什么是熒光定量(轉(zhuǎn))

1、1、什么是定量PCR？以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。 2、定量PCR定量的理論依據(jù)是什么？特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴(kuò)增過程越短，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，最終擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的。理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2n 其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量， X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù) n為擴(kuò)增次數(shù)；理論上PCR擴(kuò)增效率為100%，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不完全，即

2、每一次擴(kuò)增中，模板不是呈2的倍增長；實(shí)際應(yīng)為：Y= X(1+E)n ，其中E 代表擴(kuò)增效率：E = 參與復(fù)制的模板/總模板，通常E1，E在整個PCR擴(kuò)增過程中不是固定不變的。通常X 在 1105拷貝、循環(huán)次數(shù)n30時，E 相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y 呈非固定的指數(shù)形式增加，最后進(jìn)入平臺期。 3、熒光定量PCR定量的理論模式又是什么？PCR是對原始待測模板核酸的一個擴(kuò)增過程，任何干擾PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量，使得PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒有一個固

3、定的比例關(guān)系，通過檢測擴(kuò)增終產(chǎn)物很難對原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來研究人員通過大量的實(shí)踐，研究了相對準(zhǔn)確的定量PCR方法，即熒光定量PCR。PCR擴(kuò)增通式： Tn=T0（1+E）n Tn=Tn-1（1+E）n 注：0其中E表示擴(kuò)增效率，n為循環(huán)數(shù)，Tn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，Tn-1表示在n-1個周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，T0為原始模板數(shù)量。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時，產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴于某一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù)K，為常數(shù)，大約在1010左右)高于背景為儀器所識別，此時的循環(huán)數(shù)為CP（crossing point）,也就是K= T0（1+E）CP，取對數(shù)即：lg K

4、=lg T0+CP*lg(1+E)CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)由于對一特定的PCR而言，E與K均為常數(shù)，故上式為循環(huán)數(shù)（CP）對原始模板拷貝數(shù)的對數(shù)（lg T0）一次方程，其標(biāo)準(zhǔn)形式y(tǒng)=kx+b,該直線的斜率為- 1/lg(1+E)，在橫坐標(biāo)上的截距為lgk/lg(1+E)，也是熒光定量PCR所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如下圖為單管實(shí)時熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線： 目前熒光定量PCR均采用外標(biāo)定量外標(biāo)法定量PCR擴(kuò)增效率的計算，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(Slope)為- 1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1 ,如從標(biāo)準(zhǔn)曲線中知道Slope=-

5、3.337,則可推知擴(kuò)增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作者將(1+E)直接視為擴(kuò)增效率E，則E=10-1/Slope，求得的E值均在12之間，有時也有大于2的結(jié)果，如下圖所示。另外也可直接根據(jù)系列稀釋外標(biāo)在該次實(shí)時熒光PCR的結(jié)果來大略分析擴(kuò)增效率的高低，例如系列10倍稀釋外標(biāo)在PCR擴(kuò)增時有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3,在擴(kuò)增到指數(shù)期時熒光值相同則代表此點(diǎn)的終末拷貝數(shù)相同，即N2=N3，En2-n3=10,取對數(shù)得到ngE=1, E=101/n，E=2，n=3.32; E=1.8，n=3.91.反之亦然。 根據(jù)PCR擴(kuò)增過程中是否加入某種標(biāo)記物、標(biāo)

6、記物的種類以及最后檢測的信號的不同可分為四種類型：直接定量檢測法， 同位素標(biāo)記定量，酶標(biāo)記定量檢測法，熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR 主要原理發(fā)射波長與受體熒光染料光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長的熒光，同時將供體熒光淬滅。SYBR Green I 檢測模式SYBR Green I 是一種能與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光大增強(qiáng)。因此， SYBR Green I的檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。PCR擴(kuò)增程序一般為945572三步法，40個循環(huán)。SYBR Green I 的缺點(diǎn)：由于

7、SYBR Green I沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。 SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)：SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。 5、為什么要用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量？它與傳統(tǒng)的定量PCR有什么不同？如前所述的，傳統(tǒng)的定量PCR有很多，主要是倍比稀釋法、內(nèi)參照法、競爭法、PCR-ELISA法，但這些定量PCR技術(shù)的難點(diǎn)主要在于：（1）如何

8、確定PCR正處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號才與初始模板的拷貝數(shù)成比例）。（2）一旦線性擴(kuò)增范圍確定以后，如何找到一個合適的方法檢測結(jié)果。為了保證線性，研究者要擴(kuò)增一系列梯度稀釋的cDNA或者對每個基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；有的研究者加一個競爭性模板，有的做限制性的稀釋梯度分析，或者加一個PCR模擬（mimic）反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴(kuò)增，而擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測通常在跑膠以后通過染料、放射活性或者探針進(jìn)行檢測。（3）大多數(shù)是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有

