生物分離工程第四章 沉淀分離法

1、第四章第四章 離心和沉淀分離法離心和沉淀分離法 大部分工業(yè)生物分離的第一步往往是將不溶物質(zhì)從發(fā)大部分工業(yè)生物分離的第一步往往是將不溶物質(zhì)從發(fā)酵液中除去。這些不溶性固體的濃度和顆粒大小的變酵液中除去。這些不溶性固體的濃度和顆粒大小的變化范圍很寬?；秶軐挕?濃度可高達每單位體積含濃度可高達每單位體積含60%的不溶性固體，又可低的不溶性固體，又可低至每單位體積僅含至每單位體積僅含0.1%。 粒徑的變化可以從直徑約為粒徑的變化可以從直徑約為1um的微生物，到直徑為的微生物，到直徑為1mm的不溶性物質(zhì)。的不溶性物質(zhì)。 對于這些濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，對于這些濃度較小，粒徑較大，硬度較強

2、的不溶物，我們可以采用過濾方法分離。我們可以采用過濾方法分離。 而有些發(fā)酵液，使用助濾劑有利于過濾分離，而還有而有些發(fā)酵液，使用助濾劑有利于過濾分離，而還有一些發(fā)酵液則不行。一些發(fā)酵液則不行。問 題固液分離：第一選擇為過濾， 過濾技術難處理的發(fā)酵液如何處理？ 第二選擇離心分離。離心法與過濾法的比較離心法與過濾法的比較比較比較項目項目濃縮物濃縮物設備設備經(jīng)濟經(jīng)濟適用性適用性處理量處理量應用應用范圍范圍離心法離心法懸浮液或懸浮液或漿體漿體需需專用設備專用設備成本高成本高小小實驗室范圍實驗室范圍過濾法過濾法濾餅濾餅不需不需專用設備專用設備成本低成本低大大實驗室實驗室工業(yè)范圍工業(yè)范圍離心分離原理離心分

3、離原理 離心力：離心力： Stocks Force(粘滯吃力粘滯吃力)：離心沉降速度：離心沉降速度：分離因子定義分離因子定義Fr：離心力/重力加速度(g)的比值意義：衡量離心設備的離心程度的重要技術參數(shù)，用于離心機的分類離心技術分類離心技術分類按分離因子按分離因子Fr分類分類 1)、常速離心機Fr 8000-15000g 4)、超速離心機，F(xiàn)r = 20,000 1,000,000g二、沉淀分離法二、沉淀分離法 （一）概述1.定義利用某種沉淀劑使目標產(chǎn)物或雜質(zhì)的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程 與結晶聯(lián)系與結晶聯(lián)系 在本質(zhì)上都是新相析出的過程，主要是物理變化，當然也存在化學反應的沉淀或結晶

4、。 區(qū)別區(qū)別結晶為同類分子或離子以有規(guī)則排列形式析出，沉淀為同類分子或離子以無規(guī)排列形式析出。2、類型1)鹽析沉淀法2)有機溶劑沉淀法3)等電點沉淀法4)高分子聚合物沉淀法5)金屬離子沉淀法沉淀法操作步驟 在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑； 沉淀物的陳化，促進晶體生長； 離心或過濾，收集沉淀物；沉淀分離的目的：（1）通過沉淀使目標成分濃縮和去除雜質(zhì)；（2）通過沉淀將已經(jīng)純化的產(chǎn)物由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，便于保存和進一步加工。沉淀法用于分離純化應該是是有選擇性的，即有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分。沉淀法的沉淀法的優(yōu)點：優(yōu)點： 設備簡單、成本低、原材料易得、便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中

5、沉淀越有利，收率越高；沉淀法的沉淀法的缺點：缺點： 所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，所以沉淀法所得的產(chǎn)品純度通常都比結晶法低，過濾也較困難。 應用沉淀技術分離生化產(chǎn)物的典型例子是蛋白質(zhì)(酶)的分離提取，無論是實驗室規(guī)模還是工業(yè)生產(chǎn)，沉淀法都得到了普遍應用,工業(yè)上利用蛋白質(zhì)溶解度之間的差異從天然原料如血漿、微生物抽提液、植物浸出液和基因重組菌中分離蛋白質(zhì)混合物已有50多年的歷史了。沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點有沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點有：1 在生產(chǎn)的前期就可使原料液體積很快地減小1050倍，,從而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費用；2 使中間產(chǎn)物保持在一個中性溫和的環(huán)境；3 可及早

