX2癌模型。采用超聲技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)腫瘤體積及CDFI的變化，確定該模型最佳實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)段及其血流參數(shù)范圍。比較各自的成瘤率；觀測(cè)腎臟腫瘤的大小及其回聲、瘤內(nèi)血管生成以及血流阻抗等指標(biāo)。結(jié)果 瘤塊包埋法可建立穩(wěn)定的兔腎VX2移植瘤模型。B超可以實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、方便的監(jiān)測(cè)腫瘤體積及血流動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)論 兔腎VX2移植瘤是一種造模方法簡(jiǎn)便且成瘤率高的腎癌動(dòng)物模型，

2、采用超聲技術(shù)能精確、無(wú)創(chuàng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤體積變化及血流特征。關(guān)鍵詞：兔；VX2腎癌；超聲技術(shù)Establishing rabbit VX2 carcinoma model and monitoring itwith color Doppler energy ultra sound techniqueABSTRACT: Objective To compare the advantages and disadvantages of several methods to establish the rabbit VX2 carcinoma model. Methods Ultrasound tech

3、nique was used to confirm the best periods of experiment on the rabbit VX2 carcinoma mode. The rabbit VX2 carcinoma model was established by different ways, such as tumor cells fluids and tumor block transplanting guided by Bultrasound, tumor block transplanting by operation to compare their success

4、ful rate. Kidney size and other indexs were observed. Results Tumor block transplanting by operation was the most successful to establish a steady model. Conclusion The rabbit VX2 carcinoma is one of the biggest animal models for kidney carcinomas experimental research; it is steady and easy to be m

5、anipulated.KEY WORDS: rabbit; VX2 kindey carcinoma; B ultrasound小鼠移植瘤模型常被用于腎癌的實(shí)驗(yàn)研究，但動(dòng)物體型小、抗干預(yù)能力差，腫瘤原發(fā)部位不在腎臟并且成瘤率低，因而其應(yīng)用受到限制。VX2腫瘤是由Shope病毒誘發(fā)的兔可移植性腫瘤，可接種到不同器官而成兔移植瘤模型。我們旨在尋找建立兔腎VX2移植瘤模型的最佳方法，用B超追蹤腫瘤生長(zhǎng)特征，確定最佳實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)段，為評(píng)價(jià)腎癌的基礎(chǔ)研究及治療療效提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新西蘭大白兔45只，體質(zhì)量2.0-2.5kg，雌雄不限，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。VX2瘤

6、株由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。B超檢查用美國(guó)Acuson 512 型彩色多普勒超聲診斷儀。日本Hitachi H600型電子透射顯微鏡。1.2 VX2瘤細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 按照一般細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)冰凍VX2瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行復(fù)蘇后離心5min(800r/min)，除去上清液，加入PBS液用玻璃棒攪勻。取懸液置于RPMI1640培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色并做死、活細(xì)胞計(jì)數(shù)，將培養(yǎng)液調(diào)制成107/mL活細(xì)胞濃度。1.3 動(dòng)物模型建立 將45只兔隨機(jī)分為A、B、C 三組，每組各15只。A組采用瘤細(xì)胞懸液接種法。兔清醒狀態(tài)下B超引導(dǎo)穿刺右腎下級(jí)并注入瘤細(xì)胞液1mL。B組采用瘤塊液穿刺種植法。先將上述瘤細(xì)胞液2mL分別注入兔

7、雙側(cè)后腿皮下即成為荷瘤種兔，兩周后腫瘤形成直徑約2cm大小時(shí)完整切取，去除包膜及壞死組織，剪取腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛部分置于Hanks液中。盡量剪碎約1mm，制成瘤細(xì)胞懸液。兔麻醉狀態(tài)下B超引導(dǎo)16G穿刺針進(jìn)入右腎下級(jí)，注入瘤細(xì)胞懸液0.3mL。C組采用瘤塊包埋法。兔麻醉后俯臥位固定，取右12肋緣下切口3-4cm，暴露右腎下級(jí)后用眼科鑷穿刺1.5cm深隧洞。在冰塊上將前述荷瘤組織剪為直徑0.2-0.3cm的小塊后植入。明膠海綿壓迫止血，生物膠填塞。各組操作均于1.5h內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌注青霉素40萬(wàn)單位，連續(xù)3d。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)無(wú)1例兔感染或死亡。1.4 腫瘤的超聲檢查 用Acuson Sequoia51

8、2 型超聲儀，15L8W寬頻線陣探頭(頻率為8.0-13.0MHz),分別于腫瘤種植后7、9、11、13、15、17、19、21、23、25d對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行多切面掃查，由兩名高年資超聲醫(yī)師同時(shí)操作。觀察腎臟及腎內(nèi)腫瘤的大小、形態(tài)、回聲特點(diǎn),用所測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算腫瘤體積(V=0.5a×b2，a和b分別是腫瘤最大直徑和與其垂直的最小橫徑)和腫瘤生長(zhǎng)率(tumor growth rate, TGF. TGF=a2b2-a1b1/a1b1×100%)。觀察病灶內(nèi)部和周邊血管分布特征，用脈沖頻譜多普勒檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)1。觀察腎門(mén)及腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)變化，是否出現(xiàn)癌栓及液化壞死等。1.5 病理

