銅綠假單胞菌CMCC10104中青霉素結(jié)合蛋白-3的克隆表達(dá)和純化

1、由于抗生素可用于治療各種感染性疾病，有的人就將抗生素作為萬能藥，不管得了什么病，都用抗生素治療。要知道，濫用抗生素，可引起許多不良的后果。因此強調(diào)合理使用抗生素，重視抗生素的毒副作用是很有必要的。那么，該如何合理使用抗生素呢？ （1）病毒性疾病不宜用抗生素治療。上呼吸道感染以及咽痛、咽峽炎，大部分是病毒感染所致，因此這類疾病無需抗生素而應(yīng)使用病毒靈、病毒脞等抗病毒藥物以及中草藥治療。 （2）應(yīng)根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗結(jié)果選用抗生素。但如果受條件限制或病情危急，亦可根據(jù)感染部位和經(jīng)驗選用，然而可靠性較差。一般情況下，呼吸道感染以革蘭氏陽性球菌為多見。尿道和膽道感染以革蘭氏陰性菌為多見。皮膚傷口感染

2、以金黃色葡萄球菌為多見。 （3）抗生素可以治病，同時也會產(chǎn)生副作用，沒有一個抗生素是絕對安全而無副作用的。如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等可損害第八對腦神經(jīng)而造成耳聾。青霉素可發(fā)生過敏性休克，還會引起皮疹和藥物熱。應(yīng)用廣譜抗生素如四環(huán)素等會使體內(nèi)耐藥細(xì)菌大量生長繁殖，而引起新的更嚴(yán)重的感染，因此使用抗生素應(yīng)有的放矢，不可濫用。 （4）新生兒、老年人和肝腎功能不全的人應(yīng)避免或慎用主要經(jīng)肝臟代謝和腎臟排泄的毒性較大的抗生素。 （5）預(yù)防性應(yīng)用抗生素要嚴(yán)加控制，盡量避免在皮膚、粘膜等局部使用抗生素，因其易導(dǎo)致過敏反應(yīng)，也易引起耐藥菌株的產(chǎn)生。銅綠假單胞菌CMCC10104中青霉素結(jié)合蛋白-3的克隆表達(dá)

3、和純化引言：銅綠假單胞菌是一種能夠感染植物、動物和人類的革蘭氏陰性細(xì)菌，醫(yī)院中的病人因他們的肺部、血液、尿液、皮膚、和軟組織被銅綠假單胞菌感染而發(fā)病甚至死亡。銅綠假單胞菌也是一種重要的水生病原菌，廣泛分布在各種各樣的水體中，并且對消毒劑、干燥、紫外輻射等其他的物理化學(xué)因子具有很強的抗性，因此可以造成急性腸胃炎、腦膜炎、敗血癥和急性皮膚病。由于銅綠假單胞菌耐藥性的出現(xiàn)，因此迫切需要去選擇一些抗菌策略來控制它們的感染。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對于細(xì)菌的生存是非常的重要，青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）是一些膜結(jié)合酶，它們主要參與到細(xì)菌細(xì)胞壁合成的后期階段。它們在70年前就已經(jīng)被開發(fā)利用，被認(rèn)為是B-內(nèi)酰胺類抗生素的目

4、標(biāo)結(jié)合物。銅綠假單胞菌PAO1的基因組編碼的四種高分子量的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）,包括一級A酶(PBP1a)和三級B酶(PBP2, PBP3, and PBP3a),它們與大腸桿菌中對應(yīng)的酶是直系同源的。同時，銅綠假單胞菌的青霉素結(jié)合蛋白（PBP3）與大腸桿菌的對應(yīng)蛋白具有42%序列一致性。銅綠假單胞菌的青霉素結(jié)合蛋白（PBP3）是有兩個部分組成的蛋白，它包括：一個C-端的轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合到一個延伸的N-端領(lǐng)域。總的來說，PBP3與其他種類的青霉素結(jié)合蛋白是相似的，雖然它缺乏PBP2X結(jié)構(gòu)所特有的C-端附屬結(jié)構(gòu)，但是它和其他種類的PBPS一樣，都具有a-螺旋亞基或頭部結(jié)構(gòu)朝向PBP3的N-端，這