9、很大差異（如下圖所示），因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量；雖然加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以傳統(tǒng)定量PCR的缺點(diǎn)是：勞動強(qiáng)度大、定量不準(zhǔn)確、重復(fù)性差。 而熒光定量PCR有如下顯著的優(yōu)點(diǎn)：1、特異性好，使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。 2、靈敏度高，熒光PCR檢測技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測靈敏度很高。3、線性關(guān)系好、線性范圍寬，由于熒光信號的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成

10、一一對應(yīng)的關(guān)系，通過熒光信號的檢測可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量；定量范圍可在01010拷貝/毫升。4、操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要開蓋，不易污染；同時擴(kuò)增和檢測一步完成，不需要后期處理，不再需要擔(dān)心放射性污染。5、速度快、高通量，可在23小時完成96個樣品的定量分析。 6、熒光定量PCR為什么使用外標(biāo)定量，而不是內(nèi)標(biāo)定量？A、內(nèi)標(biāo)對實(shí)時熒光定量PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣

11、品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。B、熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)定量實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：（1）Ct值的高度重現(xiàn)性 PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是

12、恒定的。（2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。 7、為什么要用定量PCR而不是定性PCR？在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的一些場合，由單純PCR所提供的陽性或陰性結(jié)果還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，在闡述許多問題的本質(zhì)時，基因及其表達(dá)的定量起著至關(guān)重要的作用。定量PCR常用來研究發(fā)病機(jī)制、估計病毒的負(fù)荷量、監(jiān)

13、測臨床治療進(jìn)展或用于診斷遺傳缺陷等。通過對靶基因量的檢測，將其與疾病的臨床表現(xiàn)、臨床分型以及各種標(biāo)志酶的值聯(lián)系起來，為疾病的診斷和藥物療效監(jiān)測提供科學(xué)的依據(jù)。與非定量PCR分析方法不同，定量PCR分析的操作程序有助于評估污染的情況，即測出污染的程度，即使負(fù)對照產(chǎn)生了正的信號，只要這些信號比實(shí)驗(yàn)樣品的低得多，依據(jù)這樣的結(jié)果，至少可以推測出實(shí)驗(yàn)中所得出的信號是真實(shí)的。在一定程度上消除了單純PCR過于敏感、假陽性率高的缺點(diǎn)。 8、如何設(shè)計熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案？1)、大量閱讀相關(guān)的背景資料后，根據(jù)自己所要研究的基因名稱，在genebank中找到相應(yīng)的基因序列。（www.ncbi.nlm.n

14、） 2)、用引物設(shè)計軟件Primer5.0、Oligo6.0或beacon designs3.0進(jìn)行引物探針的設(shè)計；（該軟件可在下載） 引物設(shè)計通常遵守如下原則：A、引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。B、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。C、引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。D、引物長度通常在2025bp,Tm值在5565，GC含量在40%60%，產(chǎn)物大小在100-250bp之間。E、引物的3端避免使用堿基A；引物3端避免出現(xiàn)3 個以上連續(xù)相同的堿基。F、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子。 探針設(shè)計通常遵守如下原則：A

15、、探針位置盡可能地靠近上游引物。B、探針長度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引物高510，GC含量在40%70%。C、探針的5端應(yīng)避免使用堿基G。D、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。 3）、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。(www.ncbi.nlm.nih/blast)4）、根據(jù)儀器特點(diǎn)和個人的喜好，選擇標(biāo)記的熒光素種類。如：FAM、Texas red、LC-Red640，LC-Red705等，同時確定熒光定量PCR的方法，選擇Taqman或beacon等，可參考前面所述。5）、

16、選擇高品質(zhì)的引物探針合成商，如閃晶生物等。6）、外標(biāo)準(zhǔn)品的制備：一種是化學(xué)合成目的基因，它的優(yōu)點(diǎn)是純度高、定量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是受化學(xué)合成工藝的限制，只能合成120bp以下的長度；一種是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接梯度稀釋，它的優(yōu)點(diǎn)是方便、簡單，缺點(diǎn)是不準(zhǔn)確、不穩(wěn)定；另一種是將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，然后抽提出質(zhì)粒，經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)的換算，可準(zhǔn)確定量，它的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、準(zhǔn)確。如果是轉(zhuǎn)基因食品，則要求轉(zhuǎn)基因食品與非轉(zhuǎn)基因食品按一定的比例混合做成標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋液可以是TE或者是閃晶生物提供的DNA保存液?？截悢?shù)（質(zhì)量÷分子量）×6.0×1023。通常外標(biāo)由4個點(diǎn)到5個點(diǎn)組成，模板的

