結(jié)核分枝桿菌海藻糖磷酸磷酸酶誘導(dǎo)小鼠體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答

1、結(jié)核分枝桿菌海藻糖磷酸磷酸酶誘導(dǎo)小鼠體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答張旻 徐穎 郄亞卿 王九玲 祝秉東 王慶忠 王洪海結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis）是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最為重要的傳染性病原體之一，每年可以引起8百萬人感染結(jié)核病，導(dǎo)致2.53百萬人死亡。目前最常用的結(jié)核疫苗是一株減毒的牛型結(jié)核桿菌，稱為卡介苗（BCG）。BCG的對(duì)于不同人群的保護(hù)效率差異非常大，從0到85%。因此控制這種全球性疾病急需發(fā)展新的抗結(jié)核疫苗。I型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是機(jī)體防御分枝桿菌病原體的必要手段。具有顯著T細(xì)胞免疫和B細(xì)胞免疫的結(jié)核新抗原的發(fā)現(xiàn)有助于發(fā)展新的結(jié)核疫苗。結(jié)核分枝桿菌基因組中有兩個(gè)可能編碼海藻糖磷酸磷

2、酸酶的開放閱讀框：otsB1(Rv2006)和otsB2(Rv3772)。Edavana等證明OtsB2蛋白具有海藻糖磷酸磷酸酶的功能，而OtsB1蛋白沒有磷酸酶的活性。結(jié)核分枝桿菌 otsB1基因的缺失突變型相對(duì)于野生型生長(zhǎng)沒有明顯差異，而otsB2基因?qū)τ诮Y(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)是必需的。為進(jìn)一步闡述海藻糖磷酸磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP，由otsB2基因編碼）的生物學(xué)功能，我們對(duì)TPP做了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)TPP存在于結(jié)核分枝桿菌和BCG的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上。分別用TPP蛋白和BCG免疫小鼠，檢測(cè)了TPP誘導(dǎo)的小鼠體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。材料和方

3、法1. 實(shí)驗(yàn)菌種和培養(yǎng)條件 大腸桿菌DH5和BL21(DE3)分別用于克隆和表達(dá)TPP。大腸桿菌在含有25 g/ml 的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)核分枝桿菌和BCG用改良蘇通培養(yǎng)基或含有10(v/v)oleic acid-albumin-dextrose complex的Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)。2TPP的表達(dá)純化以及兔抗TPP血清的制備 從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中克隆TPP編碼基因otsB2，然后在E.coli. BL21(DE3)中表達(dá)，通過Ni-NTA親合層析純化TPP蛋白。0.2 mg純化的TPP蛋白與弗氏不完全佐劑混合皮下多點(diǎn)免疫3個(gè)月的新西蘭白兔，然后加強(qiáng)

4、免疫4次，制備抗血清。3分枝桿菌的亞細(xì)胞分離 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的結(jié)核分枝桿菌H37Rv和BCG。培養(yǎng)上清通過0.22 um的慮膜過濾，冷凍干燥濃縮后，在PBS中透析，獲得培養(yǎng)上清濾過性蛋白。分枝桿菌菌體用PBS清洗2次后，懸浮于含有蛋白酶抑制劑的PBS中，超聲破碎。裂解液11000 g離心5 min，去除沒有破碎的菌體。裂解液上清27000 g離心1h，得到的沉淀為細(xì)胞壁組份。上清100000 g繼續(xù)離心4 h分離細(xì)胞膜（沉淀）和細(xì)胞質(zhì)（上清）。用PBS分別清洗細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組份3次。細(xì)胞質(zhì)組份繼續(xù)在100000 g離心4 h，以保證所有的細(xì)胞膜組份分離出細(xì)胞質(zhì)組份。所分離的各細(xì)胞組份用每種組

5、份的抗體識(shí)別分子標(biāo)簽鑒定，例如細(xì)胞質(zhì)65 kDa蛋白、細(xì)胞膜38 kDa蛋白、細(xì)胞壁分泌性蛋白Ag85的特異性抗體。4. Western雜交 所有的細(xì)胞組份懸浮于PBS中，SDS-PAGE (10%，w/v丙稀酰胺)每個(gè)泳道上樣量為相當(dāng)于500 l培養(yǎng)液分離所得到的蛋白。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用制備的兔抗TPP血清做一抗，羊抗兔IgG抗體做二抗檢測(cè)。5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物免疫 C57BL/6小鼠（25 g，雌性），購于上海第二軍醫(yī)大學(xué)；隨機(jī)分為4組。收集的BCG菌體懸浮于PBS中，終濃度約為200 mg/ml。BCG免疫組（4只）的每只小鼠皮下注射100 l（涂板計(jì)數(shù)為5 × 1

