i第九章 維生素類藥物

1、The analysis of vitamins Chapter 9 維生素類藥物的分析維生素類藥物的分析 第九章The analysis of vitamin AThe analysis of vitamin EThe analysis of thiamine (B1)The analysis of L-ascorbic acid(C)The structures of other vitamins 基本要求基本要求 掌握維生素A的結(jié)構(gòu)，主要化學(xué)性質(zhì)、鑒別反應(yīng)及含量測(cè)定中的紫外分光光度法 了解三氯化銻比色法 掌握維生素E的結(jié)構(gòu)、主要化學(xué)性質(zhì)、鑒別反應(yīng)及含量測(cè)定中的氣相色譜法 了解其他含量測(cè)定

2、的方法 掌握維生素B1結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)及含量測(cè)定方法中的非水滴定法 了解其他含量測(cè)定方法 掌握維生素C結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)及含量測(cè)定中的碘量法 了解其他含量測(cè)定方法 了解HPLC在復(fù)方維生素測(cè)定中的應(yīng)用 Fundamental requirementMastering the structures, the main chemical properties, identification tests and the application of UV spectroscopy in assays of vitamin A.Understanding the colorimetric met

3、hod of antimonic chloride. Mastering the structure, the main chemical properties, identification tests and the application of GC in assays of vitamin E.Understanding other assays of vitamin E.Mastering the structure, properties, identification tests and the non-aqueous titration of thiamine.Understa

4、nding other assays of thiamine.Mastering the structure, properties, identification tests and the iodometric titration of L-ascorbic acid.Understanding other assays of L-ascorbic acid. Understanding the application of HPLC in compound vitamins analysis.The analysis of vitamin AStructure and propertie

5、s Structure The physical and chemical propertiesIdentification testsAssays Ultraviolet absorption method (three-point geometric correction method ) colorimetric method of antimonic chlorideSection1v StructuresCH3CH3CH3CH3CH2ORCH3 Retinol and its esters 共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯Crystal form REmpirical formulaMolecu

6、lar weightMelting pointH（Retinol） COCH3(Retinyl acetate) COC15H31(Retinyl Palmitate) C20H30O C22H32O2 C36H60O2 286.44 328.48 524.84 Pale yellow prisms Amorphism or crystal 6264 5758 2829 1.Ultraviolet absorption 維生素A分子中具有共軛多烯醇側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，在325328nm有強(qiáng)烈最大吸收。 2.Easily oxidation 維生素A 中有多個(gè)不飽和鍵，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被氧化，易被紫外光裂解

7、，特別在加熱和金屬離子存在時(shí)，更易氧化變質(zhì)，生成無(wú)生物活性的環(huán)氧化物維生素A醛及維生素A酸。 3.Color reaction with antimonic chloride 維生素A在氯仿中能與三氯化銻試劑作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色 4.Solubility 維生素A能與氯仿、乙醚、環(huán)己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶 v Identification tests1.Carr-Price reaction (三氯化銻反應(yīng)） 維生素A在飽和無(wú)水三氯化銻的無(wú)醇氯仿溶液中，即顯藍(lán)色，漸變成紫紅色。 Mechanism of reaction：.CH2OCORSbCl5CH3CH3CH3CH

8、2CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH2CH3 SbCl5 RCOO -2.Ultraviolet absorption spectrum 維生素A分子中含有5個(gè)共軛雙鍵，其無(wú)水乙醇溶液在波長(zhǎng)326nm處有最大吸收峰。當(dāng)在鹽酸催化下加熱，則發(fā)生去水反應(yīng)生成脫水維生素A，比維生素A多一個(gè)共軛雙鍵，故其最大吸收峰往長(zhǎng)波方向移動(dòng)，同時(shí)在350nm390nm波長(zhǎng)之間出現(xiàn)3個(gè)最大吸收峰。 維生素A和去水維生素A的紫外 吸收光譜1.維生素A2.去水維生素A3.Thin-layer chromatographyBP(1998)鑒別濃縮合成品維生素鑒別濃縮合成品維生素A（油劑）的油劑）的各種酯類的方法各種

9、酯類的方法: 以硅膠G為吸附劑，環(huán)己烷-乙醚（80：20）為流動(dòng)相，以供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的環(huán)己烷溶液點(diǎn)樣，以三氯化銻顯色，比較供試品溶液和對(duì)照品溶液所顯藍(lán)色斑點(diǎn)的位置，即可鑒別。 USP(24)采用的方法采用的方法: 以硅膠為吸附劑，環(huán)己烷-乙醚（80：20）為流動(dòng)相，維生素A的氯仿溶液點(diǎn)樣，以磷鉬酸為顯色劑。 v Assays Ultraviolet absorption method (three-point geometric correction method ) 紫外分光光度法（三點(diǎn)校正法） Colorimetric method of antimonic chloride 三氯化銻比色