5、在PBP2結(jié)構(gòu)中是沒有的。種類B的青霉素結(jié)合蛋白的N-端區(qū)域的功能目前還不清楚，但是很有可能使轉(zhuǎn)肽酶的結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離細(xì)胞內(nèi)膜。在銅綠假單胞菌中PBP3是一個藥物作用靶點，并且已經(jīng)證明了是大部分B-內(nèi)酰胺類抗生素的重要的藥物作用靶點，B-內(nèi)酰胺類藥物通常是用于治療假單胞菌屬的感染。包括頭孢菌素類似物、頭孢霉素、頭孢他啶、哌拉西林、和注射用藥物的抗生素、多利培南。然而，在最近幾年，青霉素結(jié)合蛋白的改變使得銅綠假單胞菌對B-內(nèi)酰胺類的抗生素具有耐藥性。使用高劑量的哌拉西林來處理臨床的分離菌，表明了這與抗生素結(jié)合到PBPs上的減少有關(guān)。實驗菌株缺乏B-內(nèi)酰胺酶，在銅綠假單胞菌中PBP3的過量表達(dá)導(dǎo)致了它們對

6、頭孢霉素的敏感性降低。因此，進一步研究PBP3的基因和結(jié)構(gòu)是很有必要很有意義。銅綠假單胞菌CMCC 10104是一種典型的培養(yǎng)菌株，在中國廣泛使用。然而，它的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究沒有報道過。在本研究中，根據(jù)銅綠假單胞菌PAO1的基因組信息將編碼PBP3的基因從銅綠假單胞菌CMCC 10104中克隆出來，克隆出來的基因和GenBank數(shù)據(jù)庫中報道過的其他PBP3基因序列進行對比，不同之處是實驗的條件優(yōu)化了蛋白的表達(dá)。帶有Ni2+NTA 瓊脂糖的固定化金屬親和色譜層析(IMAC)法用于純化重組蛋白PBP3，純化的PBP3蛋白的活性通過青霉素結(jié)合實驗來測定。材料和方法細(xì)菌、質(zhì)粒、酶、試劑和培養(yǎng)基

7、：菌株P(guān). aeruginosa CMCC 10104是從中國的菌種保藏中心獲得，大腸桿菌DH5a 用于載體的轉(zhuǎn)化，E. coli BL21 (DE3)用作蛋白表達(dá)的宿主菌，質(zhì)粒pMD19-T和pET44b分別用于T-A克隆和蛋白質(zhì)的表達(dá)。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和Taq DNA聚合酶都是購于Takara (Japan).分子生物試劑盒和IMAC等儀器試劑都是來源于BIO-RAD (USA).其他的分析試劑都是購于上海生工試劑公司。大腸桿菌通常培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基（10 mg/mL tryptone, 5 mg/mL yeast extract, 10 mg/mLNaCl）中，37、振蕩

8、培養(yǎng)，當(dāng)菌株中轉(zhuǎn)入了pMD19-T或pET44b (+)時，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入100 ug/mL氨芐青霉素。為了使克隆基因過量表達(dá)，將菌株在2倍的YT培養(yǎng)基（16 mg/mL tryptone, 10 mg/mL yeast extract ，5 mg/mL NaCl.）中培養(yǎng)。PBP3基因的克?。篜. aeruginosa CMCC 10104的染色體DNA 從過夜培養(yǎng)的菌液中得到，并用于編碼PBP3基因的PCR擴增的模板，根據(jù)P. aeruginosa PAO1的 ftsI 基因來設(shè)計引物，引物如下：5> CGcatatgGACCTGCACGTGATCGACCA<30(sense

9、 primer, containing Nde I digestion site) , 5> TActcgagGCCACGCCCTCCTTTTGCG <3 (anti-sense primer,containing Xho I digestion site). ftsI 基因的平末端省略了編碼疏水前導(dǎo)肽的基因，用這個引物進行擴增，起始的變性溫度為94，5min，PCR反應(yīng)是由Taq DNA聚合酶完成的，每次循環(huán)的條件如下：變性：94，30s 退火：63，30s延伸：72 ，1.5min 。最終的延伸過程：72 ，10min，循環(huán)30次。擴增的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行純化并插入

