第五章基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)變化與疾病的關(guān)系PPT課件

1、 第五章第五章基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)變化基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)變化與疾病的關(guān)系與疾病的關(guān)系 基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)異常與疾病基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)異常與疾病 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體各種生命現(xiàn)象和生命過(guò)程主要是通過(guò)蛋白質(zhì)的生理功能體現(xiàn)。 疾病的本質(zhì)是由各種原因引起蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的改變的導(dǎo)致的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的紊亂。 蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的改變從分子生物學(xué)角度講，又是基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的改變的結(jié)果，故基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)的改變是疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。3第一節(jié)第一節(jié) 不同基因通過(guò)不同機(jī)制導(dǎo)致疾病發(fā)生不同基因通過(guò)不同機(jī)制導(dǎo)致疾病發(fā)生 蛋白質(zhì)功能紊亂是疾病發(fā)生的基因病理機(jī)制，但蛋白質(zhì)功能紊亂是疾病發(fā)生的基因病理機(jī)制，但不同的基因通過(guò)不同機(jī)制引起

2、蛋白質(zhì)功能紊亂。不同的基因通過(guò)不同機(jī)制引起蛋白質(zhì)功能紊亂。 基因結(jié)構(gòu)改變基因結(jié)構(gòu)改變 環(huán)境因素影響了基因的表達(dá)環(huán)境因素影響了基因的表達(dá) 外源致病基因的進(jìn)入表達(dá)：產(chǎn)生了毒性蛋白；產(chǎn)外源致病基因的進(jìn)入表達(dá)：產(chǎn)生了毒性蛋白；產(chǎn) 生了合成非蛋白毒性物生了合成非蛋白毒性物 質(zhì)的酶。質(zhì)的酶。 一、一、基因結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或基因結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或量變化引起疾病量變化引起疾病 由于體內(nèi)外各種因素改變了某基因特定的由于體內(nèi)外各種因素改變了某基因特定的DNA序列堿基組成和排列順序，導(dǎo)致序列堿基組成和排列順序，導(dǎo)致DNA一一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變了基因結(jié)構(gòu)即級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變了基因結(jié)構(gòu)即基因突基因突變變

3、。其分子機(jī)制可以是替換、插入或缺失，。其分子機(jī)制可以是替換、插入或缺失，因而產(chǎn)生不同的突變類(lèi)型。因而產(chǎn)生不同的突變類(lèi)型。(一) 基因突變的多種類(lèi)型1.點(diǎn)突變點(diǎn)突變是單個(gè)堿基的改變：轉(zhuǎn)換和顛換2.缺失缺失是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的丟失3.插入插入是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加4.倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)基因突變還分為配子突變配子突變與體細(xì)胞突變體細(xì)胞突變動(dòng)態(tài)突變動(dòng)態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)序列（拷貝數(shù)）隨世代的傳遞而改變。基因突變基因突變的類(lèi)型的類(lèi)型1.1. 點(diǎn)突變點(diǎn)突變: :單個(gè)堿基的改變單個(gè)堿基的改變 在基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的某個(gè)位點(diǎn)上，一種堿基在基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的某個(gè)位點(diǎn)上，一種堿基被另一種堿基取代。被另一種堿基取

4、代。 分為：分為： 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 （transitiontransition） 顛換顛換 （transversiontransversion）基因突變的類(lèi)型2.2. 缺失（缺失（delelationdelelation）是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的丟失：在基因一級(jí)結(jié)構(gòu)中某個(gè)位點(diǎn)上，一個(gè)核苷酸或一段核苷酸序列丟失造成的基因結(jié)構(gòu)改變。 3. 插入（插入（insertioninsertion）基因突變的類(lèi)型4. 倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)：基因內(nèi)部的DNA序列重組，使一段DNA序列的方向倒轉(zhuǎn)。5. 配子突變配子突變與體細(xì)胞突變體細(xì)胞突變6. 動(dòng)態(tài)突變動(dòng)態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變（dynami

5、c mutation）(1)(1)基因突變引起遺傳密碼的改變：根據(jù)基因基因突變引起遺傳密碼的改變：根據(jù)基因突變產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)不同分為突變產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)不同分為(二) 不同的基因突變引起不同的遺傳效應(yīng)a. a. 同義突變 (consense mutation)b. 錯(cuò)義突變 (missense mutation)c. 無(wú)義突變 (nonsense mutation)d. 移碼突變（frame-shifting mutation） 同義突變(same sense mutation)：密碼子發(fā)生改變, 但所編碼的氨基酸不變。 例如：CUU CUC CUG 亮氨酸 錯(cuò)義突變錯(cuò)義突變（missense

6、mutation） 指DNA分子中堿基的取代，經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA后，相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，編碼另一種氨基酸，使蛋白質(zhì)中的氨基酸組成和排列順序發(fā)生改變。 由于堿基的取代、缺失或插入，使原來(lái)編碼某種氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子的基因突變叫無(wú)義突變無(wú)義突變 (nonsense mutation) 。亮氨酸的密碼子亮氨酸的密碼子UUA，中間的，中間的U變?yōu)樽優(yōu)锳這樣一個(gè)堿基變化這樣一個(gè)堿基變化就會(huì)成為（終止密碼子）就會(huì)成為（終止密碼子）UAA。酪氨酸的密碼子是UAC，置換突變使UAC變?yōu)槊艽a子UAG后翻譯便到此停止。無(wú)義突變無(wú)義突變： 指DNA鏈上插入或丟失1個(gè)、2個(gè)甚至多個(gè)堿基（但不是三聯(lián)體密碼

