不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)洋桔梗愈傷組織的研究

1、不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)洋桔梗愈傷組織的研究摘要：洋桔梗是國(guó)際上十分流行的盆花和切花種類(lèi)之一。開(kāi)展洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo)的研究，對(duì)于洋桔梗的純合多倍體誘導(dǎo)及新種質(zhì)的培育等均具有重要意義。本研究以洋桔梗Double Mariachi Pink品種的無(wú)菌苗葉片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度配比的6- BA、TDZ和NAA、IBA，研究其對(duì)洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，單獨(dú)使用植物生長(zhǎng)物質(zhì)出愈率和愈傷組織生物量明顯低于植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合時(shí)的結(jié)果。各種植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合均能誘導(dǎo)出愈傷組織，且出愈率高，很多培養(yǎng)基的外植體出愈率達(dá)100，只是產(chǎn)生愈傷組織生物量的多少不一，很多誘導(dǎo)培養(yǎng)基還誘導(dǎo)出了不定

2、根和不定芽。6-BA與NAA的不同濃度配比誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生的愈傷組織生物量最多，誘導(dǎo)出不定根和不定芽的組合最多；6-BA與IBA的不同濃度配比誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間最長(zhǎng)且愈傷組織生物量最少，誘導(dǎo)出不定根和不定芽的組合也最少；不同濃度的TDZ與IBA組合誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間最短。綜合考慮出愈率、出愈時(shí)間、愈傷組織生物量及鮮重與干重，培養(yǎng)基MS+7.5M TDZ+0.1M IBA每一項(xiàng)結(jié)果均最優(yōu)，故最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+7.5M TDZ+0.1M IBA。關(guān)鍵詞：洋桔梗；葉片；植物生長(zhǎng)物質(zhì)；愈傷組織；誘導(dǎo)Study of Different Plant Growth Substances

3、 Induction Callus of Eustoma grandiflorum Abstract : Eustoma grandiflorum is one type of the popular potted flowers and cut flowers in the international. Study on callus induction of Eustoma grandiflorum is of great significance for the homozygous polyploid induction and the breeding of new varietie

4、s of Eustoma grandiflorum. In this study, aseptic seedling leaf of Double Mariachi Pink varieties as explant, MS as the basic culture medium, supplemented with different concentration ratio of 6 - BA, TDZ and NAA, IBA, callus induction of Eustoma grandiflorum was studied. The results showed that Sin

5、gle-use plant growth substances of Callus induction rate and callus biomass were significantly lower than the results of the combinations of plant growth substances. A variety of combinations of plant growth substances could induce callus, and the rate was high, a lot of explants on the cu

6、lture medium of callus rate reached 100%, just callus biomass was not the same, many mediums also induced adventitious roots and adventitious bud. Different concentrations of 6-BA and NAA induced explants produced the most Callus biomass, adventitious root and adventitious bud; different concentrati

7、on ratio of 6-BA and IBA took the longest time to induce callus formation and callus biomass was the least, and the least combination induced adventitious root and adventitious bud; different concentration ratio of 6-BA and IBA took the shortest time to induce callus formation; Considering the callu

8、s induction rate, callus biomass, fresh weight and dry weight, results of medium MS+7.5 M TDZ+0.1 M IBA were optimal, so the best medium for callus induction was MS+7.5 M TDZ+0.1 M IBA.Key words: Eustoma grandiflorum; leaf; plant growth substances; callus; induce 目錄前言11、材料與方法11.1材料11.2方法21.2.1 MS培養(yǎng)基

9、的配制21.2.2實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備21.2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì) 6-BA與NAA/IBA組合愈傷組織誘導(dǎo) TDZ與NAA/IBA組合愈傷組織誘導(dǎo)31.2.4數(shù)據(jù)處理32、結(jié)果與分析32.1 6-BA與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響32.2 6-BA 與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響52.3 TDZ與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響62.4 TDZ與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響73、討論與結(jié)論9鳴謝 11參考文獻(xiàn)111前言洋桔梗（Eustoma grandiflorum )為龍膽科草原龍膽屬1-