6、06 CFU）的BCG懸浮液，PBS對(duì)照組的每只小鼠皮下注射100 l的PBS。TPP蛋白免疫組（4只）的小鼠每周皮下注射與弗氏不完全佐劑（IFA）混勻的50 g的TPP蛋白，總共免疫3次。IFA對(duì)照組小鼠用IFA免疫。6ELISA測(cè)定IgG1和IgG2a 收集BCG和PBS免疫組小鼠免疫3周后的血清，以及蛋白TPP和IFA免疫組小鼠最后一次免疫1周后的血清。ELISA檢測(cè)血清中TPP特異性IgG1和IgG2a抗體滴度。并與分枝桿菌抗原85B（Ag85B）做比較。酶標(biāo)板（Nunc）用5 g/ml的純化蛋白（TPP或Ag85B）100 l/孔包被，4 °C過夜；用含有1% BSA的PB

7、ST封閉2 h；待測(cè)血清用含有1% BSA的PBST稀釋1250倍，然后再等倍稀釋。加入待測(cè)血清100 l，37 °C孵育1 h；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG1或IgG2a作為二抗，每孔100 l，37 °C孵育1 h；每孔加100 l OPD顯色液，37 °C閉光反應(yīng)20 min，每孔加 50 l 7% H2SO4終止反應(yīng)，于492nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。7ELISPOT檢測(cè)IFN- 無菌取出小鼠脾臟，研碎后經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞；用淋巴細(xì)胞分離液（Cedar lan Lab）分離小鼠淋巴細(xì)胞。然后用IFN- ELISPOT檢測(cè)試劑盒（U-Cytech BV, Ul

8、trecht, The Netherlands）檢測(cè)分泌IFN-的淋巴細(xì)胞。每孔加入100 l 5 × 105淋巴細(xì)胞。分別用1 g/ml、2 g/ml 、5 g/ml的蛋白TPP和2 g/ml蛋白Ag85B刺激48 h。按照IFN- ELISPOT檢測(cè)試劑盒使用說明操作，最后在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。結(jié)果1TPP在結(jié)核分枝桿菌和BCG中的亞細(xì)胞定位 BLAST分析目前已有的分枝桿菌基因組序列，發(fā)現(xiàn)TPP廣泛地存在于分枝桿菌中。結(jié)核分枝桿菌H37Rv的TPP蛋白序列與牛分枝桿菌AF2122/97的TPP100%同源，與結(jié)核分枝桿菌CDC1551的TPP蛋白100%同源，與M. avi

9、um subsp. paratuberculosis K-10的TPP蛋白71%同源，與M. leprae TN的TPP蛋白67%同源，與M. smegmatis的TPP25%同源。將分離獲得的結(jié)核分枝桿菌H37Rv和BCG的培養(yǎng)上清濾過性蛋白、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，和細(xì)胞質(zhì)組份通過Western雜交檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)42 kDa的TPP亞細(xì)胞定位于結(jié)核分枝桿菌和BCG的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上（圖 1）。2TPP在不同株的結(jié)核分枝桿菌中的表達(dá)情況 結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中存在另一個(gè)與TPP（由otsB2編碼）同源的海藻糖磷酸磷酸酶，由otsB1編碼（Sanger website; ）。Edavan等實(shí)驗(yàn)證明

10、OtsB1蛋白沒有磷酸酶的活性。由42 kDa TPP制備的抗體不與146 kDa OtsB1蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。結(jié)核分枝桿菌中某些具有兩個(gè)或三個(gè)同源蛋白的酶可能是假基因或者開放閱讀框發(fā)生移碼突變。我們檢測(cè)了TPP在不同的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中的表達(dá)情況（圖 2）。所選用的臨床分離株是本實(shí)驗(yàn)室曾通過DNA指紋證明為流行病學(xué)上不相關(guān)的菌株。Western雜交表明TPP完整地存在于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中。3TPP誘導(dǎo)特異性體液免疫 C57BL/6小鼠分別用BCG和TPP免疫，對(duì)照組分別用PBS和IFA免疫。分別檢測(cè)IgG1和IgG2a抗體的效價(jià)（圖 3）。TPP蛋白免疫組的小鼠具有較高的抗體滴度

11、，并且TPP特異的IgG2a抗體滴度高于IgG1。然而在BCG免疫組中IgG1和IgG2a抗體滴度都很低。我們用能有效誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫的分枝桿菌保守抗原Ag85B作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Ag85B特異的IgG1和IgG2a抗體比TPP高。用PBS或IFA免疫的陰性對(duì)照小鼠血清中幾乎檢測(cè)不到IgG1或IgG2a的抗體。4TPP誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫 IgG2a抗體與I型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)，I型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生IFN-。TPP蛋白或BCG免疫小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)TPP體外刺激后都能產(chǎn)生較高的IFN-（p<0.05）（圖 4）。對(duì)于TPP蛋白免疫組，分別用1 g/ml、2 g

12、/ml和5 g/ml TPP體外刺激小鼠脾細(xì)胞，IFN-水平增加了3到7倍；而BCG免疫組小鼠的脾細(xì)胞IFN-水平增加了20到24倍。用2 g/ml的TPP或Ag85B分別刺激BCG免疫的小鼠脾細(xì)胞，前者所檢測(cè)到的分泌IFN-脾細(xì)胞的數(shù)目是后者的60。定位于BCG細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的TPP能誘導(dǎo)IFN-的分泌，是典型的I型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。討論本文首次研究了分枝桿菌海藻糖磷酸磷酸酶的免疫原性。在結(jié)核分枝桿菌和BCG中編碼該蛋白的基因序列完全相同。我們克隆并表達(dá)了該蛋白，純化的TPP的酶活性跟報(bào)道的一致4。TPP亞細(xì)胞定位于結(jié)核分枝桿菌和BCG的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上。TPP蛋白的抗體能抑制結(jié)