7、子及其倍數(shù)），在讀碼時(shí)，由于原來(lái)的密碼子移位，導(dǎo)致在插入或丟失堿基部位以后的編碼都發(fā)生了相應(yīng)改變。移碼突變?cè)斐傻碾逆溠娱L(zhǎng)或縮短，取決于移碼終止密碼子推后或提前出現(xiàn)。 移碼突變移碼突變(frame-shift mutation)(2) (2) 基因突變影響基因突變影響 hnRNA hnRNA 的剪接的剪接 基因突變發(fā)生在 hnRNA 的一級(jí)結(jié)構(gòu)上特定的剪接位點(diǎn)上，導(dǎo)致 hnRNA 的剪接錯(cuò)誤，產(chǎn)生異常的 mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，改變生物性狀。(三三) 結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病1. 血紅蛋白病 (hemoglobinopathy)： 血紅蛋

8、白(hemoglobin, Hb)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 珠蛋白(globin)基因的時(shí)、空特異性表達(dá) 血紅蛋白結(jié)構(gòu)血紅蛋白結(jié)構(gòu) 血紅蛋白是由血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個(gè)條肽鏈（兩個(gè)和兩個(gè)和兩個(gè)鏈）組成鏈）組成的。每條肽鏈都類(lèi)似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合的。每條肽鏈都類(lèi)似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合一個(gè)血紅素。一個(gè)血紅素。血紅蛋白的脫氧（血紅蛋白的脫氧（T）和氧合（）和氧合（R）構(gòu)象在氧）構(gòu)象在氧的親和性方面有很大區(qū)別。由于結(jié)構(gòu)上的相互的親和性方面有很大區(qū)別。由于結(jié)構(gòu)上的相互作用是與它的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以血紅作用是與它的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以血紅蛋白在結(jié)合氧的過(guò)程中顯示出別構(gòu)效應(yīng)和協(xié)同蛋白在結(jié)合氧的過(guò)程中

9、顯示出別構(gòu)效應(yīng)和協(xié)同性。性。 血紅蛋白分子一級(jí)結(jié)構(gòu)上的輕微差血紅蛋白分子一級(jí)結(jié)構(gòu)上的輕微差別就可能導(dǎo)致功能上的很大不同，別就可能導(dǎo)致功能上的很大不同，正常成年人血紅蛋白中的正常成年人血紅蛋白中的鏈的第鏈的第六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就會(huì)導(dǎo)致鐮刀形細(xì)胞貧血病的異常血會(huì)導(dǎo)致鐮刀形細(xì)胞貧血病的異常血紅蛋白紅蛋白HbS HbS 的生成。的生成。血紅蛋白病血紅蛋白病鐮刀形細(xì)胞貧血癥鐮刀形細(xì)胞貧血癥血紅蛋白病類(lèi)型血紅蛋白病類(lèi)型異常血紅蛋白異常血紅蛋白: : 珠蛋白結(jié)構(gòu)珠蛋白結(jié)構(gòu)( (質(zhì)質(zhì)) )變異，導(dǎo)致貧血。變異，導(dǎo)致貧血。 地中海貧血地中海貧血: : 珠蛋白合成珠蛋白合成

10、( (量量) )減少，又稱(chēng)珠蛋減少，又稱(chēng)珠蛋白合成障礙性貧血。白合成障礙性貧血。 20四、基因調(diào)控序列變異導(dǎo)致表達(dá)水平變化四、基因調(diào)控序列變異導(dǎo)致表達(dá)水平變化引起疾病引起疾病 通過(guò)對(duì)珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列研究，發(fā)現(xiàn)這些調(diào)控序列如發(fā)生基因突變，就會(huì)降低珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平， 珠蛋白合成減少，引起型地中海性貧血。 除了調(diào)控序列改變會(huì)影響相應(yīng)基因的表達(dá)外，基因內(nèi)的內(nèi)含子變異也會(huì)影響蛋白質(zhì)合成。二、細(xì)胞間信號(hào)異常導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病二、細(xì)胞間信號(hào)異常導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病 人體各細(xì)胞間通過(guò)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌人體各細(xì)胞間通過(guò)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號(hào)等保持細(xì)胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝。基信號(hào)

11、等保持細(xì)胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝。基因表達(dá)也受到細(xì)胞間信號(hào)的調(diào)控。通過(guò)細(xì)胞間信因表達(dá)也受到細(xì)胞間信號(hào)的調(diào)控。通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)傳遞，能保證基因表達(dá)的時(shí)間特異性和空間特號(hào)傳遞，能保證基因表達(dá)的時(shí)間特異性和空間特異性以及表達(dá)水平正常。異性以及表達(dá)水平正常。 AFP AFP 是胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的蛋白，具有免疫抑是胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的蛋白，具有免疫抑制作用，保護(hù)胎兒免受母體免疫攻擊。在接受異制作用，保護(hù)胎兒免受母體免疫攻擊。在接受異常的細(xì)胞增殖信號(hào)作用下，其基因表達(dá)，導(dǎo)致肝常的細(xì)胞增殖信號(hào)作用下，其基因表達(dá)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。成為肝癌發(fā)生的重要癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。成為肝癌發(fā)生的重要因素

12、。因素。三、細(xì)胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病三、細(xì)胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病 異常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起異常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病疾病 高血糖 DAG PKC ACE Ang 異常的異常的DNADNA甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病病 hCG5轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低甲基化低甲基化非滋養(yǎng)層細(xì)胞hCG 受體結(jié)合 cAMP信號(hào)途徑 調(diào)節(jié)其它生長(zhǎng)因子產(chǎn)生，促進(jìn)Tumor形成 刺激蛋白質(zhì)合成心肌肥大23 四、四、病原生物基因的體內(nèi)表達(dá)病原生物基因的體內(nèi)表達(dá)1、外原病原生物進(jìn)入人體內(nèi)，大量繁殖，生長(zhǎng)，引起機(jī)械或生物學(xué)損傷2、與人體爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，引起疾病3、產(chǎn)生生