17、濃度分別為107/ml、106/ml、105/ml、104/ml、103/ml。7）、合成好的引物探針，最好用雙蒸水稀釋成25pmol/ul的濃度，然后放20保存，還應(yīng)該注意避光保存探針。如果是配成25pmol/ul的濃度，那么所加水的量是（ul）： (OD數(shù)×33)÷分子量×400008)、PCR反應(yīng)液的配制 1×PCR buffer、0.3-0.5pmol/ul的引物、0.10.3pmol/ul的探針、2.5-4.0mM的Mg2+、1-2U的Taq酶、0.20.4mM的dNTPs、0.2-1U的UNG酶、0.3-0.6mMdUTP、通常取2-5ul的

18、模板、反應(yīng)總體積通常為2050ul（以上所有的濃度都是指終濃度）9)、PCR擴(kuò)增程序的設(shè)定 在lightcycler上通常是：先502分鐘 933分鐘，然后935秒 6020秒，循環(huán)40次，在60時，設(shè)定熒光檢測點(diǎn)。 在其它熒光儀器上，通常是：先502分鐘 935分鐘，然后9320秒 6030秒，循環(huán)40次，在60時，設(shè)定熒光檢測點(diǎn)。10）、為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對照和4個標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣品都平行做2個復(fù)孔。11）、基線或閥值的設(shè)定 通常是以1015個循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性對照熒光值的最高點(diǎn)作為基線。  9、熒光定量PCR常見的幾個問題1）、文獻(xiàn)上找到的引

19、物和探針序列能否直接使用？通常國外的文獻(xiàn)可信度比較高，可直接使用；但為了保險起見，最好用blast對引物探針的序列進(jìn)行必要的驗(yàn)證；或者再進(jìn)一步用primer軟件對引物探針的二級結(jié)構(gòu)和退火溫度進(jìn)行分析，這樣更有利于您對整個實(shí)驗(yàn)的把握。2）、在實(shí)驗(yàn)之前要進(jìn)行哪些準(zhǔn)備工作？首先要不加探針做常規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證引物是否工作、模板是否降解、模板純度是否合適，同時確定實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。3）、標(biāo)本的采集和處理應(yīng)該注意什么問題？根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和目的，有針對性采集病灶部位的標(biāo)本；采集好的標(biāo)本，最好根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量，用凍存管分成幾小份，放在80保存，以免反復(fù)凍融；標(biāo)本通常分成3類，如細(xì)胞組織、分泌物、

20、血清全血；如果是血清，不能有融血現(xiàn)象的發(fā)生，否則會影響PCR的擴(kuò)增；如果是全血，最好不用EDTA作為抗凝劑，選用檸檬酸作為抗凝劑，否則會影響PCR的擴(kuò)增；如果是組織，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的標(biāo)本，更應(yīng)該防止反復(fù)凍融和保持標(biāo)本的新鮮。4）、在做熒光定量實(shí)驗(yàn)時要注意些什么呢？A、在操作中，應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套（經(jīng)常替換）、一次性移液器吸頭（帶濾嘴自卸式），并不能用手直接觸摸毛細(xì)管、離心管嗎底部。B、在試劑準(zhǔn)備和標(biāo)本處理時應(yīng)使用超凈工作臺(負(fù)壓式)或防污染罩，以防止對環(huán)境的污染。C、操作臺、移液器、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀等儀器設(shè)備應(yīng)經(jīng)常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次實(shí)驗(yàn)

21、前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作臺。D、實(shí)驗(yàn)中涉及的有害有毒的標(biāo)本及試劑應(yīng)妥善放置，專人保管；廢棄物應(yīng)置專門容器中，妥善處理。E、熒光探針應(yīng)避光保存，加入反應(yīng)液中后，應(yīng)盡快配制好反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。F、配制反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡。G、配制反應(yīng)體系過程中若需標(biāo)記，請在試管架或離心機(jī)管架上標(biāo)記，不要直接標(biāo)記在離心管上。5）、為什么陽性對照一直沒有擴(kuò)增曲線？首先確定沒有少加漏加反應(yīng)成分，確定反應(yīng)條件是否合適，模板是否降解；但也可能是體系有問題

22、，如：鎂離子濃度不對、酶濃度不對等；最大的可能是酶不工作或是探針不工作了；6）、為什么陰性對照一直有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)？最大的可能是有污染了；但也可能是體系有問題，如：鎂離子濃度不對、酶濃度不對等。7）、如果出現(xiàn)污染該怎么辦？以替換法確定污染從何而來，對癥下藥，值得注意的是，因熒光定量PCR的敏感度極高，從防止污染的角度出發(fā)，最好在體系中加有dUTP，一旦出現(xiàn)污染現(xiàn)象，可以用UNG酶消除；同時將實(shí)驗(yàn)室分成4個區(qū)，即試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。18、酶或探針不工作怎么辦？在有充分證據(jù)的情況下，找供應(yīng)商的責(zé)任，所以在買酶和探針時要找有質(zhì)量保證和信用的供應(yīng)商，譬如閃

