測(cè)序引物設(shè)計(jì)指南

1、測(cè)序引物設(shè)計(jì)指南PCR引物設(shè)計(jì)方法：1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。引物長(zhǎng)度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另

2、外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)

3、配的引發(fā)效率大大降低，G和C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。6.堿基要隨機(jī)分布。         引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。      

4、0; 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。        引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8.引物

5、5 端和中間G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3 端G值較低。        G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5端和中間G值相對(duì)較高，而3端G值較低（絕對(duì)值不超過9）的引物。引物3端的G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）9.引物的5 端可以修飾，而3 端不可修飾。        引物的5端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性

6、影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。         引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。10.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。        某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比

7、如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。11.引物應(yīng)具有特異性。        引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。       值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模

8、板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。做RealTime時(shí),用于SYBRGreenI法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的?？偨Y(jié)：1)避免重復(fù)堿基，尤其是G.2)Tm=58-60度。3）GC=30-80%.4)3端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300b

9、p）。7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；         要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。        至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的。        做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備-尋找合適的引物非常不容易。        關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對(duì)，