10、到pMD19-T載體中，獲得的重組載體pMD19-T-PBP3轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a中，并加以測序確定核苷酸同源性。正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-PBP3被Nde I and XhoI酶切，PBP3基因片段被提取出來并且正確地連接到質(zhì)粒pET44b (+)DNA上。這個重組質(zhì)粒被命名為pET44b-PBP3，然后轉(zhuǎn)入到E. coli BL21 (DE3).中。各自的結(jié)構(gòu)從轉(zhuǎn)化子中分離出來，并且通過限制性核酸內(nèi)切酶Nde I 和 Xho I的酶切后將正確大小的插入片段篩選出來。他們再一次被測序確認(rèn)核苷酸同源性。最終的結(jié)構(gòu)將PBP3基因結(jié)合到帶有組氨酸標(biāo)記的質(zhì)粒上。重組PBP3

11、(rPBP3)的表達(dá)：具有pET44b-PBP3重組載體的E. coli BL21 (DE3)的單個菌落接種在含有5ml LB培養(yǎng)液、100 ug/mL氨芐青霉素的15ml的離心管中培養(yǎng)。種子培養(yǎng)液接種在搖瓶中，在37、200 rpm條件下過夜培養(yǎng)。這些細(xì)胞再接種到含有100ml的2 _ YT培養(yǎng)基、100 ug/mL氨芐青霉素的500ml的搖瓶中培養(yǎng)。在37下震蕩培養(yǎng)4h,濃度為2mM異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)3h后，通過8000 rpm的轉(zhuǎn)速進行離心收集細(xì)胞，并且通過SDSPAGE進行分析。去改善蛋白的表達(dá)，通過改變發(fā)酵的溫度、誘導(dǎo)時間、誘

12、導(dǎo)物的濃度等不同的條件來試驗。改變的條件如下：溫度為37或者25，誘導(dǎo)時間分別為1 h, 2 h, 3 h, 4 h 、 5 h ，誘導(dǎo)物的濃度為0.5 mM 到 4 mM.通過SDSPAGE來分析蛋白表達(dá)的水平。大規(guī)模蛋白的生產(chǎn)： 大規(guī)模重組蛋白的生產(chǎn)過程是：首先將單菌落接種到含有100 lg/mL氨芐青霉素的25ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將種子液接種到搖瓶中37、200 rpm下過夜培養(yǎng)。最后將過夜培養(yǎng)的種子液接種到2.5L的發(fā)酵罐（含有1.0L的2 _ YT培養(yǎng)基、100 lg/mL氨芐青霉素）中培養(yǎng)。培養(yǎng)到菌液的OD600 nm =0.6 。添加2 mM IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞菌體

13、進一步在37下培養(yǎng)3h 。通過離心收集菌體細(xì)胞(8000 rpm, 4 _C, 15 min),并且儲存在-20條件下。重組蛋白的純化：將結(jié)凍的細(xì)胞進行解凍，取8g的菌體細(xì)胞用200 mL裂解緩沖液(20 mM磷酸鹽緩沖液，Ph7.0)重懸，用超聲破碎法將細(xì)胞破碎。裂解液在12,000 rpm、4條件下離心10min。將上清液儲存在4中，并通過0.45 um濾膜進行過濾純化。Bio-Rad NGC蛋白純化系統(tǒng)和Bio-ScaleMini Profinity IMAC(固定化金屬親和色譜) 用于重組蛋白rPBP3.的純化。整個純化的過程流速設(shè)定為2 mL/min。首先，用2體積的水和5體積的裂解

14、緩沖液沖洗填充柱，然后將3035ml的過濾上清液裝株，接著用5體積的裂解緩沖液（含有520mM咪唑去除受污染的蛋白）洗脫，最后，用洗脫緩沖液(20 mM 磷酸鹽緩沖液, pH 7.0, 0.5 M NaCl and 0.25 M 咪唑).將rPBP3從柱上洗脫下來。大的碎片通過SDSPAGE來分析，包含了高濃度的rPBP3的碎片被合并，并且用50體積的20mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)進行反向透析，4、6h。為了脫鹽，這個透析步驟需要重復(fù)兩次。接下來進行離心（12,000 rpm 、 10 min 、 4）將聚合物去除。通過濃縮器將這些蛋白質(zhì)進行濃縮并用于分析。(SDSPAGE)十二烷基硫