10、2年生觀(guān)賞植物，又名草原龍膽、大花桔梗，原產(chǎn)于美國(guó)、墨西哥（李尚旺，2012；孫慧晶等，2014）。洋桔?；ㄐ蛣e致，花姿優(yōu)雅，花色多樣，頗具現(xiàn)代感而深受人們喜愛(ài)（段青等，2013）。洋桔梗有單瓣品種、半重瓣品種和重瓣品種；花冠形狀多樣，呈美麗的杯狀、鐘狀、漏斗狀、玫瑰花狀等；花色有粉紅色、玫瑰色、紫色、白色、橘紅色、藍(lán)色及復(fù)色等等，市場(chǎng)上已有300多個(gè)品種（喬學(xué)義，2007；李尚旺，2012；孫慧晶等，2014）。通過(guò)雜交改良后，洋桔梗更兼具耐長(zhǎng)途運(yùn)輸，瓶插時(shí)間長(zhǎng)，插花效果好等優(yōu)點(diǎn)。其銷(xiāo)售需求量在日本、歐洲、美國(guó)和我國(guó)各地急速上升，市場(chǎng)前景十分樂(lè)觀(guān)。截至2012年，我國(guó)洋桔梗切花生產(chǎn)已初具規(guī)模

11、，洋桔梗的栽種面積達(dá)270hm2左右（段青等，2013；孫慧晶等，2014）。早在2008年，洋桔梗就已是國(guó)際上十分流行的盆花和切花種類(lèi)之一，在荷蘭花卉市場(chǎng)躋身十大切花之列（劉明志等，2008；陳小鳳等，2008）。 傳統(tǒng)上洋桔梗的生產(chǎn)都是用進(jìn)口的 F1代種子進(jìn)行繁殖，洋桔梗種子十分細(xì)?。?900粒g），進(jìn)口種子價(jià)格昂貴（每粒約0.3元），加之種子萌發(fā)緩慢，發(fā)芽率較低（80），且種子繁殖后變異較大，成苗時(shí)間較長(zhǎng)（4-6個(gè)月），導(dǎo)致育苗成本較高（李尚旺，2012；孫慧晶等，2014）。自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)品種的缺乏和技術(shù)壁壘，影響了我國(guó)洋桔梗切花的大規(guī)模推廣種植（孫敏杰等，2012；段青等，2013）。

12、開(kāi)展洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo)的研究，對(duì)于洋桔梗的純合多倍體誘導(dǎo)及新種質(zhì)的培育等均具有重要意義(歐巧明等，2012)。 洋桔梗的相關(guān)研究以組織快繁、保鮮與遺傳轉(zhuǎn)化等報(bào)道居多，涉及到愈傷組織誘導(dǎo)的研究很少。劉明志等（2008）研究洋桔梗體細(xì)胞胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中超氧化物歧化酶和酯酶變化和孫慧晶等（2014）在研究?jī)煞N植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)洋桔梗離體培養(yǎng)的效應(yīng)時(shí)有涉及到不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo)的影響。其它物種，愈傷組織誘導(dǎo)的研究(Sonali and Gyan ,2012；Budi et al,2012；韓曉紅等，2013；步達(dá)等，2013；)早已展開(kāi)。在很多植物中，誘導(dǎo)愈傷時(shí)較多的是單獨(dú)使用2,