13、物毒素作用人體，引起疾病4、外源基因的整合到人基因組上，引變了一些基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)。二、二、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略1通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定基因變異通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定基因變異 核糖核酸酶切分析、雜合雙鏈分析、核糖核酸酶切分析、雜合雙鏈分析、 化學(xué)切割錯(cuò)配、酶促切割錯(cuò)配化學(xué)切割錯(cuò)配、酶促切割錯(cuò)配3通過(guò)功能學(xué)研究確定致病基因通過(guò)功能學(xué)研究確定致病基因 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、 反義技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)反義技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)2基因表達(dá)水平分析基因表達(dá)水平分析 差異顯示、抑制消減雜交、基因表達(dá)系列分析差異顯示、抑制消減雜交、基因表達(dá)系列分析核糖核酸酶切分

14、析核糖核酸酶切分析基本原理基本原理: 在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中錯(cuò)配堿基可被核糖核酸酶RNase識(shí)別并切割，通過(guò)凝膠電泳分析酶切片段的大小，即可確定錯(cuò)配的位置。核糖核酸酶切分析（核糖核酸酶切分析（RNase cleavageRNase cleavage）缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤嘌呤時(shí)，核糖核酸核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；酶切割效率低甚至不切割； 分析分析DNADNA的一條鏈，突變檢出率為的一條鏈，突變檢出率為 30%30%；同時(shí)；同時(shí)分析分析DNADNA的兩條鏈，突變檢出率為的兩條鏈，突變檢出率為 70%70%； 需要制備特異性的需要

15、制備特異性的RNA探針雜合雙鏈分析法雜合雙鏈分析法 （heteroduplex analgsis, HA） 直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成單在其錯(cuò)配處會(huì)形成單鏈環(huán)形突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生鏈環(huán)形突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率不同的遷移率。 檢測(cè)缺失突變只適于檢測(cè)缺失突變只適于200-300bp長(zhǎng)度片段長(zhǎng)度片段,且不能確定位置且不能確定位置,檢出率只有檢出率只有80%.

16、化學(xué)切割錯(cuò)配法化學(xué)切割錯(cuò)配法 （Chemical cleavage of mismatch, CCM） 基本原理基本原理： 將待測(cè)含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯(cuò)配的C能被羥胺和哌啶切割，錯(cuò)配的T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。 化學(xué)切割錯(cuò)配法化學(xué)切割錯(cuò)配法特點(diǎn)特點(diǎn)： 突變檢出率高； 如使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)，靈敏度較高； 可檢測(cè)長(zhǎng)度達(dá) 2Kb的核酸片段； 步驟多、費(fèi)時(shí)、有毒； 如對(duì)正義鏈與反義鏈都進(jìn)行分析,檢測(cè)率達(dá)100%.酶促切割錯(cuò)配酶促切割錯(cuò)配 (enzyme mismatch cleavage ) 酶促切割錯(cuò)配是

17、一種與Rnase酶切分析相類(lèi)似的方法. 不同之處是該方法采用的酶是T4核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別12種錯(cuò)配的堿基,并在錯(cuò)配堿基附近進(jìn)行酶切.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)檢測(cè)DNA片段可用DNA探針雜交檢測(cè).最長(zhǎng)檢測(cè)長(zhǎng)度達(dá)到1.5Kb.缺點(diǎn)缺點(diǎn):可出現(xiàn)非特異性切割,對(duì)錯(cuò)配認(rèn)別也不是100%.RFLP-Restriction Fragment Length PolyhmorphismRFLPsMicrosatellite repeats35二、通過(guò)基因表達(dá)水平分析確定基因在疾病發(fā)生中作用 人類(lèi)疾病發(fā)生的另一個(gè)重要原因是基因表達(dá)水平的改變，因基因表達(dá)水平的改變涉及的往往不是單一基因，而是多基因，即一些基因表達(dá)增加，一些基因

18、表達(dá)降低，導(dǎo)致由其編碼蛋白組成的代謝及調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常，引發(fā)疾病。 因此通過(guò)基因水平找到正常與疾病狀態(tài)下的差異表達(dá)基因，確定其在疾病中作用。 方法：Northern雜交法，消減雜交技術(shù)、差異顯示法、定量RT-PCR、基因表達(dá)芯片等差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR) 在不同的生長(zhǎng)時(shí)期、在個(gè)體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對(duì)疾病的反應(yīng)以及不同的環(huán)境下調(diào)控基因的表達(dá)是不同的，這就是基因的差別表達(dá)（differential expression）。原理：利用兩組特殊的引物對(duì)差別表

19、達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。3 3端引物端引物：利用mRNA的poly A尾巴設(shè)計(jì)。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，poly A尾巴之前的兩個(gè)堿基只有12種可能的排列組合：根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計(jì)12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由1112個(gè)T及兩個(gè)其它的堿基組成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱(chēng)錨定引物。5端引物：5端為10個(gè)堿基（10-mer）組成的隨機(jī)引物。每一個(gè)隨機(jī)引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點(diǎn)也可能在mRNA的不同位點(diǎn)上。用一種3錨定引物和一種5隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得5010

20、0條100500bp的DNA擴(kuò)增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5隨機(jī)引物。 抑制性差減雜交抑制性差減雜交 ( (SSH) - Diatchenko L, SSH) - Diatchenko L, et al. et al. PNASPNAS 1996; 93:6025-60301996; 93:6025-6030 Suppression subtractive hybridization: Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially a m