15、酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳：分子量大小、表達(dá)水平、重組蛋白的濃度由SDSPAGE進行分析確定。在每個凝集凹槽中添加10ul的樣品，電泳結(jié)束后，用考馬氏亮藍(lán)R-250對膠體進行染色，然后用混合液（醋酸：甲醇：水=10:25:65, v/v/v）進行沖洗。蛋白質(zhì)濃度的測定：Bradford方法用于測定蛋白質(zhì)濃度，在595nm的波長處讀取吸光值，牛血清蛋白被用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。Western-blot分析：Western 免疫印跡法分析和先前所描述的基本一致，以1:1000的稀釋比例的抗組氨酸單克隆抗體作為第一抗體，以1:2000的稀釋比例的抗-兔的免疫球蛋白G和辣根過氧化氫酶結(jié)合到抗體上作為第二抗體。

16、DAB被用作檢測試劑。青霉素結(jié)合的活性：通過SDSPAGE來分析純化了的rPBP3，從而檢測青霉素結(jié)合的活性，35，15ul純蛋白樣品和5ul的BOCILLIN一起孵育2h，SDSPAGE樣品緩沖液被添加到蛋白質(zhì)樣品中，并在電泳之前煮沸10min，不含蛋白質(zhì)的樣品或用青霉素標(biāo)記了的樣品作為空白對照。rPBP3-BOCILLIN混合物的測定是通過膠體在UV290nm 的波長來完成的。結(jié)果：PBP3基因的克隆和分析P. aeruginosa CMCC 10104的染色體DNA被用著編碼PBP3蛋白基因的PCR擴增的模板，根據(jù)P. aeruginosa PAO1 的ftsI基因來設(shè)計克隆的引物，ft

17、sI基因的平末端被擴增，這個平末端省去了編碼疏水前導(dǎo)肽的序列。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，結(jié)果如圖1(lanes 13)所示。擴增產(chǎn)物的長度為1500 bp 2000 bp,這與PBP3的理論長度(1635 bp).相一致。擴增的片段被提取并連接到pMD19-T載體上，這個重組載體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a，并通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切確定，并加以測序。用Nde I 、Xho I 雙酶切得到的兩個片段包含了PBP3 (1635 bp)和pMD19-T simple (2692 bp, lane 4 of Fig. 1).基因測序結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明了插入的序列是正

18、確的，克隆DNA的核酸序列和P. aeruginosa PAO1的ftsI基因序列相似度達(dá)到了99.76%這里有四個不同的堿基（66 C-A, 1020 T-C, 1233 T-C, 1527 T-C）。然而，至于氨基酸的序列，和他們是沒有差別的。正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-PBP3被Nde I、 Xho I 酶切.PBP3片段被修復(fù)并插入到pET44b (+)質(zhì)粒DNA上，這個重組質(zhì)粒被命名為pET44b-PBP3 (Fig. 3)并轉(zhuǎn)入到E. coli BL21 (DE3).單個的結(jié)構(gòu)被分離和驗證，用Nde I 和 Xho I雙酶切后產(chǎn)生了兩個片段，他們分別是PBP3 (1635 bp)

19、 、pET44b (+) fragment (5495 bp, lanes 57 of Fig. 1).DNA測序的結(jié)果也表明插入片段的基因序列和預(yù)期的結(jié)果是一致的，重組表達(dá)的載體被構(gòu)建后，經(jīng)過實驗證明是正確的，這也為表達(dá)重組蛋白做好了準(zhǔn)備。重組蛋白PBP3的表達(dá)具有pET44b-PBP3 重組載體的單菌落被用于重組蛋白PBP3的生產(chǎn)，克隆基因的過量表達(dá)，種子培養(yǎng)液在2 *YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)物誘導(dǎo)之后，離心收集菌體，通過SDSPAGE進行分析，分析結(jié)果如圖4，PBP3蛋白的理論分子量為60kDa，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了一個新的蛋白，分子量大約也為60 kDa。這個結(jié)果表重組PB