13、4-D（張文君等，2010）,或2,4-D和6-BA 組合（彭麗萍等，2010）。本研究以洋桔梗Double Mariachi Pink品種為材料，以葉片為外植體，首次展開(kāi)了生長(zhǎng)素（NAA、IBA）和細(xì)胞分裂素(6-BA、TDZ)的不同濃度組合對(duì)洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo)的影響。1、材料與方法1.1材料選用洋桔梗Double Mariachi Pink品種為試驗(yàn)材料，取無(wú)菌幼苗葉片為外植體。1.2方法1.2.1 MS培養(yǎng)基的配制以1L MS培養(yǎng)基的配制為例：用電飯煲燒純凈水900ml左右，燒開(kāi)后加入瓊脂6 g和蔗糖30g，邊加邊攪拌，待再次燒開(kāi)后再攪拌，如此反復(fù)三次，將培養(yǎng)基倒入大燒杯。加入大量元素|

14、50ml、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分各5ml，調(diào)節(jié)pH 為5.8±0.2，定容至1L，攪拌均勻。趁熱將培養(yǎng)基分裝入培養(yǎng)瓶。置于高壓滅菌鍋中121滅菌20min后備用。1.2.2試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備在超凈工作臺(tái)上，選擇洋桔梗無(wú)菌苗，取其頂芽和側(cè)芽轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。為了保證成功率，一個(gè)培養(yǎng)瓶通常轉(zhuǎn)接2-3個(gè)芽。轉(zhuǎn)接后放入組培室（溫度25±2 ，光周期16h，光照強(qiáng)度2000lx）培養(yǎng)。1.2.3不同生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo) 6-BA與NAA/IBA組合的愈傷組織誘導(dǎo)配2LMS培養(yǎng)基，添加不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比，配制愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（圖1），最后將125ml培養(yǎng)基

15、平均分成3份，倒入培養(yǎng)瓶，高壓滅菌鍋滅菌備用。在超凈工作臺(tái)上，取無(wú)菌苗葉片，切成約5mm×5mm的大小，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種離體葉片6片，接種后放入組培室培養(yǎng)（白玉等，2012；徐瑞超等，2012）。125ml0.2MNAA/IBA125ml0MNAA/IBA125ml0.1MNAA/IBA125ml0.3MNAA/IBA2L MS500ml2.5M6-BA500ml0M6-BA500ml7.5M6-BA500ml5.0M6-BA圖1 6-BA與NAA/IBA組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制 TDZ與NAA/IBA組合的愈傷組織誘導(dǎo)方法與

16、類(lèi)似，由于TDZ不耐高溫，故步驟順序不同。配2LMS培養(yǎng)基，均分成4瓶，每瓶500ml，分別添加0M NAA/IBA、0.1M NAA/IBA、0.2M NAA/IBA、0.3M NAA/IBA。然后將培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶、燒杯和玻璃棒一起放入高壓鍋滅菌，滅菌后立即放入超凈臺(tái)，待冷卻到適宜溫度，將每瓶培養(yǎng)基一分為4，每瓶125ml，分別添加0M TDZ、2.5M TDZ、5.0M TDZ、7.5M TDZ。最后將125ml培養(yǎng)基平均分成3份，倒入滅菌的空培養(yǎng)瓶備用。接種外植體同。接種后，每周觀(guān)察記錄一次外植體的變化，培養(yǎng)8周后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、根誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率。用電子天平稱(chēng)量其

17、鮮重，后轉(zhuǎn)入烘箱恒溫70烘至恒重，然后稱(chēng)量干重，并計(jì)算平均每片外植體的鮮重和干重（黃遠(yuǎn)新等，2008）。愈傷組織誘導(dǎo)率(%) = ( 誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/成活的外植體數(shù))×100%1.2.4數(shù)據(jù)處理愈傷組織的誘導(dǎo)率、根誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率、愈傷組織生物量（李琰等，2006）、鮮重及干重的相關(guān)數(shù)據(jù)(郭君麗等，2013）采用Excel統(tǒng)計(jì)處理，出愈率用軟件SPSS16.0進(jìn)行方差分析研究結(jié)果顯著性差異（孫愛(ài)花等，2012）。B2、結(jié)果與分析2.1 6-BA與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響C將葉片外植體置于不同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，1周后觀(guān)察發(fā)現(xiàn)葉片幾乎全部?jī)?nèi)卷（圖