21、ethod for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA regulated or tissue-specific cDNA probes and librariesprobes and libraries 抑制性差減雜交抑制性差減雜交 ( (suppressive subtractive hybridization, SSH)suppressive subtractive hybridization, SSH) 原理原理 SSH是差減雜交與是差減雜交與PCR結(jié)合的快速分離差異基結(jié)合的快速分離差異基因的方法。運(yùn)用

22、雜交動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的單鏈因的方法。運(yùn)用雜交動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的單鏈DNA退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，使使不同豐度的單鏈不同豐度的單鏈DNA得到均衡得到均衡；抑制；抑制PCR利用鏈內(nèi)利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn)，使非目的基因片段兩端反退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn)，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu), 無(wú)法作無(wú)法作為模板與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段為模板與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增，從而使的擴(kuò)增，從而使目的基因得到富集、分離。目的基因得到富集

23、、分離。n 方法方法 提取提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組mRNAmRNA合成雙鏈合成雙鏈cDNAcDNA，經(jīng)經(jīng)識(shí)別識(shí)別 4 4 堿基的限制性?xún)?nèi)切酶切割堿基的限制性?xún)?nèi)切酶切割 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組cDNAcDNA平均分為平均分為2 2份，分別連接份，分別連接2 2個(gè)接頭個(gè)接頭 進(jìn)行進(jìn)行2 2輪差減雜交和抑制性輪差減雜交和抑制性PCRPCR 獲得富集的目的基因獲得富集的目的基因 抑制性抑制性 差減雜交差減雜交 ( (SSH)SSH) 流程圖流程圖 檢測(cè)組檢測(cè)組 ( (Tester)Tester) 含目的基因含目的基因cDNAcDNA，加接頭，加接頭驅(qū)逐組驅(qū)逐組 ( (Driver)Driver) 不含目

24、的基因不含目的基因cDNAcDNA，不加接頭，不加接頭 * 接頭接頭含含PCR PCR 引物引物正向正向SSH:SSH: 易感者易感者( (Tester) +Tester) + 不易感者不易感者( (Driver)Driver) 易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因 反向反向SSH:SSH: 不易感者不易感者( (Tester) +Tester) + 易感者易感者( (Driver)Driver) 不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因 抑制性差減雜交抑制性差減雜交( (SSH)SSH) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 采用兩次差減雜交和采用兩次差減雜交和PCRPCR，保證了高特保

25、證了高特異性異性 ( (假陽(yáng)性率可降至假陽(yáng)性率可降至6 6); ); 在雜交過(guò)程中可在雜交過(guò)程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異表達(dá)使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異表達(dá)基因基因; ;操作相對(duì)簡(jiǎn)便，是目前分離新基因的主操作相對(duì)簡(jiǎn)便，是目前分離新基因的主要方法要方法 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 起始材料需要起始材料需要 g 級(jí)量級(jí)量mRNA; SSHSSH差減差減克隆片段較小，獲取克隆片段較小，獲取cDNAcDNA全長(zhǎng)序列有一定難度全長(zhǎng)序列有一定難度 抑制性差減雜交抑制性差減雜交( (SSH)SSH)Elkeles A,et al. Elkeles A,et al. Mol Cell BiolMol Ce

26、ll Biol 1999; 19: 2594-2600 1999; 19: 2594-2600 The c-The c-fosfos proto-oncogene is a target for transactivation by proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressorthe p53 tumor suppressor 采用采用SSHSSH法證實(shí)法證實(shí), , 在在p53p53介介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，c-c-fosfos是是p53p53轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄刺激的靶基因錄刺激的靶基因

27、, ,從而提供了這兩種重要調(diào)控蛋白相互作用的直接從而提供了這兩種重要調(diào)控蛋白相互作用的直接依據(jù)依據(jù)抑制性差減雜交抑制性差減雜交( (SSH)SSH)n Kostic C and Shaw PH. Kostic C and Shaw PH. OncogeneOncogene 2000; 19:3978-39872000; 19:3978-3987n Isolation and characterization of sixteen novel p53 Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genesrespons

28、e genesn 通過(guò)通過(guò)SSHSSH比較了比較了p53p53缺失和含缺失和含p53p53的結(jié)腸癌細(xì)胞株間基因差異表的結(jié)腸癌細(xì)胞株間基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)達(dá)，發(fā)現(xiàn)1616個(gè)個(gè)p53p53依賴(lài)的下游靶基因依賴(lài)的下游靶基因 抑制性差減雜交抑制性差減雜交( (SSH)SSH)基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 是一種用于定量、高通量基因表達(dá)分析的實(shí)是一種用于定量、高通量基因表達(dá)分析的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理原理: 分分離每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的特定位置的較短的單一的序列標(biāo)簽離每個(gè)轉(zhuǎn)

29、錄本的特定位置的較短的單一的序列標(biāo)簽（約（約9-14個(gè)堿基對(duì)），這些短的序列被連接、克隆個(gè)堿基對(duì)），這些短的序列被連接、克隆和測(cè)序，特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對(duì)應(yīng)和測(cè)序，特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)豐度?；虻谋磉_(dá)豐度。Serial analysis of gene expression (SAGE) 技術(shù)流程技術(shù)流程反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄酶切酶切連接連接測(cè)序測(cè)序單條測(cè)序?qū)螚l測(cè)序?qū)?040條條EST測(cè)序測(cè)序分析分析由于采樣量大大提高，可對(duì)低表達(dá)基因進(jìn)行分析：由于采樣量大大提高，可對(duì)低表達(dá)基因進(jìn)行分析：基因表達(dá)量分析、尋找新基因等等基因表達(dá)量分析、尋找新基因等等轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技