20、P3蛋白成功表達(dá)。為了提高蛋白的表達(dá)，通過改變不同的條件來進行實驗，如：改變發(fā)酵溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)物IPTG的濃度。最終我們得到最優(yōu)的表達(dá)條件是：37 _C for 3 h by 2 mM IPTG.蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)將優(yōu)化的表達(dá)條件應(yīng)用于大規(guī)模的蛋白生產(chǎn)，在優(yōu)化的條件下，細(xì)胞的濕重產(chǎn)量是8 ± 0.5 g/L。rPBP3主要以溶解狀態(tài)存在于細(xì)胞裂解液的上清液中(see lane 5 of Fig. 5).，同時，少部分的rPBP3存在于球形碎片中，因而不能被額外的超聲處理而去除，(see lanes 3and 4 of Fig. 5),這表明是由包涵體導(dǎo)致的，而不是沒有充分的裂解

21、。企圖使用不同的洗滌劑去增加重組蛋白PBP3的可溶性。(e.g., Tween 20 and Triton X-100)，但是都沒有成功，降低大腸桿菌的培養(yǎng)溫度也沒有增加可溶性蛋白的量。rPBP3的純化細(xì)胞裂解液的上清液部分被用于重組蛋白的純化，然而，在4時可溶性rPBP3的部分上清液趨于沉淀，這些沉淀的蛋白在純化之前必須通過離心或者經(jīng)過注射器過濾器而去除，將過濾后的上清液進行裝柱，再用含有520 mM咪唑的裂解緩沖液沖洗將污染的蛋白進行去除，用洗脫緩沖液把rPBP3從柱子上洗脫下來，再用SDSPAGE分析，將含有高純度的rPBP3的液體進行收集并合并在一起。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明獲得的高純

22、度的蛋白純度達(dá)到了95%，分子量大約為60 kDa.蛋白的測定在4時，用20mM 磷酸緩沖液對純化的rPBP3進行反向透析，達(dá)到脫鹽的目的，接著離心（12,000 rpm for 10 min）去除聚合物。用磷酸緩沖液透析結(jié)果使rPBP3沉淀，通過離心和濃縮，將蛋白質(zhì)濃縮，Bradford 方法來測定蛋白質(zhì)，純化的結(jié)果如表1所示。最終純化得到的rPBP3是48 mg/L (6 mg/g wet weight cells).重組蛋白rPBP3的鑒定Western-blot用于蛋白質(zhì)的進一步的鑒定分析，兔的抗組氨酸單克隆抗體和羊的抗兔的免疫球蛋白G分別被用作第一和第二抗體，通過DAB的測定，一個新

23、的蛋白條帶大約為60 kDa（如圖5 ）青霉素結(jié)合活性 純化的rPBP3用于青霉素結(jié)合活性的測定，結(jié)果如圖5所示。純化的rPBP3能夠結(jié)合到BOCILLIN FL,用熒光標(biāo)記的青霉素。這個發(fā)現(xiàn)表明了獲得rPBP3是由功能的，通過C-端組氨酸標(biāo)記的存在表明了它并沒有阻礙它結(jié)合青霉素的能力。討論P. aeruginosa是一種典型的銅綠假單胞菌屬，是人類和動物的主要條件致病菌之一，細(xì)菌學(xué)的研究分析結(jié)果表明在不同的醫(yī)院都有假單胞菌屬，主要是銅綠假單胞菌，從醫(yī)院里感染革蘭氏陰性細(xì)菌的病人的血液、唾液以及其他的臨床資料中度可以分離到這些細(xì)菌，銅綠假單胞菌的存在還與病人的囊胞性纖維癥并發(fā)癥有聯(lián)系的，或者是外科、創(chuàng)傷、灼燒等有關(guān)，銅綠假單胞菌被認(rèn)為是第二大最頻繁的病原體在外科手術(shù)中，在醫(yī)學(xué)界是第三。因此，迫切需要去發(fā)現(xiàn)一些方法去控制它的感染。P. aeruginosa CMCC 10104是典型的菌株，在中國廣泛使用，然而，對于它的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)還沒有研究過。在本研究中，根據(jù)P. ae