18、2A）；3周后，葉片一端和葉脈或泛白，或泛黃，有出愈傷組織的跡象；培養(yǎng)4周后，葉片明顯加厚、變大、變脆，有的葉片一端長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的疏松的黃綠色顆粒狀愈傷組織；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，葉片四周微微膨大，愈傷組織變大(圖2B）。6周后外植體長(zhǎng)出不定根（圖2C）和不定芽（圖2D）。8周后統(tǒng)計(jì)外植體的出愈率、長(zhǎng)根率和長(zhǎng)芽率（表1）并稱(chēng)量干重和鮮重（圖3）。圖2 A、1周后葉片內(nèi)卷 B、8周后產(chǎn)生愈傷組織 C、6周后長(zhǎng)出不定根 D、6周后長(zhǎng)出不定芽2A2B2C2D由6-BA 與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響（表1）可知，除了空白培養(yǎng)基的出愈率較低只有10外，無(wú)論是單獨(dú)使用不同濃度的NAA和

19、6-BA還是用不同濃度的NAA和6-BA組合，出愈率都很高，甚至大部分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基出愈率達(dá)到100，各植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比誘導(dǎo)培養(yǎng)基的出愈率在5水平上基本不存在顯著性差異，只是愈傷組織生物量的多少有差異。處理編號(hào)6-BA濃度 MNAA濃度M愈傷組織誘導(dǎo)率根誘導(dǎo)率芽誘導(dǎo)率愈傷組織生物量1 0 0 10.0%a+2 0.1 100.0%b33.3%+3 0.2 100.0%b16.7%+4 0.3 100.0%b11.1%+5 2.5 0 100.0%a+6 0.1 96.0%a8.0%4.0%+7 0.2 100.0%a+8 0.3 100.0%a16.7%+9 5.0 0 100.0%a11.1%

20、+10 0.1 100.0%a+11 0.2 95.0%a10.0%+12 0.3 100.0%a11.1%5.6%+13 7.5 0 88.9%a+14 0.1 100.0%b27.8%+15 0.2 100.0%b16.7%+16 0.3 100.0%b4.2%12.5%+表1 6-BA 與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響注： 1、表中小寫(xiě)字母表示經(jīng)方差分析出愈率達(dá)5顯著水平。2、+生長(zhǎng)差; +生長(zhǎng)一般; +生長(zhǎng)較好; +生長(zhǎng)好; +生長(zhǎng)最好。3、未填表示沒(méi)有長(zhǎng)根或長(zhǎng)芽。下同。單獨(dú)使用不同濃度的6-BA或NAA，愈傷組織生物量一般，明顯較6-BA與NAA組合時(shí)少。當(dāng)NAA

21、濃度不變時(shí)，愈傷組織生物量有隨6-BA濃度增加而增加的趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度不變時(shí)，愈傷組織生物量變化規(guī)律不明顯；當(dāng)6-BA與NAA組合時(shí)，愈傷組織生物量整體較高。愈傷組織生物量的變化與鮮重和干重變化（圖3)趨勢(shì)大體吻合。圖3 6-BA與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片鮮重與干重的影響當(dāng)外植體培養(yǎng)到第6周時(shí)，一部分葉片長(zhǎng)出了不定根和不定芽。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不定根與不定芽的數(shù)目有所增加。培養(yǎng)到第8周，培養(yǎng)基MS+7.5M6-BA+0.1M NAA的外植體不定根誘導(dǎo)率最高，達(dá)到27.8%；芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS+0.1M NAA，高達(dá)33.3%。從表1可以看出，不同濃度配比的6-BA與NAA對(duì)長(zhǎng)

