高效液相色譜

1、高效液相色譜高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。歷史1906年俄國(guó)植物化學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”（Chromotography）和“色譜

2、圖”（Chromatogram）的概念。他在論文中寫(xiě)到：“（原文）一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖。”1930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。1952年，英國(guó)學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們?cè)诜峙渖V方面的研究工作，提出了關(guān)于氣液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析

3、儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試，但分離效率尚不理想。1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，液相色譜又開(kāi)始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。1970年中期以后，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國(guó)際和國(guó)內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。特點(diǎn)高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)： 高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須

4、對(duì)載液加高壓。高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng,進(jìn)樣量在L數(shù)量級(jí)。應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢

5、測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。編輯本段主要類型1吸附色譜(Absorption Chromatography)2分配色譜(Partition Chromatography)3離子色譜(Ion Chromatography)4體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography)5親和色譜(Affinity Chromatography)編輯本段結(jié)構(gòu)綜述高效液相色譜儀可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進(jìn)

6、樣器”、“檢測(cè)器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。高壓輸液泵功能驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過(guò)色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng)；性能要求流量穩(wěn)定（±1)，耐高壓(3060Mpa)，耐各種流動(dòng)相：例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液；種類往復(fù)泵和隔膜泵。色譜柱功能分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)；尺寸1030cm長(zhǎng),25mm內(nèi)徑的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱；填料粒度5 10m ，高效微粒固定相；進(jìn)樣器功能將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；種類注射器,10Mpa以下,110m微量注射器進(jìn)樣停流進(jìn)樣閥進(jìn)樣，常用、較 理想、體積可變，可固定自動(dòng)進(jìn)樣器，有利于重復(fù)操作，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)器功能將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或

7、電學(xué)信號(hào)；分類示差折光化學(xué)檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器紫外一可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器二極管陣列紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器餾分收集器功能如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的；方法手工，少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。餾分收集器收集，比較理想，微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)功能把檢測(cè)器檢測(cè)到的信號(hào)顯示出來(lái)。編輯本段分離原理液液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)流動(dòng)相和固定

8、相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于高效液相色譜計(jì)算公式：  高效液相色譜計(jì)算公式式中,cs溶質(zhì)在固定相中濃度；cm-溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度； Vs固定相的體積；Vm流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K,K大的組分保留值大；但也有不同之處,GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大,LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大。a.正相液 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。b.反相液 液分

9、配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。c.液 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見(jiàn)后），可克服上述缺點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛(7080%）。液固色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附（未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S)

10、，可表示如下：Xm nSa = Xa nSm式中：Xm-流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa-固定相中的溶劑分子；Xa-固定相中的溶質(zhì)分子；Sm-流動(dòng)相中的溶劑分子。當(dāng)吸附競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)：K=XaSm/XmSa式中：K為吸附平衡常數(shù)。討論：K越大，保留值越大。離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過(guò)程可表示如下：X-（溶劑中） (樹(shù)脂-R4N Cl-)= （樹(shù)脂-R4N X-) C

11、l- （溶劑中）當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：KX=-R4N X- Cl-/-R4N Cl- X-分配系數(shù)為：DX=-R4N X-/X-= KX -R4N Cl-/Cl-討論：DX與保留值的關(guān)系凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。離子對(duì)色譜法(Ion Pair Chromatography)離子對(duì)色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對(duì)離子或反離子 ) 加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原理可用下式表示：X水相Y-水相 = X Y-有機(jī)相式中：X 水相-流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽(yáng)離子）

12、；Y-水相-流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(duì)（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y-形成的離子對(duì)化合物。當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：KXY = X Y-有機(jī)相/ X 水相Y-水相根據(jù)定義，分配系數(shù)為：DX= X Y-有機(jī)相/ X 水相= KXY Y-水相討論：DX與保留值的關(guān)系離子對(duì)色譜法（特別是反相）解決了以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。離子色譜法(Ion Chromatography)用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制

13、柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。以陰離子交換樹(shù)脂(R-OH)作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當(dāng)待測(cè)陰離子Br-隨流動(dòng)相(NaOH)進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過(guò)程）：抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：R-H Na OH- = R-Na H2OR-H Na Br- = R-Na H Br-可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè)。離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽(yáng)離子分析?？臻g排阻色譜法(Steric Exclusion Chromat

14、ography)空間排阻色譜法以凝膠(gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。  流程流程：如右圖所示，溶劑貯器中的流動(dòng)相被泵吸入，經(jīng)3梯度控制器按一定的梯

15、度進(jìn)行混合然后輸出，經(jīng)測(cè)其壓力和流量，導(dǎo)入(5進(jìn)樣閥（器）經(jīng)保護(hù)柱、分離柱后到檢測(cè)器檢測(cè)，由數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理數(shù)據(jù)或記錄儀記錄色譜圖，餾分收集器收集餾分，為廢液。編輯本段使用綜述色譜柱的填料和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。在用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求。正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分

