多糖檢測方法3頁

1、多糖的檢測方法關(guān)于多糖含量測定，業(yè)內(nèi)有兩種評價(jià)方法。一種是狹義上嚴(yán)格的多糖測定，即水提取多糖后，以凝膠色譜柱分離、洗脫提純粗多糖得到較單一分子量的多糖，再水解成各種單糖，以HPLC法分離測定各單糖，即可得到比較嚴(yán)格意義上的多糖含量及其組成。這種方法是科研級的多糖測定。另一種評價(jià)方法一般是生產(chǎn)企業(yè)用于質(zhì)控的多糖測定：一般過程是水提醇沉粗多糖后，以葡萄糖作為相比較的物質(zhì)，加入特定顯色劑后比色測定粗多糖的含量。注意，這種方法測得的是以葡萄糖作為折算的多糖含量。但這種評價(jià)方法簡單實(shí)用，能反映一定的質(zhì)量指標(biāo)，作為質(zhì)控之用可以的了。包括中國藥典和一些國標(biāo)、行標(biāo)都采用此方法評價(jià)多糖含量，方法大同小異，如硫酸

2、-苯酚法，硫酸-蒽酮法。但根據(jù)不少實(shí)際檢驗(yàn)人的反映，要想檢測結(jié)果有很好的重現(xiàn)性，還是有很多細(xì)節(jié)問題要注意的。粗多糖測定多糖的測定方法，目前有堿性酒石酸銅滴定法、比色法（蒽酮比色法、硫酸-苯酚法）。一般說來，比色法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，樣品用量少；但缺點(diǎn)是一般做常規(guī)檢測時(shí)使用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，誤差較大，應(yīng)以被測物的純品作對照品，以求出換算因子，但要制備被測物的純品并非每個(gè)實(shí)驗(yàn)室所能做到的，而且保健食品中往往是多種中草藥的提取物作為原料而制成，所含多糖是不同相對分子量多糖的混合體，這就給提取純品增加了難度。所以當(dāng)成品中多糖含量大于1%（質(zhì)量濃度）時(shí)，最好選用堿性酒石酸銅滴定。 滴定法1.樣品預(yù)

3、處理取本品適量，精密稱定，置于250ml磨口燒瓶中，精密加水50ml，稱定重量，置沸水浴回流2小時(shí)，放置至室溫，用水補(bǔ)足減失重量，混勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液15ml于100ml離心管中，加無水乙醇75ml，混勻，以4000r/min離心10min，并小心棄去上清液,再加15ml熱水(溫度90)沖洗離心管中沉淀物,重復(fù)一次后再以4000r/min離心30min，棄去上清液，沉淀用乙醇液（水：乙醇=15：75）洗滌兩次，離心，棄去洗滌液。2.樣品水解將離心管中醇析物用50ml熱水（溫度90)少量多次轉(zhuǎn)移至250ml磨口三角瓶中，加入15ml濃鹽酸，開啟冷凝管，在沸水浴中回流2h，冷卻，先用40的氫

4、氧化鈉（約15ml）粗調(diào)Ph值，后用稀的氫氧化鈉溶液細(xì)調(diào)，再置于PH計(jì)上調(diào)整pH在6.87.2之間。將中和的酸解液移置至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻,過濾，濾液供滴定用。3.堿性酒石酸鉀鈉銅溶液標(biāo)定3.1精密吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各5ml于150ml的錐形瓶中，加10ml蒸餾水及2粒玻璃珠，用滴定管加入9.0ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于錐形瓶中。3.2將錐形瓶置電爐上迅速加熱，務(wù)必在2分鐘內(nèi)至沸，并保持溶液在微沸狀態(tài)下再用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積。同法平行操作三份，取其平均值（V1）。3.3樣品溶液預(yù)測和測定。3.3.

5、1 樣品溶液的預(yù)測精密吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各5ml于150ml的錐形瓶中，精密加入10ml蒸餾水及2粒玻璃珠，控制在2分鐘內(nèi)加熱至沸，保持溶液在微沸狀態(tài)下以先快后慢的速度，從滴定管中滴加樣品水解液液進(jìn)行滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積。3.3.2樣品溶液的測定精密吸取堿性酒石酸銅甲液與乙液各5.0ml，置于150ml錐形瓶中，精密加入蒸餾水10ml及玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預(yù)測體積少1ml的樣品水解液，將錐形瓶置電爐上迅速加熱，務(wù)必在2分鐘內(nèi)至沸，并保持溶液在微沸狀態(tài)下再用樣品水解液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體

6、積。同法平行操作三份，得出平均消耗體積（V2）。最后計(jì)算結(jié)果乘以0.9，此為葡萄糖換算成粗多糖的細(xì)數(shù)。硫酸-苯酚比色法1、方法提要食品中相對分子質(zhì)量>1×104的高分子物質(zhì)在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用堿性二價(jià)銅試劑選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖，用苯酚-硫酸反應(yīng)以碳水化合物形式比色測定其含量，其顯色強(qiáng)度與粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此計(jì)算食品中粗多糖含量。方法原理：粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定樣品在粗多糖含量。2、主要儀器（1）分光光度計(jì)；（2）離心機(jī)（300