22、根與長(zhǎng)芽都有一定的影響。2.2 6-BA 與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響表2 6-BA 與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響處理編號(hào)6-BA濃度MIBA濃度M愈傷組織誘導(dǎo)率根誘導(dǎo)率芽誘導(dǎo)率愈傷組織生物量1 0 0 12.0%a+2 0.1 55.6%b+3 0.2 33.3%c+4 0.3 66.7%d+5 2.5 0 94.4%a5.6%+6 0.1 84.0%b+7 0.2 50.0%c+8 0.3 94.4%a+9 5.0 0 100.0%a+10 0.1 100.0%a+11 0.2 82.6%b+12 0.3 100.0%a+13 7.5 0 1

23、00.0%a16.7%+14 0.1 83.3%b+15 0.2 100.0%a+16 0.3 92.0%c+從6-BA與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響（表2）中發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)使用不同濃度的IBA，愈傷組織誘導(dǎo)率較低，且出愈率在5的水平上顯示顯著性差異。單獨(dú)使用不同濃度的6-BA或6-BA與NAA的不同組合，出愈率普遍較高，但培養(yǎng)基MS+2.5M 6-BA+0.2M NAA外植體出愈率明顯低于其他組合。由表2可知，6-BA與IBA的不同濃度配比愈傷組織生物量都不是很多，產(chǎn)生愈傷組織最多的培養(yǎng)基MS+2.5 M 6-BA+0.2M NAA的外植體愈傷組織生物量較好。6-BA與IB

24、A的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片鮮重與干重的影響結(jié)果差異不大，鮮重在0.13g/片波動(dòng)，干重約為0.02g/片，結(jié)果如圖4。圖4 6-BA與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片鮮重與干重的影響在本研究中，單獨(dú)使用不同濃度的NAA或不同濃度的6-BA與IBA組合對(duì)葉片長(zhǎng)根與長(zhǎng)芽沒(méi)有顯示影響，僅單獨(dú)使用6-BA時(shí)，在MS+2.5 M 6-BA和MS+7.5M 6-BA這兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的外植體誘導(dǎo)出了不定芽，誘導(dǎo)率分別為5.6和16.7。2.3 TDZ與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響洋桔梗外植體葉片在TDZ與NAA的不同濃度配比作用下，2周后葉片兩角和葉脈或泛白，或泛黃，有產(chǎn)生愈傷組織

25、的跡象；培養(yǎng)3周后，葉片明顯加厚、變大、變脆；有的葉片一端長(zhǎng)出少量黃綠色或綠色顆粒狀愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織變大；4周后外植體葉片長(zhǎng)出不定根和不定芽。通過(guò)TDZ與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)使用不同濃度的TDZ時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨濃度升高而升高；單獨(dú)使用不同濃度的NAA或不同濃度組合的TDZ與NAA的出愈率均較高，大部分達(dá)到90以上。在TDZ濃度較低時(shí)，TDZ與NAA的不同濃度配比誘導(dǎo)外植體葉片產(chǎn)生愈傷組織的結(jié)果在5的水平存在顯著性差異；當(dāng)TDZ濃度為7.5M時(shí)，NAA濃度變化，出愈率在5水平差異不顯著且出愈率很高。表3 TDZ與NAA的

26、不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響處理編號(hào)TDZ濃度MNAA濃度M愈傷組織誘導(dǎo)率長(zhǎng)根率長(zhǎng)芽率愈傷組織生物量1 0 0 12.5%a+2 0.1 94.4%b+3 0.2 100.0%b+4 0.3 94.4%b22.2%+5 2.5 0 33.3%a+6 0.1 100.0%b+7 0.2 66.7%c+8 0.3 94.4%b+9 5.0 0 50.0%a6.7%+10 0.1 83.3%b+11 0.2 91.7%c8.3%+12 0.3 91.7%c8.3%+13 7.5 0 94.4%a+14 0.1 100.0%ab+15 0.2 100.0%ab8.3%+16 0.3 88