9、檢查 分別于植瘤后第7、9、11、13、15、17、19、21、23、25d行B超檢查，1h后每組各處死1只兔。取腎癌組織戊二醛固定后行透射電鏡觀察，同時(shí)切取原發(fā)瘤灶及可疑淋巴結(jié)、肝臟、肺臟轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。剩余兔均于第30 天處死。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各變量保留兩位有效數(shù)字，以±s表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)和2檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 成瘤率 A、B、C三組實(shí)驗(yàn)兔成瘤率分別為40%、60%、100%。采用2檢驗(yàn)，C組與A、B組比較有顯著性差異(P<0.05)，A、B組之間差異不顯著(P>0.05)，即瘤塊包埋法較前兩種方法有效。大體標(biāo)本見(jiàn)兔VX2腎癌

10、為突出于腎臟表面的結(jié)節(jié)樣包塊，與周?chē)纸缜宄型暾ば纬?，質(zhì)地較硬，切面呈魚(yú)肉樣(圖1)，晚期腎癌標(biāo)本可見(jiàn)瘤體中央因缺血壞死而成豆渣樣，病理顯示鱗癌(圖2)。圖1 兔腎VX2癌大體標(biāo)本 （略） Fig.1 General specimen of rabbit renal VX2 carcinoma model圖2 兔腎VX2癌腫瘤細(xì)胞（略）Fig.2 Cells of rabbit renal VX2 carcinoma model (HE×400)2.2 腫瘤生長(zhǎng)特征變化 三組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間腫瘤體積及其環(huán)比增長(zhǎng)速度見(jiàn)表1。瘤塊包埋組(C組)全部成瘤并且生長(zhǎng)穩(wěn)定，腫瘤形態(tài)規(guī)則，在

11、植瘤后11-21d，各監(jiān)測(cè)時(shí)間體積增長(zhǎng)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。病檢發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤體積增至15-20cm3時(shí)，腫瘤中央出現(xiàn)液化壞死，周?chē)植拷?rùn)及肝、肺、腎門(mén)淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移。所以實(shí)驗(yàn)干預(yù)適宜于植瘤后2-3周內(nèi)進(jìn)行。2.3 超聲檢測(cè)腫瘤的體積變化 各組實(shí)驗(yàn)兔均于B超檢查后即刻處死1只，并實(shí)際測(cè)量腫瘤大小后計(jì)算體積。B超測(cè)量體積與腫瘤實(shí)測(cè)體積(表2)經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表明B超可以方便、快速、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確的應(yīng)用于腫瘤動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，篩檢合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2.4 瘤體內(nèi)部及癌周CDFI血流信號(hào)的檢測(cè) 不同體積兔腎VX2癌瘤體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)變化見(jiàn)表3。 根據(jù)CDFI

12、將瘤體及其周邊血流分為星點(diǎn)狀、短條狀、樹(shù)枝狀、環(huán)狀四種2。兔腎VX2癌為富血供腫瘤，癌灶周邊呈高速低阻型，并有豐富環(huán)狀血流信號(hào)包繞(82%)(圖3)，可見(jiàn)血管分支深入瘤體內(nèi)部。瘤體內(nèi)部血流呈低速高阻型，血管分布以星點(diǎn)狀、短線狀居多(76%)(圖4)。隨腫瘤體積增大，瘤體內(nèi)血管的搏動(dòng)指數(shù)(PI)、阻力指數(shù)(RI)、S/D以及最大血流速度均呈增高趨勢(shì)，最小血流速度呈下降趨勢(shì)，但各組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表1 三組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間腫瘤體積及其增長(zhǎng)率（略）Table 1 The tumors size and its increasing rate of rabbit rena

13、l VX2 carcinoma model表2 C組實(shí)驗(yàn)兔植瘤后不同時(shí)間B超監(jiān)測(cè)與解剖實(shí)測(cè)腫瘤體積(cm3)的比較（略）Table 2 Compared the tumor size(cm3) of rabbit renal VX2 carcinoma model by ultrasound and anatomy表3 不同體積兔腎VX2癌瘤體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)的變化（略）Table 3 The diversification of blood stream of rabbit renal VX2 carcinoma model with different size圖3 兔腎VX2癌瘤體周邊血管分