30、術(shù) 指在生物基因組中帶有插入或整合入指在生物基因組中帶有插入或整合入的外源基因，生物個(gè)體能將它一傳給的外源基因，生物個(gè)體能將它一傳給后代，并表達(dá)出該基因的生物活性物后代，并表達(dá)出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。Transgenic Animal Animal in which a segment of DNA has been physically inserted into the genome. The genome of all cells of the organism contains the DNA segment. The DNA

31、 segment is present in the germ line so it can be transmitted to progeny as a Mendelian trait.Retroviral Mediated Gene TransferMoMuLV Producing CellsMouseembryosInsertion of viral DNA containingtransgene into embryosTransgenic MouseX1-cell pronuclear stagemouse embryo.PMS + HCGto superovulate Pregna

32、nt Foster MotherOviduct Transfer+2-cell stage embryoHolding PipetteInjection Pipette基因敲除（基因敲除（Knock outKnock out）Step 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray fur. Step 2. Remove embryonic stem cells from gray-fur blastocyst. Grow stem cells in

33、 tissue culture. Step 3. Transfect stem cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and GCV.+ neomycin+ gancyclovirStep 4. Remove homologously recombined stem cells from petri dish and inject into a new blastocyst that would ha

34、ve only white fur.Step 5. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white fur mouse.Step 6. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst b

35、ut some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected.Step 7. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the

36、offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination. Step 8. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out. The

37、pure breeding mouse strain is a knockout mouse. knockout mouse核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用1. RNA分子，催化核糖體RNA中內(nèi)含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，還可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA鏈的復(fù)制等。2. 優(yōu)點(diǎn):其底物的堿基配對(duì)特異性。核酶與底物結(jié)合常形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)或“錘頭”結(jié)構(gòu)。3. 設(shè)計(jì)核酶特異性地結(jié)合于靶點(diǎn)，以其本身酶活性進(jìn)行剪切。What is RNAi ? RNA干擾（干擾（RNA interference，RNAi） 內(nèi)源性或外源性雙鏈內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)

38、胞內(nèi)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)CHS GeneCHS Gene矮牽?；ò珷颗；?Jorgensen, R, 1990)RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)（線(xiàn)蟲(chóng)（C. elegans)C. elegans)(Fire, 1998)+Par-1 Gene DisruptionExpressionDownDouble Strand RNA線(xiàn)線(xiàn) 蟲(chóng)，蟲(chóng)， 果果 蠅蠅微生物，微生物， 植植 物物 dsRNADicer cl

39、eavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表達(dá)的機(jī)理抑制基因表達(dá)的機(jī)理siRNA associatedWith RISC complexCell Membrane5POH3Target mRNARNA干擾干擾(RNA interference, RNAi) RNAi 是將一段雙鏈的RNA 序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中,機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因的表達(dá)將會(huì)受到抑制,甚至表達(dá)受到完全抑制基因誘導(dǎo)超表達(dá)技術(shù)確定基因在疾病中的作用 將目的基因全長(zhǎng)序列與高活性啟動(dòng)子或組織將目的基因全長(zhǎng)序列與高活性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子融合，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后，在誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子融合，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后，在誘導(dǎo)劑的作用下

40、或在特定的組織細(xì)胞中，目的劑的作用下或在特定的組織細(xì)胞中，目的基因超表達(dá)，相應(yīng)的基因表達(dá)產(chǎn)物大量積基因超表達(dá)，相應(yīng)的基因表達(dá)產(chǎn)物大量積累。比較加入誘導(dǎo)劑前后的表型變化，從累。比較加入誘導(dǎo)劑前后的表型變化，從而確定目的基因在疾病發(fā)生中的作用。而確定目的基因在疾病發(fā)生中的作用。三、三、疾病相關(guān)基因的功能克隆和定位克隆疾病相關(guān)基因的功能克隆和定位克隆1 1 疾病相關(guān)基因疾病相關(guān)基因2 2 功能克隆功能克隆3 3 定位克隆定位克隆疾病相關(guān)基因與疾病 單基因病 (一個(gè)基因位點(diǎn)上的缺陷) 多基因病 (涉及兩個(gè)以上的基因位點(diǎn)) 染色體病 (染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目的改變) 獲得性基因病 (遺傳易感性或病原微生物)功

41、能克隆(Functional cloning) 以獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)及功能信息為線(xiàn)索，以獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)及功能信息為線(xiàn)索，分離鑒定出相應(yīng)的基因，叫未知基因的分離鑒定出相應(yīng)的基因，叫未知基因的功能克隆。功能克隆。 基因克隆基因克?。╣ene cloning) 功能克隆功能克隆（ functional cloning） - 根據(jù)特異蛋白質(zhì)分離目的基因的策略根據(jù)特異蛋白質(zhì)分離目的基因的策略 表型克隆表型克?。?phenotype cloning ） - 根據(jù)特異根據(jù)特異mRNA 分離目的基因的策略分離目的基因的策略 功能克隆功能克隆 氨基酸序列核苷酸序列氨基酸序列核苷酸序列PCR特異蛋白質(zhì)特異蛋白質(zhì)

42、目的基因目的基因 抗體抗體 基因文庫(kù)篩選基因文庫(kù)篩選評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) - 在單基因性狀的基因分離方面仍為在單基因性狀的基因分離方面仍為常用常用策略策略缺點(diǎn)缺點(diǎn) - 特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難* - 難以分離微量表達(dá)基因難以分離微量表達(dá)基因 - 無(wú)法研究無(wú)無(wú)法研究無(wú)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因產(chǎn)物的基因 - 難以進(jìn)行多基因控制性狀的基因分離難以進(jìn)行多基因控制性狀的基因分離通過(guò)蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)分離鑒定未知基因通過(guò)蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)分離鑒定未知基因 基因轉(zhuǎn)錄后在核糖體上翻譯合成蛋白質(zhì)，基因轉(zhuǎn)錄后在核糖體上翻譯合成蛋白質(zhì)，形成核糖體形成核糖體-mRNA-蛋白質(zhì)產(chǎn)物