27、.9%a+單獨(dú)使用不同濃度的TDZ或NAA時(shí)愈傷組織生物量很少；當(dāng)TDZ與NAA組合時(shí)，愈傷組織生物量相對(duì)較高（表3）。愈傷組織生物量有隨TDZ濃度升高而升高的趨勢(shì)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+7.5M TDZ+0.1M NAA的外植體愈傷組織生物量明顯高于其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基，鮮重與干重的結(jié)果與愈傷組織生物量結(jié)果類(lèi)似（圖5）。圖5 TDZ與NAA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片鮮重與干重的影響表3顯示：TDZ與NAA的部分植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)誘導(dǎo)外植體葉片長(zhǎng)根與長(zhǎng)芽有一定的影響。其中MS+0.3M NAA的外植體葉片根誘導(dǎo)率較高為22.2%，而誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+5.0M TDZ和MS+7.5M TDZ+0.2M NAA

28、的外植體誘導(dǎo)了不定芽，誘導(dǎo)率分別為6.7%和8.3%。2.4 TDZ與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表4可知：TDZ與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不同。除單獨(dú)使用不同濃度的IBA和空白培養(yǎng)基，各誘導(dǎo)組合愈傷組織誘導(dǎo)率均較高，誘導(dǎo)結(jié)果在5水平上存在顯著性差異。當(dāng)單獨(dú)使用不同濃度的TDZ或IBA時(shí)，誘導(dǎo)率有隨濃度的升高而升高的趨勢(shì)，且單獨(dú)使用TDZ的誘導(dǎo)率比單獨(dú)使用NAA的誘導(dǎo)率明顯高得多。表4 TDZ與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響處理編號(hào)TDZ濃度MIBA濃度M愈傷組織誘導(dǎo)率長(zhǎng)根率長(zhǎng)芽率愈傷組織生物量1 0 0 25.0%a+2

29、 0.1 染菌3 0.2 61.1%b5.6%+4 0.3 61.1%b27.8%+5 2.5 0 83.3%a+6 0.1 染菌7 0.2 91.7%b+8 0.3 100.0%c11.1%+9 5.0 0 100.0%a+10 0.1 88.9%b+11 0.2 83.3%b11.1%+12 0.3 100.0%a+13 7.5 0 100.0%a22.2%+14 0.1 100.0%a+15 0.2 88.9%b11.1%+16 0.3 88.9%b+注：標(biāo)注“染菌”的處理表示外植體在接種后全部染菌。TDZ與IBA不同生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)洋桔梗愈傷組織生物量的影響（表4）不同。單獨(dú)使用不同濃度

30、的IBA的愈傷組織生物量比其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基的愈傷組織生物量低。當(dāng)IBA濃度不變時(shí)，愈傷組織生物量隨TDZ濃度的升高而升高，且愈傷組織生物量的多少與IBA濃度高低關(guān)系不密切，隨TDZ濃度的變化而變化。TDZ與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片鮮重與干重的影響（圖6）與對(duì)愈傷量的影響大體相同。MS+7.5M TDZ+0.1M IBA的外植體愈傷組織生物量高，且鮮重與干重明顯高于其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基。圖6 TDZ與IBA的不同濃度配比對(duì)洋桔梗葉片鮮重與干重的影響單獨(dú)使用不同濃度IBA時(shí)有誘導(dǎo)出不定根，單獨(dú)使用TDZ或TDZ與IBA的組合時(shí)誘導(dǎo)出不定芽。從表4可知僅IBA為0.2M和0.3M時(shí)誘導(dǎo)出不定根，誘導(dǎo)