23、晶生物，以免不必要的麻煩。19、客戶需要提供什么？一般只需要提供基因序列和樣品就可以了。 實(shí)時熒光定量PCR1 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的方法學(xué)1.1 原理 所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time 技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時地監(jiān)測反應(yīng)全過

24、程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，

25、而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與

26、該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 1.2 熒光化學(xué) 目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測兩大類。 擴(kuò)增序列非特異性檢測方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種最簡單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR gr

27、een 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。 擴(kuò)增序列特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-time

28、 Q-PCR中最廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個原理。PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)，此時5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET），因此探針完整時，檢測不到該探針5端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5-3外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系

29、中，從而脫離3端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo)（molecular beacon）就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個開放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。熒光標(biāo)記引

30、物是從分子信標(biāo)的概念變化而產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。目前主要有兩種：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。雜交探針（hybridization probe）使用兩個特異的探針，其中上游的探針的3端標(biāo)記有供體熒光素（donor），而下游的探針的5端標(biāo)記有受體熒光素（acceptor）。在PCR中模板退火階段，兩探針同時與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，此作用與上述水解探針的方式

31、相反），使得受體熒光基團(tuán)發(fā)出熒光；當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時，無熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核苷酸熔解曲線（melting curve）對與寡核苷酸探針結(jié)合的序列進(jìn)行分析，從中獲取有用的信息。 1.3 定量方法 在real-time Q-PCR中，模板定量有兩種策略；相對定量和絕對定量。相對定量指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化。絕對定量指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本的量。1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的法的相對定量 由于在此方法中量的表達(dá)是相對于某個參照物的量而言的，因此相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對于所用的標(biāo)準(zhǔn)品

32、只要知道其相對稀釋度即可。在整個實(shí)驗(yàn)中樣本的靶序列的量來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的量，即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。在實(shí)驗(yàn)中為了標(biāo)準(zhǔn)化加入反應(yīng)體系的RNA或DNA的量，往往在反應(yīng)中同時擴(kuò)增一內(nèi)源控制物，如在基因表達(dá)研究中，內(nèi)源控制物常為一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH等）。1.3.2 比較CT法的相對定量 比較CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量的不同之處于在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來反應(yīng)起始模板的量，一個循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方

33、法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計。1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對定量 此方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量的不同之處在于其標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先可知的。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常作為絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。 2 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用Real-time Q-PCR的應(yīng)用范圍很廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的測定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的檢測，細(xì)胞因子的表達(dá)分析，腫瘤耐藥基因表達(dá)

34、的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測中的應(yīng)用作一概述。 2.1 微小殘留病變的檢測腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤常伴有特異性基因的易位，這種易位往往可以作為監(jiān)測臨床治療效果的一種腫瘤標(biāo)志。雖然在過去的幾十年里治療方案的改進(jìn)已大大地延長了病人的生存期，但是緩解期的病人仍存在復(fù)發(fā)的危險性。因此微小殘留病變（MRD）的檢測對于進(jìn)一步調(diào)整治療方案是至關(guān)重要的。Real-time Q-PCR的應(yīng)用正成為檢測腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備的研究工具。通過對腫瘤融合基因的定量測定能指導(dǎo)臨床對病人實(shí)行個體化的治療。急性粒細(xì)胞性白血病（AML）最常見的染色體異常是交互易位t(8；21) (q 22；q22)，在

35、這易位中，AML-1轉(zhuǎn)錄因子基因和8號染色體的MTG8基因發(fā)生融合，致使正常的AML-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到影響，這可能是白血病的病因。目前的研究證明用real-time Q-PCR來檢測融合基因有助于對這些病人的MRD進(jìn)行定量，其作為預(yù)后的指標(biāo)或?qū)χ委煼桨傅脑u估是有價值的。同樣的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML）的BCR-ABL融合基因；急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL）的白血病特異的TEL-AML1融合基因；濾泡狀淋巴瘤（FL）的染色體易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。許多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的應(yīng)用，隨著技術(shù)的發(fā)展，Real-time Q-PCR的運(yùn)用將不斷地擴(kuò)大。 2.2 細(xì)胞因子的表達(dá)分析 細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)蛋白，它通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)（包括淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化、生存和凋亡）在免疫系統(tǒng)中起著核心作用。許多不同類型的細(xì)胞都能分泌這種低分子量的蛋白質(zhì)，其中包括