43、部分氨基酸蛋白質(zhì)產(chǎn)物部分氨基酸序列的復(fù)合體，運(yùn)用抗體與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的序列的復(fù)合體，運(yùn)用抗體與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫共沉淀反應(yīng)，可以分離此復(fù)合體，進(jìn)免疫共沉淀反應(yīng)，可以分離此復(fù)合體，進(jìn)而分離到而分離到mRNA，最終克隆到未知基因最終克隆到未知基因。智力智力發(fā)育不全、嚴(yán)重發(fā)育不全、嚴(yán)重的嘔吐，皮膚、的嘔吐，皮膚、毛發(fā)顏色變淺，毛發(fā)顏色變淺，虹膜顏色減退、虹膜顏色減退、尿、汗有特殊腐尿、汗有特殊腐臭。臭。 定位克隆定位克隆又稱(chēng)為又稱(chēng)為“逆向遺傳學(xué)逆向遺傳學(xué)”，始于始于2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代后期年代后期利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。

44、位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過(guò)連鎖分析找定位：通過(guò)連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置。的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w克?。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其基因，并進(jìn)一步研究其功能。功能。疾病遺傳標(biāo)記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能 定位克?。和ㄟ^(guò)遺傳標(biāo)記定位克?。和ㄟ^(guò)遺傳標(biāo)記 ，先獲得某一表型基因，先獲得某一表型基因在染色體上的定位在染色體上的定位 ，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進(jìn)行致病突變的篩選因，進(jìn)行致病突變的篩選 ，并獲得，并獲得cDN

45、A及全基及全基因。因?；舅悸坊舅悸肥峭ㄟ^(guò)連鎖分析原理進(jìn)行基因是通過(guò)連鎖分析原理進(jìn)行基因定位定位。若多態(tài)標(biāo)記與待定基因距離較遠(yuǎn)若多態(tài)標(biāo)記與待定基因距離較遠(yuǎn) ，則它們?cè)?，則它們?cè)谙蜃哟鷤鬟f時(shí)會(huì)發(fā)生自由分離向子代傳遞時(shí)會(huì)發(fā)生自由分離 ，呈，呈“連鎖平衡連鎖平衡”；反之；反之 ，則不發(fā)生自由分離，則不發(fā)生自由分離 ，而呈現(xiàn)，而呈現(xiàn)“共分離共分離”現(xiàn)象現(xiàn)象 ，即，即“連鎖不平衡連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定。據(jù)此可在染色體上定位與某一位與某一DNA標(biāo)記相連鎖的基因。標(biāo)記相連鎖的基因。1. 將基因定位將基因定位于染色體于染色體 特定區(qū)段特定區(qū)段2. 候選基因篩候選基因篩選鑒定選鑒定 定位克隆的主要步

46、驟之一是將目標(biāo)定位克隆的主要步驟之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上?；蚨ㄎ挥谔囟ㄈ旧w上。 主要方法：主要方法： 家系遺傳調(diào)查分析法、染色體斷裂點(diǎn)分析家系遺傳調(diào)查分析法、染色體斷裂點(diǎn)分析 （家系選擇、分離分析、連鎖分析家系選擇、分離分析、連鎖分析） 體細(xì)胞雜交法體細(xì)胞雜交法 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù) 突變分析技術(shù)突變分析技術(shù) 家系遺傳分析法 選擇一個(gè)含有40多個(gè)能提供信息的減數(shù)分裂事件的三代以上 的家系，要排除家系的異質(zhì)性； 除了對(duì)照基本遺傳表型的各種表現(xiàn)型的幾率外，還要考慮外顯不全；以數(shù)學(xué)計(jì)算機(jī)模型模擬分析； 選擇一定的遺傳標(biāo)記，進(jìn)行基因分型，確定疾病基因在染色體上的位置。基因連鎖分析基因

47、連鎖分析 連鎖分析主要是應(yīng)用限制酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（連鎖分析主要是應(yīng)用限制酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ RFLP ）為）為遺傳標(biāo)志進(jìn)行家系分析遺傳標(biāo)志進(jìn)行家系分析 在人類(lèi)基因組中，平均約在人類(lèi)基因組中，平均約 200 bp可發(fā)生一對(duì)變異可發(fā)生一對(duì)變異 （稱(chēng)為（稱(chēng)為中心突變中心突變 ） 中心突變?cè)斐闪诵蛄猩系亩鄳B(tài)性，不少序列多態(tài)性發(fā)生在限中心突變?cè)斐闪诵蛄猩系亩鄳B(tài)性，不少序列多態(tài)性發(fā)生在限制酶識(shí)別位點(diǎn)上，產(chǎn)生了限制酶酶切位點(diǎn)的多態(tài)性制酶識(shí)別位點(diǎn)上，產(chǎn)生了限制酶酶切位點(diǎn)的多態(tài)性 用該限制酶水解用該限制酶水解 DNA就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段，稱(chēng)就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段，稱(chēng)RFLP。定位候選克隆定位候選克隆該方法是定