31、率分別為5.6和27.8；當(dāng)TDZ濃度為7.5M時(shí)，長(zhǎng)芽率相對(duì)較高，達(dá)22.2。7A7B7C圖7 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)洋桔梗葉片誘導(dǎo)的出愈率、鮮重及干重比較3、討論與結(jié)論本試驗(yàn)結(jié)果得出不同生長(zhǎng)物質(zhì)配比不僅對(duì)洋桔梗葉片出愈率、愈傷組織生物量及鮮重和干重（圖7）的影響不同，而且對(duì)愈傷組織的出愈時(shí)間和生長(zhǎng)速度的影響也不一樣。單獨(dú)使用植物生長(zhǎng)物質(zhì)出愈率和愈傷組織生長(zhǎng)量明顯低于植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合時(shí)的結(jié)果。各種植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合均能誘導(dǎo)出愈傷組織，且出愈率高，很多出愈率達(dá)100，只是愈傷組織生物量的多少不一。6-BA與NAA的不同濃度配比誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生的愈傷組織生物量最多，誘導(dǎo)出不定根和不定芽的組合最多；6

32、-BA與IBA的不同濃度配比誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間最長(zhǎng)且愈傷組織生物量最少，誘導(dǎo)出不定根和不定芽的組合也最少；TDZ與IBA的不同濃度組合誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間最短。分析結(jié)果可知，愈傷組織生物量的變化趨勢(shì)與鮮重和干重的變化趨勢(shì)大體吻合，且愈傷組織生物量的多少與長(zhǎng)根和長(zhǎng)芽發(fā)生的頻率有一定的相關(guān)性。不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響（圖7A）：所有培養(yǎng)基共64個(gè)處理均誘導(dǎo)出了愈傷組織，空白培養(yǎng)基外植體出愈率較低，只有10左右；單獨(dú)使用NAA和6-BA時(shí)，出愈率高，大部分達(dá)到了100；而6-BA與NAA的不同組合不僅生成的愈傷組織又大又多且愈傷組織出愈率在95以上，方差分析出愈率在

33、5水平不存在顯著性差異。這不同于孫愛(ài)花等（2012）用橡膠樹(shù)葉片為外植體試驗(yàn)的結(jié)果，洋桔梗葉片愈傷組織的誘導(dǎo)必須依賴(lài)于植物生長(zhǎng)物質(zhì)，在不含植物生長(zhǎng)物質(zhì)或單獨(dú)使用某種植物生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中外植體愈傷組織的出愈率低甚至為0。只有當(dāng)一定濃度的6-BA和NAA組合使用時(shí)方能得到較高的誘導(dǎo)率和出愈量；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著 6-BA 濃度的提高，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)逐步提高的趨勢(shì)。當(dāng)6-BA與NAA組合對(duì)洋桔梗葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間短，出愈率高，愈傷組織生物量多，效果明顯比6-BA和IBA組合的效果好。與龔明霞等（2008）以洋桔梗F1代種子無(wú)菌苗的葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)的結(jié)果相反，

34、龔明霞等（2008）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA和IBA組合的誘導(dǎo)效果較6-BA和NAA組合好。而當(dāng)TDZ分別與NAA和IBA組合時(shí)，TDZ與IBA的組合效果優(yōu)于與NAA的組合。兩種組合出愈率差異不大，但TDZ與IBA組合的愈傷組織生物量比TDZ與NAA的多，且愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間較之更短。從出愈率、干重和鮮重考慮(圖7)，四種組合中6-BA與NAA組合效果最佳。大部分培養(yǎng)基外植體愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100。除了空白培養(yǎng)基外，其他所有不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比誘導(dǎo)的外植體出愈率在5水平基本不存在顯著性差異，且鮮重和干重均呈現(xiàn)出高于其他三種組合的趨勢(shì)（7B和7C）。但在64個(gè)處理中，綜合考慮出愈率、出愈時(shí)間、愈