10、法 Ultraviolet absorption methodPrinciple This method is based on measurement of absorption of a solution of retinol in isopropanol at 325nm, where absorbance is maximum. The method is applicable to pharmaceutical preparations and vitamin A concentrates in which vitamin A content is relatively high a

11、nd amounts of substances causing irrelevant absorption are relatively small and can be corrected for by taking additional readings at 310nm and 334nm. Care must be exercised in using the correction since it does not apply for some preparations. If tocopherol is present (absorption maximum, 298nm), a

12、 correction is made employing a hydrogenation technique to destroy absorption due to retinol. Solutions with appreciable carotenoids are purified by chromatography, but carotenoids are generally not a problem in samples to which this method is applied. 目前各國(guó)藥典均采用紫外分光光度法（三點(diǎn)校正法）測(cè)定維生素A的含量。維生素A在325 328nm

13、波長(zhǎng)之間具有最大吸收峰，可用以含量測(cè)定，其最大吸收峰的位置隨溶劑不同而異。 維生素A醋酸酯 維生素A醇溶劑 max,nm E1%1cm 換算因數(shù) max,nm E1%1cm 換算因數(shù)環(huán)己烷 327.5 1530 1900 326.5 1755 1900異丙醇 325 1600 1830 325 1820 1830 本法的測(cè)定結(jié)果較能正確的反映出維生素A的真實(shí)生物效價(jià)。 由于維生素A制劑中含有稀釋用油和維生素A原料中混有其他雜質(zhì)，所以，測(cè)得的吸收度不是維生素A所獨(dú)有。為了消出誤差，應(yīng)用校正公式進(jìn)行校正。 Method 如供試品中干擾測(cè)定的雜質(zhì)較少，可以直接用溶劑溶解供試品后測(cè)定。否則應(yīng)照皂化法測(cè)

14、定含量。 原原 理：理： 雜質(zhì)的吸收在310340nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸收度變小。 The absorption of impurities is linear between 310nm and 340nm. The absorbance decreases while the wavelength increases. 物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。 The absorption has additivity. 三點(diǎn)波長(zhǎng)的選擇法三點(diǎn)波長(zhǎng)的選擇法 Three wavelengths selection 第1點(diǎn)：選擇維生素A的最大吸收波長(zhǎng)（即1） 第2點(diǎn)和第3點(diǎn)：在最大吸收波長(zhǎng)

15、的兩側(cè)各選一點(diǎn)（2和3） 等波長(zhǎng)差法：在1的左右各選一點(diǎn)為2和3，使3-11-2。中國(guó)藥典（2000年版）測(cè)定維生素A醋酸酯時(shí)，規(guī)定1328nm, 2316nm, 3340nm。 等吸收度法：在1的左右各選一點(diǎn)為2和3，使A2=A3=6/7A1。中國(guó)藥典（2000年版）測(cè)定維生素A醇時(shí)，規(guī)定1325nm, 2310nm, 3334nm。 The absorption of impurities 對(duì)維生素對(duì)維生素A的測(cè)定有影響的雜質(zhì)：的測(cè)定有影響的雜質(zhì)： 維生素A2和維生素A3(dehydroretinol and anhydroretinol)：維生素A2在345350nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收。

16、維生素A的氧化產(chǎn)物：環(huán)氧化物、維生素A醛和維生素A酸。 維生素A在光照下產(chǎn)生的無(wú)生物活性的聚合物鯨醇。 維生素A的的異構(gòu)體。 合成時(shí)產(chǎn)生的中間體。 這些雜質(zhì)在310340nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收，因此，在測(cè)定維生素A的含量時(shí)，必須考慮這些雜質(zhì)的干擾。三點(diǎn)校正法可以消除這些雜質(zhì)的影響。 測(cè)定法測(cè)定法 第一法（適用于維生素第一法（適用于維生素A醋酸酯）醋酸酯） 方法 計(jì)算法 關(guān)于換算因數(shù) A值的選擇法 第二法（適用于維生素第二法（適用于維生素A醇）醇） 測(cè)定方法 計(jì)算法 A值的選用法 Method取維生素A醋酸酯，精密稱定，加環(huán)己烷制成每1ml中含有915單位的溶液。在300、316、328、340、