48、位克隆的進(jìn)該方法是定位克隆的進(jìn)一步發(fā)展一步發(fā)展將疾病相關(guān)基因定位于將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域染色體相關(guān)區(qū)域該染色體區(qū)域得到若干該染色體區(qū)域得到若干候選基因候選基因進(jìn)一步分析得到目的進(jìn)一步分析得到目的cDNAcDNA蛋白質(zhì)功能研究蛋白質(zhì)功能研究疾病染色體定位若干候選基因確定目的基因蛋白質(zhì)功能 cDNAcDNA篩選篩選染色體定位只是定位克隆的其染色體定位只是定位克隆的其中一步。由于中一步。由于DNADNA篩選、確認(rèn)的困難篩選、確認(rèn)的困難 ，是定，是定位克隆策略的位克隆策略的“瓶頸瓶頸”。目前獲得基因序列的方法大致有目前獲得基因序列的方法大致有: :(1)(1)對(duì)對(duì) 500kb 500kb

49、的關(guān)鍵部位進(jìn)行直接測(cè)序；的關(guān)鍵部位進(jìn)行直接測(cè)序；(2)(2)比較基因組作圖和測(cè)序；比較基因組作圖和測(cè)序； (3)(3)基因結(jié)構(gòu)特征分析；基因結(jié)構(gòu)特征分析； (4)cDNA(4)cDNA捕獲，主要有捕獲，主要有pGpG島捕捉層析法、島捕捉層析法、 外顯子捕捉法、直接篩選外顯子捕捉法、直接篩選PCRPCR法等方法法等方法cDNAcDNA篩選篩選 直接法：用基因組直接法：用基因組DNADNA直接從直接從cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)中篩選位于該基因組片段內(nèi)的中篩選位于該基因組片段內(nèi)的cDNAcDNA。 選擇法：將基因組選擇法：將基因組DNADNA固定在膜上，與固定在膜上，與總總cDNAcDNA或或cDNA

50、cDNA文庫(kù)的文庫(kù)的PCRPCR產(chǎn)物雜交，找產(chǎn)物雜交，找到能雜交到膜上的到能雜交到膜上的cDNAcDNA片段，再用片段，再用PCRPCR擴(kuò)增這些擴(kuò)增這些cDNAcDNA片段。片段。通過(guò)通過(guò)EST拼接拼接 如：已知小鼠某基因在人當(dāng)中有高度同源序列如：已知小鼠某基因在人當(dāng)中有高度同源序列 用該小鼠用該小鼠cDNAcDNA比對(duì)人的比對(duì)人的ESTEST數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 得到一簇得到一簇ESTEST后，將相鄰的后，將相鄰的ESTEST通過(guò)相互重疊部通過(guò)相互重疊部分進(jìn)行拼接。分進(jìn)行拼接。 得到人對(duì)應(yīng)的完整得到人對(duì)應(yīng)的完整cDNAcDNA的序列后，兩端設(shè)計(jì)引的序列后，兩端設(shè)計(jì)引物在物在cDNAcDNA文庫(kù)中進(jìn)行

51、文庫(kù)中進(jìn)行PCRPCR，得到該，得到該cDNAcDNA的克隆。的克隆。 至此，與小鼠對(duì)應(yīng)的人的該基因得以克隆出來(lái)。至此，與小鼠對(duì)應(yīng)的人的該基因得以克隆出來(lái)?；蛐酒夹g(shù)的應(yīng)用基因芯片技術(shù)的應(yīng)用 使用傳統(tǒng)方法尋找新基因，不僅需要投使用傳統(tǒng)方法尋找新基因，不僅需要投入大量的資金，而且針對(duì)性不強(qiáng)，效率入大量的資金，而且針對(duì)性不強(qiáng)，效率低下，大部分工作繁瑣重復(fù)低下，大部分工作繁瑣重復(fù)。 通過(guò)基因芯片分析正常組織和疾病組織通過(guò)基因芯片分析正常組織和疾病組織基因表達(dá)情況的差異，往往能夠從那些基因表達(dá)情況的差異，往往能夠從那些表達(dá)異常的基因中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。表達(dá)異常的基因中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。四、四、HGP

52、與疾病相關(guān)基因的研究與疾病相關(guān)基因的研究隨著人類(lèi)基因組草圖測(cè)定的完成，隨著人類(lèi)基因組草圖測(cè)定的完成，宣告了宣告了“ 后基因組時(shí)代后基因組時(shí)代 ”的到來(lái)。功能的到來(lái)。功能基因組學(xué)成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)基因組學(xué)成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到了空前的關(guān)注，也為疾病相的研究受到了空前的關(guān)注，也為疾病相關(guān)基因的克隆創(chuàng)造了條件。關(guān)基因的克隆創(chuàng)造了條件。同一種細(xì)胞或組織，處于不同的狀同一種細(xì)胞或組織，處于不同的狀態(tài)（生理與病理等），發(fā)育的不同階段，態(tài)（生理與病理等），發(fā)育的不同階段，受到外界的不同影響時(shí)，都可能使細(xì)胞受到外界的不同影響時(shí)，都可能使細(xì)胞中蛋白質(zhì)的情況產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而中蛋白質(zhì)的情況

53、產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)注產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)注和研究的就是這些變化。和研究的就是這些變化。研究蛋白質(zhì)與疾病相互關(guān)系的方法研究蛋白質(zhì)與疾病相互關(guān)系的方法 ELISAELISA 免疫印跡免疫印跡 免疫沉淀免疫沉淀 蛋白質(zhì)親和層析蛋白質(zhì)親和層析 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳建 庫(kù)篩選核糖體展示 (ribosome display) 核心是利用體外核糖體表達(dá)載體構(gòu)建 sc Fv抗體庫(kù) ,并于體外轉(zhuǎn)錄為 m RNA, 體外翻譯表達(dá) , 隨后以固相化的抗原分子親和篩選出核糖體 -m RNA-sc Fv復(fù)合物中的高親和力 sc Fv。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中不用任何細(xì)胞 ,是第一個(gè)