6、地將目標蛋白從其與蛋白水解酶混合的溶液中分離出來、避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；4 用蛋白質(zhì)沉淀法作為色譜分離的前處理技術，可使色譜分離使用的限制因素降到最低。（二）鹽析沉淀法 1. 定義在高濃度中性鹽存在下，使目標產(chǎn)物的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀的過程2.鹽析原理 首先需要了解蛋白質(zhì)的特性： 是高分子兩性電解質(zhì)，主要由疏水性不同的氨基酸組成，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成。大部分蛋白質(zhì)溶于水，是以親水膠體的形式或大分子溶液存在的。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性電荷穩(wěn)定性： 兩性電解質(zhì)，由于靜電斥力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系空間穩(wěn)定性： 蛋白質(zhì)周圍形成水化膜，保

7、護了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，形成穩(wěn)定的膠體溶液。 可以通過降低蛋白質(zhì)周圍的水電層和雙電層厚度降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而使蛋白質(zhì)沉淀。鹽析示意圖n破壞水化層n中和電荷3.鹽析過程當中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降，原因如下：A.無機離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；B.中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導致沉淀；離子強度對鹽析過程的影響 鹽析沉淀平衡式（Cohn經(jīng)驗公式） S蛋

8、白質(zhì)溶解度，mol/L; I離子強度 c:離子濃度；Z：離子化合價IKSslog221iiZcI，Ks常數(shù)和Ks的物理意義 截距常數(shù),與鹽的種類無關，但與蛋白質(zhì)的種類、溫度和pH值有關。(= log S0) Ks鹽析常數(shù)，與溫度、pH值無關，與蛋白質(zhì)和無機鹽的種類有關。經(jīng)驗方程的圖示1. 在一定的pH值及溫度條件下，改變鹽的濃度(即離子強度)達到沉淀的目的，稱為“Ks” ” 分級鹽析分級鹽析法法。 （Ks鹽析：鹽析：固定pH ，溫度，改變鹽濃度）2.2.在一定的離子強度下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度，達到沉淀的目的，稱為“”分級鹽折法。分級鹽折法。 （ 鹽析：鹽析：固定離子濃度，改變pH ，溫度）

9、 由于蛋白質(zhì)對離子強度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。一般粗提蛋白時常用第1種方法，進一步分離純化時常用第2種方法。鹽析法分為兩種類型4、鹽析劑的選擇1)鹽析劑的條件鹽析作用要強： 鹽析能力 陰離子陽離子；高價陰離子低價陰離子有較大的溶解度，且溶解度受溫度的影響盡可能小。鹽析用鹽必須是惰性的，不致影響蛋白質(zhì)等生物分子的活性，最好不要引入不易分離的雜質(zhì)。來源豐富、經(jīng)濟常用鹽析劑(NH4)2SO4 、Na 2SO4、磷酸鹽、檸檬酸鹽等。 最常用最常用 (NH4)2SO4 優(yōu)點：符合上述要求；缺點：水解后溶液pH降低，在高 pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除

10、盡。 次常用次常用Na 2SO4 。缺點：在40度以下溶解度較低，因此主要用于熱穩(wěn)定蛋白。陰陽離子鹽析效果 陰離子鹽析效果 ： 檸檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-陽離子鹽析效果： NH4+ K+Na+ 高價陽離子5、影響鹽析的因素 溶質(zhì)分子種類的影響：Ks和值 溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高； pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近； 鹽析溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降；6、鹽析沉淀法的特點 優(yōu)點：成本低、無需專門的設備、易于操

11、作、安全性高、不會引起生物物質(zhì)變性失活、適用范圍廣；缺點：通常選擇性不好（非蛋白的雜質(zhì)夾帶沉淀很少）， 往往有共沉淀產(chǎn)物，一般作為粗提純操作，還需要與其它分離方法聯(lián)合使用。鹽份含量高。（三）有機溶劑沉淀法 1.定義在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。2.沉淀機理 （1）降低了水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。（3 ）有機溶劑的加入會破壞蛋白質(zhì)的某種鍵如氫鍵，使其空間結構發(fā)生某種程度的變化，疏水基團暴露并與有

