發(fā)光免疫分析技術(shù)課件

1、發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 慨慨 述述 - 化學(xué)發(fā)光 - 化學(xué)發(fā)光效率 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù) - 化學(xué)發(fā)光劑 - 發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 - 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析 - 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 - 電化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件什么是發(fā)光免疫分析？什么是發(fā)光免疫分析？是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新

2、型標(biāo)記免疫分析種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。技術(shù)。 發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù) 三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài) （較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再 返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。 根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為: 光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。 發(fā)光的基礎(chǔ)知識發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 光照發(fā)光（photoluminescence）指發(fā)光劑（熒光素） 經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能

3、量躍遷到激發(fā) 態(tài)，其回至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長的光。 生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的 發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光 素，在熒光素酶的催化下，利用atp能，生成激發(fā)態(tài)氧 化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以光子的形 式釋放出來。 化學(xué)發(fā)光 發(fā)光的基本類型發(fā)光的基本類型發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射

4、光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光又分為：直接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光 什么是化學(xué)發(fā)光什么是化學(xué)發(fā)光發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程簡單地描述如下： a十b c* c* c h為光子，c*表示c處于激發(fā)態(tài) 直接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學(xué)反應(yīng)的分子d上，使d分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，d分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程表示如下： a十b c* c*十d

5、 c十d* d* d十h 間接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。 一、化學(xué)發(fā)光劑一、化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 發(fā)光的量子產(chǎn)率高； 它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的 物質(zhì)相匹配； 能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； 其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果； 在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性 化學(xué)發(fā)光

6、劑的基本條件化學(xué)發(fā)光劑的基本條件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。 （一）直接化學(xué)發(fā)光劑（一）直接化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件一一. . 代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被h h2 2o o2 2氧化時氧化時, ,發(fā)出發(fā)出波長波長470nm470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)

7、態(tài)產(chǎn)物的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物n-n-甲甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。 發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件二二. . 另一類代表物質(zhì)：另一類代表物質(zhì)：三聯(lián)吡啶釕，三聯(lián)吡啶釕，ru(bpy)3ru(bpy)32+2+是電化學(xué)發(fā)光劑，是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（它和電子供體三丙胺（tpatpa）在陽電極表面可同時失去）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。 三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理 發(fā)

8、光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。代表物質(zhì)：代表物質(zhì)：魯米諾及其衍生物，魯米諾及其衍生物，amppdamppd （二）酶促化學(xué)發(fā)光劑（二）酶促化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理 發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 amppd3-(2-螺旋金剛烷螺旋金剛烷)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二氧雜環(huán)丁烷發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)

9、課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（h2o2）和naoh使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光發(fā)光y yy磁微粒子磁微

10、粒子被測抗原被測抗原+ 抗體抗體+丫啶酯標(biāo)丫啶酯標(biāo)記物抗體記物抗體yyyyyyyyyyy沖洗后沖洗后（1 1）加入加入h h2 2o o2 2（ph10） 直接化學(xué)發(fā)光分析直接化學(xué)發(fā)光分析-夾心法夾心法發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immu

11、noassay，eclia）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(tpa)為電子供體， 在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。 二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引人tpa緩沖液。 當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與

12、此同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和tpa在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光強(qiáng)度與待測抗原濃度成正比。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件以tsh為例：第一步：結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即ru(bpy)32+ + n羥基琥珀酰胺酯（nhs）的tsh抗體和結(jié)合了生物素的tsh抗體與待測血清同時加入一個反應(yīng)杯中，孵育9分鐘。第二步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育9分鐘，使生物素通過與親和素的結(jié)合將磁珠、tsh抗體連接為一體，形成雙

13、抗體夾心法。下一步，蠕動泵將形成的ru(bpy)32+抗體抗原抗體磁珠復(fù)合體吸入流動測量室，此時，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的tsh抗體（與生物素結(jié)合的和與ru(bpy)32+結(jié)合的抗體）也被吸出測量室。緊接著，蠕動泵加入含三丙胺（tpa）的緩沖液，同時電極加電壓，啟動ecl反應(yīng)過程。發(fā)光劑ru(bpy)32+和電子供體tpa在陽極表面可同時各失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)，使二價的ru(bpy)32+被氧化成三價，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面，tpa 被氧化成陽離子自由基tpa+q，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個質(zhì)子（h+），形成自由基tpaq，這是一種很強(qiáng)的還原劑，可將一

14、個電子給三價的ru(bpy)33+，使其形成激發(fā)態(tài)的ru(bpy)32+，而tpa自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的ru(bpy)32+通過熒光機(jī)制衰減，發(fā)射出一個波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的ru(bpy)32+。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與ru(bpy)32+的濃度呈線性關(guān)系，故可測出待測抗原的含量。最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動測量室，準(zhǔn)備下一個樣品測定。發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 化學(xué)發(fā)

15、光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，cleia）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（hrp）或堿性磷酸酶(alp)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，處理信號?jì)算出測定物的濃度。三、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析三、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（hrp）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測

16、標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（hrp）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入魯米這時加入魯米諾發(fā)光劑、諾發(fā)光劑、h h2 2o o2 2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 （一）（一）hrp標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 hrp標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入這時加入amppdamppd發(fā)光劑，堿性磷酸酶發(fā)光劑，堿性磷酸酶使使amppdamppd脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 （二）（二）akp標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 akp標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析技術(shù)課件發(fā)光免疫分析技術(shù)課件 加樣品、磁顆加樣品、磁顆粒子、試劑粒子、試劑孵育，使反孵育，使反應(yīng)物結(jié)合應(yīng)物結(jié)合清洗去除