17、360nm五個(gè)波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收值，確定最大吸收波長(zhǎng)（應(yīng)為328nm）。計(jì)算各波長(zhǎng)下的吸收度與328nm波長(zhǎng)下的吸收度的比值。 第一法 但式中的A值有兩種可能，一是直接采用328nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸收度值，即A328；另一種可能是采用吸收度校正公式計(jì)算出的校正值，即A328（校正）。 求效價(jià)（求效價(jià)（IU/g） 效價(jià)系指每克供試品中所含維生素A的國(guó)際單位數(shù)（IU/g）。 IU/g= E1%1cm1900,式中1900為維生素A醋酸酯在環(huán)己烷溶液中的換算因數(shù)。 E1%1cm= ACL 求求E1%1cm ：用A=E1%1cmCL公式求得 （式一）Calculation第一法求維生素A醋酸酯膠丸為標(biāo)示

18、量的百分含量： 標(biāo)示量%= AD1900W W100L標(biāo)示量 100% A為直接測(cè)得的A328或校正后的A328 D為供試品的稀釋倍數(shù)；1900為換算因數(shù)； W為膠丸的平均內(nèi)容物重量；W為稱取的內(nèi)容物重量；L為比色池厚度（cm）； 第一法 Conversion factor 換算因數(shù)的定義為每1個(gè)E1%1cm數(shù)值所相當(dāng)?shù)男r(jià)。即： 換算因數(shù)= 效價(jià)（IU/g） E1%1cm（max） 維生素A的含量是用生物效價(jià)國(guó)際單位（IU/g）表示。維生素A的國(guó)際單位規(guī)定如下： 1IU=0.344g維生素A醋酸酯 1IU=0.300g維生素A醇 因此，1g維生素A醋酸酯相當(dāng)于的國(guó)際單位數(shù)為： 1106g 0

19、.344g/ IU =2 907 000 IU 1g維生素醇相當(dāng)?shù)膰?guó)際單位數(shù)為： 1106g 0.300g/ IU =3 330 000 IU 第一法 The selection of A將五個(gè)波長(zhǎng)處吸收度比值（即Ai/A328）分別與中國(guó)藥典（2000年版）規(guī)定的吸收度比值相減，即得到五個(gè)差值。判斷每個(gè)差值是否超過(guò)規(guī)定的0.02。 波長(zhǎng)(nm) 測(cè)得吸收度 吸收度比值 兩個(gè)比值的差值 藥典規(guī)定值 計(jì)算值 （規(guī)定0.02） 300 A0 0.555 A0/A2 316 A1 0.907 A1/A2 328 A2 1.000 A2/A2 340 A3 0.811 A3/A2 360 A4 0.2

20、99 A4/A2 第一法 如果最大吸收波長(zhǎng)在326329nm之間，并計(jì)算得到的五個(gè)波長(zhǎng)下的差值，均不超過(guò)0.02時(shí)，則不用校正公式計(jì)算吸收度，而直接用在328nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸收度A328代入 （式一）求出E1%1cm。 如果最大吸收波長(zhǎng)在326329nm之間，但計(jì)算得到的波長(zhǎng)下的差值，有一個(gè)或幾個(gè)超過(guò)0.02，這時(shí)，應(yīng)按下面的方法判斷： 若A328（校正）A328 A328100%所得的數(shù)值在3%，則仍不用校正公式計(jì)算吸收度，而直接用A328代入 公式中求出E1%1cm； 判斷法判斷法第一法若A328（校正）A328 A328100% 所得的數(shù)值在15%3%之間，則需用校正公式算吸收度，即用

21、A328（校正）代入公式中求出E1%1cm；若A328（校正）A328 100%所得的數(shù)值小于15%或大于3%，則不能用本法測(cè)定，而采用后面的第2法（皂化法）測(cè)定含量。 A328第一法 如果最大吸收波長(zhǎng)不在326329nm之間，則不能用本法，而應(yīng)采用后面的第2法（皂化法）測(cè)定含量。用第2法測(cè)定 用A328（校正）計(jì)算 用A328計(jì)算 用第2法計(jì)算 第一校正法的公式為 ： A328（校正）=3.52（2 A328A316A340） 第一法0.0215%3%3% 用紫外分光光度法（三點(diǎn)校正法）測(cè)定維生素A醋酸酯膠丸含量時(shí)：取內(nèi)容物39.1mg，加環(huán)己烷溶解并稀釋至100ml，在下列波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度

22、為：300nm：0.390；316nm：0.607；328nm：0.671；340nm：0.550；360nm：0.224。已知膠丸內(nèi)容物平均重量為0.08736g、膠丸標(biāo)示量為3000IU/丸。試求：標(biāo)示量%=？ 第一法Exercises Method精密稱取一定量供試品，加氫氧化鉀乙醇溶液后煮沸回流，得到皂化液。經(jīng)乙醚提取、洗滌、濾過(guò)、濃縮和干燥等處理，最后用異丙醇溶解殘?jiān)⑾♂尦擅?ml中含維生素A為915單位的溶液。在300、310、325、334nm四個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，并確定最大吸收波長(zhǎng)（應(yīng)為325nm）。 第二法 公式中的A值，可能是325nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸收度A325，也可能是