54、完全在體外篩選有功能蛋白的方法。 特點(diǎn) 不需轉(zhuǎn)化細(xì)菌或真核細(xì)胞不需轉(zhuǎn)化細(xì)菌或真核細(xì)胞 避免了宿主隨細(xì)胞基因組復(fù)制過(guò)程中可能丟失而產(chǎn)生的避免了宿主隨細(xì)胞基因組復(fù)制過(guò)程中可能丟失而產(chǎn)生的庫(kù)庫(kù) 容下降容下降 , 亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細(xì)胞生亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細(xì)胞生存而導(dǎo)致抗體丟失這一難題。存而導(dǎo)致抗體丟失這一難題。 由于核糖體展示技術(shù)的體外翻譯、體外篩選的特點(diǎn)由于核糖體展示技術(shù)的體外翻譯、體外篩選的特點(diǎn) , 大大大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期縮短了實(shí)驗(yàn)周期 , 具有省時(shí)省力、方便快速的特點(diǎn)。具有省時(shí)省力、方便快速的特點(diǎn)。雙向凝膠電泳技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù) 雙向凝膠電泳技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)(

55、2DE)(2DE)：又稱(chēng)二維電泳，其：又稱(chēng)二維電泳，其原理是在相互垂直的兩個(gè)方向上，分別基于蛋原理是在相互垂直的兩個(gè)方向上，分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)和分子量，運(yùn)用等電聚焦白質(zhì)不同的等電點(diǎn)和分子量，運(yùn)用等電聚焦(isoelectric focusing(isoelectric focusing，IEF)IEF)和十二烷基硫和十二烷基硫酸鈉酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)，把復(fù)，把復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中的蛋白在二維平面上分離雜的蛋白質(zhì)混合物中的蛋白在二維平面上分離展開(kāi)。完整的雙向凝膠電泳分析，包括樣品制展開(kāi)。完整的雙向凝膠電泳分析，包括樣品制備、等電

56、聚焦、平衡轉(zhuǎn)移、備、等電聚焦、平衡轉(zhuǎn)移、SDSSDSPAGEPAGE、斑點(diǎn)、斑點(diǎn)染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟。染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟。雙向凝膠電泳技術(shù)的應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)的應(yīng)用 用于分離細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)粗提物用于分離細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)粗提物 構(gòu)建特定組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)構(gòu)建特定組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)“二維參考圖譜二維參考圖譜”； 分析特定時(shí)間與病理、生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)情分析特定時(shí)間與病理、生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異比較。況，進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異比較。 已構(gòu)建特定組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)已構(gòu)建特定組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)2DE2DE圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù) 不同生物、不同器官、組織、細(xì)胞的

57、專(zhuān)一性不同生物、不同器官、組織、細(xì)胞的專(zhuān)一性2DE2DE數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)，為實(shí)現(xiàn)對(duì)已知蛋白質(zhì)的分析鑒定、未知蛋白的庫(kù)，為實(shí)現(xiàn)對(duì)已知蛋白質(zhì)的分析鑒定、未知蛋白的發(fā)現(xiàn)、總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的規(guī)律以及實(shí)發(fā)現(xiàn)、總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的規(guī)律以及實(shí)現(xiàn)模擬與預(yù)測(cè)等奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)模擬與預(yù)測(cè)等奠定了基礎(chǔ)。1 1疾病的蛋白質(zhì)組研究疾病的蛋白質(zhì)組研究 （1 1）腫瘤蛋白質(zhì)組研究）腫瘤蛋白質(zhì)組研究 （2 2）心血管疾病蛋白質(zhì)組研究）心血管疾病蛋白質(zhì)組研究 （3 3）神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究）神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究 2 2病原微生物的蛋白質(zhì)組研究病原微生物的蛋白質(zhì)組研究 3 3蛋白質(zhì)組藥物開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)組藥物開(kāi)發(fā) 生物信息學(xué)主要研究

58、領(lǐng)域生物信息學(xué)主要研究領(lǐng)域 建立和管理各種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)建立和管理各種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù) 基因組序列信息的提取和分析基因組序列信息的提取和分析序列比對(duì)（序列比對(duì)（Alignment）和結(jié)構(gòu)比對(duì)）和結(jié)構(gòu)比對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)編碼基因的計(jì)算機(jī)輔助識(shí)別蛋白質(zhì)編碼基因的計(jì)算機(jī)輔助識(shí)別非編碼區(qū)分析和非編碼區(qū)分析和DNA語(yǔ)言研究語(yǔ)言研究 分子進(jìn)化和比較基因組學(xué)分子進(jìn)化和比較基因組學(xué) 、遺傳密碼的起源、遺傳密碼的起源 序列重疊群（序列重疊群（Contigs）的裝配）的裝配 生物大分子結(jié)構(gòu)模擬及其與疾病、藥物設(shè)計(jì)生物大分子結(jié)構(gòu)模擬及其與疾病、藥物設(shè)計(jì) DNA DNA芯片和微陣列的發(fā)展芯片和微陣列的發(fā)展建立和管理各種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)建立和管理各種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù) 各種生物數(shù)據(jù)庫(kù)的建立是一切生物信息學(xué)工作的基礎(chǔ)。各種生物數(shù)據(jù)庫(kù)的建立是一切生物信息學(xué)工作的基礎(chǔ)。 數(shù)據(jù)庫(kù)是生物信息學(xué)的主要內(nèi)容，各種數(shù)據(jù)庫(kù)幾乎覆蓋了生命科數(shù)據(jù)庫(kù)是生物信息學(xué)的主要內(nèi)容，各種數(shù)據(jù)庫(kù)幾乎覆蓋了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如EBI的的SRS(Sequence Retrieval S