12、機溶劑疏水基團 結合形成疏水層有機溶劑中的蛋白質(zhì)沉淀有機溶劑沉淀分離的原理示意圖3、有機溶劑的選擇1)介電常數(shù)小，沉淀作用強2)對生物分子的變性作用小3)與水互溶4)安全、無毒、價廉、易回收等# 常用有機溶劑為：甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇常用的有機溶劑沉析劑 乙醇（濃度60%） ：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮（濃度40-50%） ：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣； 特點：介電常數(shù)小， 60%乙醇的介電常數(shù)是48 40-50%丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取4.有機溶劑沉淀的特點 分辨率高； 溶劑容易分離，并可回收使用； 產(chǎn)品潔凈（有機溶

13、劑易祛除）； 容易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性失活； 應注意在低溫下操作； 成本高 溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；一般在0以下，操作時在冰鹽浴中進行。 攪拌速度：散熱 溶液pH值：通常選在等電點附近 離子強度:離子強度低有利于沉析，鹽濃度一般在0.010.05mol/L 生物樣品濃度: 蛋白質(zhì)溶液的起始濃度0.52%，粘多糖起始濃度12%為宜。?。喝軇┯昧看?，回收率低，但共沉淀作用小濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低 金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+5、有機溶劑沉淀過程的影響因素（四）等電點沉淀法1.定義調(diào)節(jié)體系pH值，使兩性電解質(zhì)的溶解度下降，析出的操作

14、稱為等電點沉淀。2.沉淀機理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結構被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進而產(chǎn)生沉淀。3.鹽離子的影響使蛋白質(zhì)的實際等電點發(fā)生“漂移”， pI偏離（0.5）與陽離子結合， pI升高與陰離子結合， pI降低4、特點1)沉淀條件溫和；2)不引入新的物質(zhì)；3)沉淀效果差。 由于在等電點附近，溶質(zhì)仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點沉淀法通常與鹽析、有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用。（五）高分子聚合物沉淀法1.定義利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的過程2.沉淀機理非離子型 如聚

15、乙二醇（PEG）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，機理：類似于有機溶劑沉淀離子型（海藻酸鹽、聚丙烯酰胺鹽、聚乙烯亞胺）：有機溶劑沉淀+架橋PEG沉淀法機理： PEG分子親水性強，優(yōu)先水合，使得蛋白質(zhì)等從溶劑中析出. 優(yōu)點 1 體系的溫度只需控制在室溫條件下； 2 沉淀的顆粒往往比較大，同其他方法相比，產(chǎn)物比較容易收集； 3 PEG非但不會使蛋白質(zhì)變性而且可以提高它的穩(wěn)定性， 缺點 PEG比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去，為此需用超濾和液液萃取來解決。廣泛應用于核酸、酶的分離非離子型聚合物沉淀法3、特點 沉淀效果較好，條件溫和 高聚物的殘留 有一定的毒性（陽離子）（六）金屬離子沉淀法1.定義

16、利用一些金屬離子與目的物復合，降低其復合物的溶解度而析出固相物的過程2.沉淀機理 由于金屬離子能與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位起反應，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。例如鋅組胺酸殘基中的咪唑基結合，使蛋白質(zhì)的等電點轉(zhuǎn)移，沉淀析出。3. 分類與羧基、胺及雜環(huán)等含氮化合物結合；如Mn2+、Fe2 + 、Zn2 + 、Cu2 +等與羧基結合，不與胺及雜環(huán)等含氮化合物結合；如Ca2 + 、Ba2 + 、Mg2 + 、Pb2 +等與巰基結合；如Hg + 、Ag + 、Pb2 +等3、特點 沉淀效果很好； 選擇性好 容易使生物分子變性 復合物難分解（七）選擇性變性沉淀法 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜質(zhì)蛋白變性沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為選擇性變性沉淀法 在操作之前要對欲分離的物質(zhì)中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類、含量及其物理化學性質(zhì)等有比較全面的了解。使用時需慎重！使用時需慎重！選擇性變性的方法 選擇性熱變性：對于選擇性熱變性：對于- -淀粉酶等熱穩(wěn)定性好淀粉酶等熱穩(wěn)定性好的酶，可以通過加熱進行熱處理，使大多數(shù)雜的酶，可以通過加熱進行熱處理，使大多數(shù)雜蛋白受熱變性沉淀而被除去。蛋白受熱變性沉淀而被除去。 選擇性酸堿變性：根據(jù)欲分離物質(zhì)所含雜質(zhì)在選擇性酸堿變性：根據(jù)欲分離物質(zhì)所含雜質(zhì)在不同這不同這pHpH條件下穩(wěn)定性不同的特性，通過改變條件下穩(wěn)定性不同的特性，通過改變pHpH使雜