14、布呈環(huán)繞狀 （略） Fig.3 The vascularity around tumor of rabbit renal VX2 carcinoma圖4 兔腎VX2癌瘤體中央血管分布呈短線狀（略）Fig.4 The center vascularity in tumor of rabbit renal VX2 carcinoma 3 討論腎癌發(fā)病率居泌尿系腫瘤的第二位，且有逐年增高的趨勢(shì)。在對(duì)腎癌的實(shí)驗(yàn)研究中，腫瘤模型通常選用裸鼠移植瘤，但其發(fā)生部位和生物學(xué)行為與人類(lèi)腎癌不盡一致，因此迫切需要建立一種原位大型腎癌動(dòng)物模型。VX2腫瘤細(xì)胞株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生鱗癌，經(jīng)過(guò)72次

15、傳代后正式建株，并可接種到兔肝臟、腎臟、肌肉、肺臟等部位，制成原位腫瘤動(dòng)物模型。該腫瘤生長(zhǎng)速度快，短期內(nèi)即可發(fā)生廣泛壞死，并形成肝、肺轉(zhuǎn)移，故準(zhǔn)確把握腫瘤成瘤性及其生長(zhǎng)參數(shù)以選擇最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)機(jī)，在腎癌的發(fā)生與治療學(xué)中尤為重要。 本實(shí)驗(yàn)采用三種不同方法建立兔VX2腎癌模型后比較其成瘤率，發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞懸液注入組(A組)成瘤性最低，原因可能是懸液濃度偏低3(107mol/L)，動(dòng)物機(jī)體免疫力高低不同導(dǎo)致，而且本組操作程序復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。瘤塊液植入組(B組)成瘤性稍高，盡管經(jīng)B超引導(dǎo)穿刺種植微創(chuàng)4，但模型成瘤后其瘤體形態(tài)極不規(guī)則，沿穿刺針道、腹腔、腹膜后廣泛種植。瘤塊包埋組(C組)采取切開(kāi)植瘤，本組全部

16、成瘤，經(jīng)B超檢測(cè)并手術(shù)切開(kāi)驗(yàn)證腫瘤形態(tài)均勻規(guī)則。VX2瘤株種植成活后依次經(jīng)過(guò)腫瘤血管形成期、腫瘤血管穩(wěn)定期、腫瘤血管退化期5。本研究瘤塊包埋組成瘤初期腫瘤均呈指數(shù)生長(zhǎng)，2-3周體積增長(zhǎng)穩(wěn)定，是施加實(shí)驗(yàn)措施的最佳時(shí)期，3-4周腫瘤體積過(guò)大，中央血供不足易發(fā)生液化壞死及遠(yuǎn)處肝、肺、腎門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，4-5周血管退化導(dǎo)致腫瘤大片壞死，實(shí)驗(yàn)療效的準(zhǔn)確性較低。本組模型全部成瘤是因?yàn)榱鼋M織塊提高了腫瘤細(xì)胞的種植濃度，增強(qiáng)了植瘤局部對(duì)機(jī)體免疫抵抗的屏障作用。植瘤手術(shù)應(yīng)保持無(wú)菌、輕柔、熟練操作，瘤塊修剪在冰塊上進(jìn)行，植入后明膠海綿壓迫止血，生物蛋白膠堵塞針道以防止瘤塊逆出或術(shù)野種植，手術(shù)集中在1.5h內(nèi)完成，術(shù)

17、后抗感染治療。B超監(jiān)測(cè)兔VX2腎癌準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、敏感度高，高分辨率B超可以發(fā)現(xiàn)直徑3mm的小腫瘤6，并全面顯示瘤體周邊和中央的血流信號(hào)。對(duì)B超檢出腫瘤均經(jīng)病理證實(shí)，二維形態(tài)無(wú)差異性。本實(shí)驗(yàn)利用CDFI技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察不同生長(zhǎng)階段兔腎VX2癌血管，可見(jiàn)早期血管環(huán)繞腫瘤周邊呈抱球狀，隨后形成細(xì)小滋養(yǎng)血管深入到瘤體內(nèi)部并逐漸豐富，最終因腫瘤血管退化而出現(xiàn)大片液化壞死區(qū)。同時(shí)確定了各階段血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)值范圍，為評(píng)價(jià)抗腫瘤血管藥物療效提供了無(wú)創(chuàng)性的早期參考指標(biāo)。盡管兔腎VX2移植癌病理分型是鱗癌，與人類(lèi)腎癌表現(xiàn)不完全一致，但因?yàn)樵炷７椒ê?jiǎn)便易行，成瘤率高,腫瘤發(fā)生部位在腎臟,易于進(jìn)行腎癌的實(shí)驗(yàn)研究, 仍不失為理想的大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。參考文獻(xiàn)：1閻東明,楊波,宋來(lái)君,等. 右美沙芬對(duì)兔急性腦外傷后血流速度的影響 J. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版, 2003, 38(6):939941.2王文,段云友,呂發(fā)勤,等. 實(shí)驗(yàn)性兔腎VX2腫瘤的血流動(dòng)力學(xué)變化研究 J. 中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2002,18(7):619621.3Okada M, Kudo S, Saino T, et al. Antitumoral efficacy and pharmacokinetic properties of pirarubicin upon hepaticintraarter injec