16、、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.色譜柱的理論板數(shù)在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=5.54t(R)W(h/2)2計(jì)算色

17、譜柱的理論板數(shù)，如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。分離度定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計(jì)算公式為：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)， 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。拖尾因子為保證測(cè)量精度，特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖

18、尾因子計(jì)算公式為：W(0.05h) T=-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外,T應(yīng)在0.951.05間。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。測(cè)定定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雜質(zhì)總量時(shí)，須采用峰面積法。面積歸一化法測(cè)定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求

19、出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜圖的記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。主成分自身對(duì)照法當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對(duì)照法。在測(cè)定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對(duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對(duì)照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測(cè)量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測(cè)得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。內(nèi)標(biāo)法測(cè)定供試品中雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積法

20、。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖I；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30%以上，否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測(cè)器靈敏度。如果色譜圖中沒(méi)有與色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計(jì)在內(nèi)）。如果色譜圖中有與色譜圖上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖中此雜峰面積，即為

21、各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：As/ms校正因子f=- Ar/mr 式中 As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,Ar為對(duì)照品的峰面積或峰高； ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量mr為加入對(duì)照品的量。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品（或其雜質(zhì)）峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax 含量(m

22、x)=f×-As/ms 式中 Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； mx為供試品（或其雜質(zhì)）的量。f、As和ms的意義同上。當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一分內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和供試品待測(cè)成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：A<x> 含量(mx)=mr×-Ar式中各符號(hào)意義同上由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中某雜質(zhì)或

23、主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。選型綜述要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對(duì)分子質(zhì)量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于2000,則可用空間排阻色譜法。溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或

24、堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對(duì)非極性的混合物，可用液-固色譜法。化學(xué)結(jié)構(gòu)若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對(duì)于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。設(shè)備綜述HPLC的出現(xiàn)不過(guò)三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-

25、4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、恒溫器、記錄儀等主要部件。高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲(chóng)劑、除莠劑的分析等物質(zhì)的分析。高壓泵HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的(16 mm)，所用固定相的粒度也非常?。◣譵到幾十m)，所以流動(dòng)相在柱中流動(dòng)受到的阻力很大，在常壓下，流動(dòng)相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時(shí)。為了達(dá)到快速、高效分離，必須給流動(dòng)相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動(dòng)速度。為此，須用高壓泵進(jìn)

26、行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。 HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：a. 流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為110 mL/min)；b. 能抗溶劑腐蝕；c. 有較高的輸液壓力；對(duì)一般分離,60×105Pa的壓力就滿足了，對(duì)高效分離，要求達(dá)到150300×105Pa。.往復(fù)式柱塞泵當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口（上部）的單向閥打開(kāi)，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開(kāi)，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響

27、，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。氣動(dòng)放大泵其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動(dòng)大面積（ SA ）活塞A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恒壓泵。梯度洗提類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代高效液相色譜中不可缺少的部分。   氣動(dòng)放大泵梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過(guò)載

28、液中極性的變化來(lái)改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：a.低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺(tái)高壓泵輸入色譜柱。b.高壓梯度 ( 或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) ) ：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。進(jìn)樣裝置.注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與 GC法一樣。進(jìn)樣壓力150×105Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。.高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。色譜柱色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。通常用厚壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對(duì)于一些

29、有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為16 mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為 4.6 或 3.9mm ，長(zhǎng)度為 15 30cm 的直形不銹鋼柱。填料顆粒度 5 10m ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約 7000 10000。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。檢測(cè)器.紫外光度檢測(cè)器它的作用原理是基于被分析試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。最常用的檢測(cè)器，應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：a.靈敏度高：其最小檢測(cè)量10-9g·mL-1,故即使對(duì)紫外光吸收很弱的物質(zhì)，也可以檢測(cè)；b. 線性范圍寬；（比爾定律）c.

30、 流通池可做的很小(1mm × 10mm ，容積 8L)；d. 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感可用于梯度洗脫；e. 波長(zhǎng)可選，易于操作：如，使用裝有流通池的可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（可變波長(zhǎng)檢測(cè)器）。缺點(diǎn)：對(duì)紫外光完全不吸收的試樣不能檢測(cè)；同時(shí)溶劑的選擇受到限制。.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；陣列由1024個(gè)光電二極管陣列，每個(gè)光電二極管寬僅50m,各檢測(cè)一窄段波長(zhǎng)。如圖所示，在檢測(cè)器中，光源發(fā)出的紫外或可見(jiàn)光通過(guò)液相色譜流通池，在此流動(dòng)相中的各個(gè)組分進(jìn)行特征吸收，然后通過(guò)狹縫，進(jìn)入單色其進(jìn)行分光，最后由光電二極管陣列檢測(cè)，得到各個(gè)組分的吸收信號(hào)。經(jīng)計(jì)算機(jī)快速處理，得三維立體譜圖。.熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度、高選擇性檢測(cè)器。對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等