13、核分枝桿菌的增值（圖 5），該現(xiàn)象佐證了otsB2基因缺失突變的是致死的。我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)TPP在異煙肼耐藥的結(jié)核分枝桿菌中上調(diào)表達(dá)。TPP可能是結(jié)核化療治療的潛在藥靶，也可能為異煙肼耐藥結(jié)核病的診斷提供了新的分子標(biāo)志物。通過檢測(cè)IgG1/IgG2a抗體滴度以及脾細(xì)胞分泌IFN-的水平，我們分析了TPP是誘導(dǎo)I型還是II型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和高滴度的IgG2a抗體水平是I型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特征；而高滴度的IgG1和IgGE抗體水平是II型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特征。本研究表明TPP誘導(dǎo)小鼠I型輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為IgG2a的抗體滴度高于

14、IgG1(在抗血清稀釋1,250倍時(shí)，抗體滴度IgG2a /IgG1為1.46:1)以及抗原刺激脾細(xì)胞分泌IFN-。不同的佐劑可能對(duì)TPP特異性體液免疫的誘導(dǎo)有不同的影響，例如單磷酸基脂質(zhì)A、氯化二甲基二八癸胺、幾丁質(zhì)顆粒等。不同免疫佐劑對(duì)TPP誘導(dǎo)體液免疫的影響有待于進(jìn)一步研究。對(duì)于BCG免疫的小鼠，Ag85B特異性IgG1和IgG2a抗體滴度以及抗原刺激脾細(xì)胞所分泌的IFN-的水平都要高于TPP。Ag85B是一種分枝桿菌分泌性蛋白，能誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫。TPP亞細(xì)胞定位于BCG的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上，生物信息學(xué)分析表明在TPP的N端沒有分泌的信號(hào)肽。因此BCG免疫的小鼠不能有效誘導(dǎo)體液免

15、疫，卻能誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)優(yōu)于TPP蛋白，這可能與BCG在小鼠體內(nèi)能不斷增值并表達(dá)TPP蛋白以及體外免疫TPP蛋白的不穩(wěn)定性有關(guān)。對(duì)TPP有效抗原表位的分析鑒定以及構(gòu)建胞外分泌性表達(dá)TPP的重組BCG有助于開發(fā)新的抗結(jié)核疫苗。細(xì)胞免疫反應(yīng)是控制結(jié)核的關(guān)鍵。然而細(xì)胞免疫是一把雙刃劍：一方面，適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)能清除并控制病原；另一方面，所產(chǎn)生免疫反應(yīng)能增強(qiáng)病原的存活。因此我們今后會(huì)進(jìn)行TPP對(duì)動(dòng)物的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，來檢測(cè)42 kDa的TPP能否使機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染產(chǎn)生抵御作用。圖1 TPP在M. tuberculosis H37Rv和BCG中的亞細(xì)胞定位Figure 1.

16、 Subcellular localization of TPP in M. tuberculosis H37Rv and BCGSonicated preparations of mycobacteria were fractionated into cell wall, cell membrane and cytosol fractions, as described in Methods. The fractions were Western blotted to rabbit serum raised against recombinant TPP protein. Line 1-4,

17、 culture filtrate (CF), cell wall (CW), cell membrane (CM), and cytosol (CY) fractions from M. tuberculosis H37Rv; Line 5-8, CF, CW, CM, CY fractions from BCG.圖2 TPP在M. tuberculosis不同臨床分離株中的表達(dá)情況Figure 2. Distribution of TPP among M. tuberculosis strainsRabbit serum raised to recombinant TPP protein

18、was immunoblotted to sonicated antigen preparations obtained from BCG (1), avirulent strain of M. tuberculosis H37Ra (2), M. tuberculosis H37Rv (3), and four clinical M. tuberculosis isolates (4-7).圖3 TPP特異性IgG1和IgG2a抗體滴度的測(cè)定Figure 3. Analysis of IgG1 and IgG2a antibody responses against purified TPP

19、Mice were immunized with TPP emulsified with IFA () or IFA(), Sera were assayed by ELISA using secondary antibodies specific for mouse IgG1 (A) and IgG2a (B)；Mice were immunized with BCG () or PBS (). Levels of IgG1 (C) and IgG2a (D) antibodies against purified TPP (solid lines) or Ag85B (dashed lines) were determined in sera of mice 3 weeks post-immunization.圖4 ELISPOT檢測(cè)TPP蛋白或BCG免疫C57BL/6小鼠分泌IFN-的脾細(xì)胞計(jì)數(shù)Figure 4. The cellular immune response was measured in an ELISPOT assay with splenocytes isolated from C57BL/6 mice immunized with protein TPP or BCGSp