35、傷組織生物量及鮮重與干重，培養(yǎng)基MS+7.5M TDZ+0.1M IBA每一項(xiàng)結(jié)果均最優(yōu)，故最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+7.5M TDZ+0.1M IBA。愈傷組織的形成過(guò)程是一個(gè)植物基因型、外植體種類(lèi)、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素之間相互作用的復(fù)雜過(guò)程。這些因素的調(diào)控錯(cuò)綜復(fù)雜，即便是同一因素在不同物種間效應(yīng)也不同，具體效應(yīng)因物種而異（林超等，2013）。其中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)、含量及組成比例是調(diào)控植物器官產(chǎn)生愈傷組織的主導(dǎo)因素（Kohda et al，2012；張彥妮等，2012；孫愛(ài)花等，2012；）。邢小明等（2013）的試驗(yàn)結(jié)果還表明使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及其濃度不同，愈傷組織

36、誘導(dǎo)率褐化率以及愈傷組織的大小和形態(tài)等各不相同。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，洋桔梗的外植體除了誘導(dǎo)生成愈傷組織外，還同時(shí)從愈傷組織或外植體切口處分化出不定芽和不定根。愈傷組織在增殖過(guò)程中，也分化出不定芽和不定根，這與Naz and Anis（2012）、鐘波（2012）、孫慧晶等（2014）的結(jié)果相同。蘇?。?011）的試驗(yàn)還證明：洋桔梗愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽和不定根誘導(dǎo)和分化難度不大，在MS培養(yǎng)基中加入適量的6-BA和NAA（或IBA），就可以誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽與不定根。且不定芽與不定根的增殖、分化、生長(zhǎng)發(fā)育等與6-BA的濃度以及6-BA和NAA濃度比例關(guān)系密切。在本研究中，很明顯不同濃度的6-BA與N

37、AA組合比不同濃度的6-BA與IBA組合誘導(dǎo)不定根與不定芽更容易。蘇瑞軍等（2014年）的試驗(yàn)結(jié)果表明：愈傷組織分化不定芽數(shù)隨著細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值的升高而升高；高于一定比例時(shí)，愈傷組織分化不定芽數(shù)隨著細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值的升高而降低。此次研究不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)洋桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，對(duì)洋桔梗的純合多倍體誘導(dǎo)及新種質(zhì)的培育等均具有重要意義，為洋桔梗早日突破技術(shù)壁壘擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種增加可能性。鳴謝 作者衷心感謝指導(dǎo)老師和學(xué)姐對(duì)于本研究在各方面給予的支持和幫助。參考文獻(xiàn)Jana S,Shekhawat G.2011.Plant growth regulators adeni

38、ne sulfate and carbohydrates regulate organogenesis and in vitro flowering of Anethum graveolensJ.Acta Physiol Plant,(33):305-311Kohda H, Ozaki M, Namera A.2012.Production of lignans in calluses of Schisandra chinensisJ.J Nat Med,(66):373376Naz R, Anis M.2012.Acceleration of Adventitious Shoots by I

39、nteraction Between Exogenous Hormone and Adenine Sulphate in Althaea Officinalis LJ.Appl Biochem Biotechnol,(168):12391255Winarto B,Jaime A, Silva T.2012.Influence of isolation technique of half-anthers and of initiation culture medium on callus induction and regeneration in Anthurium andreanumJ.Pla

40、nt Cell Tiss Organ Cult,(110):401-411白玉,高月,趙倩,馬慧,陳麗靜,鐘鳴.2012.紫茉莉愈傷組織誘導(dǎo)的激素優(yōu)化研究J. 園藝與種苗,(7):52-54步達(dá),姚曉,劉曉藝,李祥,陳建偉.2013.不同激素配比對(duì)明黨參葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響及其總香豆素的含量測(cè)定J. 中國(guó)藥房,(19):1806-1809陳小鳳，龔明霞，康德賢.2008.國(guó)內(nèi)洋桔梗組培快繁技術(shù)的研究進(jìn)展J.北方園藝，(6):67-69都婷，商雨，楊輝2013.云南含笑組織培養(yǎng)快繁技術(shù)及愈傷組織誘導(dǎo)研究J云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué),28(4):530-535杜希華,孫秀玲,郝崗平,侯福林.2008.不同外植體和激