7、0r/min）；（3）旋轉(zhuǎn)混勻器。3、試劑本方法所用試劑除特殊注明外，均為分析純；所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。（1）乙醇溶液（80%）：20mL水中加入無水乙醇80mL，混勻。（2）氫氧化鈉溶液（100g/L）：稱取100g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L，加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。（3）銅試劑儲備液：稱取3.0gCuSO45H2O，30.0g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至1L，混勻，備用。（4）銅試劑溶液：取銅試劑儲備液50mL，加水50mL，混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5g并使其溶解。臨用新配。（5）洗滌劑：取水50mL，加入10mL銅試劑溶液、10mL氫氧化鈉溶液，混勻。（6）硫

8、酸溶液（10%）：取100mL濃硫酸加入到800mL左右水中，混勻，冷卻后稀釋至1L。（7）苯酚溶液（50g/L）：稱取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀釋至100mL，混勻。溶液置冰箱中可保存1個(gè)月。（8）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取相對分子質(zhì)量5×105已干燥至恒重的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.0mg葡聚糖。（9）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖0.10mg。4、測定步驟（1）樣品處理：a、沉淀粗多糖：準(zhǔn)確吸取液體樣品5.0

9、mL，置于50mL離心管中，加入無水乙醇20mL，混勻5min后，以3000r/min離心5min，棄去上清液，反復(fù)操作34次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?.0mL，混勻后，供沉淀葡聚糖。b、沉淀葡聚糖：準(zhǔn)確吸取b項(xiàng)終溶液2mL置于20mL離心管中，加入100g/L氫氧化鈉溶液2.0mL銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)?0%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸溶液2.0mL溶液并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測定液。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0

10、.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相當(dāng)于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分別置于25mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計(jì)在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣品測定液2.0mL置于25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.

11、0mL于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在485nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡聚糖含量，計(jì)算樣品中粗多糖含量。同時(shí)做樣品空白實(shí)驗(yàn)。5、結(jié)果計(jì)算X= (m1-m2)×V1×V3×V5/m3×V2×V4×V6式中X 樣品中粗多糖含量（以葡聚糖計(jì)）（mg/g）； m1樣品測定液中葡聚糖的質(zhì)量（mg）；m2 樣品空白液中葡聚糖質(zhì)量（mg）； m3樣品質(zhì)量（g）；V1 樣品提取液總體積（mL）； V2沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；V3 粗多糖溶液體積（mL

12、）； V4沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積（mL）；V5 樣品測定液總體積（mL）； V6測定用樣品測定溶液體積（mL）。6、準(zhǔn)確度與精密度在不同食品中進(jìn)行不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為87.8% 110.87%，不同實(shí)驗(yàn)室對同一樣品進(jìn)行10次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8%。中藥總多糖含量測定（苯酚-硫酸比色法）供試品溶液的制備：提取上清液：精密稱取樣品細(xì)粉2.2g（約相當(dāng)于多糖0.22g），置燒瓶中，加水100ml置電爐上加熱回流提取1.5h，放冷至室溫，30004000rpm離心10min，收集上清液，用少量水分次洗滌燒瓶及離心管，同樣離心收集上清液。提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸發(fā)皿中

13、，置電爐上小心加熱（避免焦化）濃縮到約15ml，放冷至室溫，加乙醇100ml，攪勻，放置使其沉淀15分鐘。轉(zhuǎn)移此溶液連同沉淀于離心管中，繼續(xù)用少量80%乙醇以玻棒充分刮洗蒸發(fā)皿，洗液和沉淀同樣轉(zhuǎn)移至離心管中，以30004000rpm速度離心15min，棄去上清液，在離心管中加入少量80%乙醇，輕輕洗滌，同樣離心棄去上清液（保留沉淀物）。然后將離心管（連同沉淀物）于50烘箱揮干乙醇（不能見到任何液體），然后加熱水溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，繼續(xù)用熱水以玻棒充分刮洗離心管，洗液同樣轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，放冷至室溫，用水定容至刻度，搖勻，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，搖勻即得供試品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱取105干燥至恒重的無水葡萄糖適量，加水配制成0.85mg/ml的貯備液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分別置于50ml量瓶中加水定容至刻度，搖勻得葡萄糖稀釋液。再分別精密量取上述各稀釋液2 ml置具塞試管中，同時(shí)精密量取水2.0 ml置另一具塞試管中，各管分別加5%苯酚溶液（新制）1 ml，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0ml，立即搖勻，于40水浴中保溫30min，取出，置冰水浴中5 min。以上述2.0ml水所制得的空白溶液做參比，于489nm波長處測定各溶液吸收度，以葡萄糖稀釋液的濃度（g/ml）為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)