23、用校正公式計(jì)算出的吸收度校正值A(chǔ)325（校正）。E1%1cm= ACL 求求E1%1cm ：用A=E1%1cmCL公式求得 （式一） 求效價(jià)（求效價(jià)（IU/g） 求維生素求維生素A醇膠丸的標(biāo)示量百分含量：醇膠丸的標(biāo)示量百分含量： IU/g= E1%1cm1820標(biāo)示量%= AD1820W W100L標(biāo)示量 100% 第二法Calculation The selection of A 如果最大吸收波長(zhǎng)在323327nm之間，而且A300/A325的比值小于或等于0.73，按下法判斷： 1.若A325（校正）A325 A325100%所得的數(shù)值在3%，則仍不用校正公式計(jì)算吸收度，而直接用A325代

24、入 （式一）中求出E1%1cm； 2.若所得的數(shù)值超過(guò)3%，則需用校正公式計(jì)算吸收度，即用A325（校正）代入式中求E1%1cm。3.如果最大吸收波長(zhǎng)不在323327nm之間或A300/A325的 比值，大于0.73時(shí)，表示供試品中雜質(zhì)含量過(guò)高，應(yīng)采用色譜法將未皂化部分純化后再進(jìn)行測(cè)定。第二法校正公式：A325（校正）=6.815 A3252.555 A3104.260 A334 第二法 Explanation 維生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)出來(lái)的；維生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或6/7定位法）推導(dǎo)出來(lái)的。 在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)在最

25、大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸峰的兩側(cè)上升或下降陡部的波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。儀器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度，會(huì)影響測(cè)定，故在測(cè)定前務(wù)必要校正波長(zhǎng)。 中國(guó)藥典收載的維生素A膠丸、維生素AD滴劑、維生素AD膠丸等均采用本法測(cè)定含量。 第二法Colorimetric method The assay is based on the measurement of the unstable blue color resulting from reaction of vitamin A and antimony chloride in non-aqueous chloroform. Within certain li

26、mits, absorbance at 620nm is a function of vitamin A concentration. Principle Some critical points of the method are: freedom from moisture (with SbCl3 reagent); subdued light conditions; and removal of carotenoids in the final extract before colorimetry, or correction for them. 原理原理：維生素A與三氯化銻的無(wú)水氯仿溶

27、液作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色，在618620nm波長(zhǎng)處有最大吸收，符合Beer定律。 1.顏色穩(wěn)定性: 產(chǎn)生的藍(lán)色不穩(wěn)定，要求操作迅速，一般規(guī)定加入三氯化銻后應(yīng)在510s內(nèi)測(cè)定 。 2.無(wú)水: 反應(yīng)介質(zhì)需無(wú)水，否則使三氯化銻水解產(chǎn)生SbOCl而使溶液混濁，影響比色。 3.溫度: 溫度對(duì)呈色影響很大，樣品測(cè)定時(shí)的溫度與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)溫度相差應(yīng)在1以內(nèi)。 4. 專屬性: 本反應(yīng)并非維生素A專屬，在相同條件下，某些有關(guān)物質(zhì)均與三氯化銻顯藍(lán)色，干擾測(cè)定，使結(jié)果偏高。 三氯化銻試劑有強(qiáng)的腐蝕性，易損壞皮膚和儀器。 Precaution The analysis of vitamin EThe structu

28、re and properties The structure The physical and chemical propertiesThe identification testsTest for free tocopherol Assays Gas chromatography Ceriumetric titration HPLC Section 2 v Structure It has , and four isomers. The physiologicalaction of -isomer is the strongest of all. 苯并二氫吡喃醇衍生物OCOCH3CH3CH

29、3CH3CH3CH3CH3CH3CH3Ov Properties Solubility 維生素E為微黃色或黃色透明的粘稠液體，易溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中, 不溶于水 . Ultraviolet absorption 本品結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上有酚羥基，故有紫外吸收，其無(wú)水乙醇液在284 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，其吸收系數(shù)為41.045.0. Oxidation 在無(wú)氧或其他氧化劑存在時(shí)，在酸性或堿性溶液中，加熱可水解生成游離生育酚；在有氧或其他氧化劑存在時(shí)，則進(jìn)一步氧化成醌型化合物。在堿性條件下加熱，這種氧化作用更易發(fā)生。 v Identification testsNitric acid reac

30、tion Redox after hydrolyzing reaction Ultraviolet spectroscopyThin-layer chromatography Nitric acid reaction 本品約30mg 加無(wú)水乙醇10ml 溶 解 加硝酸2ml 溶 液（橙紅色 ）加熱15min 75 Drugs30mg non-aqueous ethanol 10ml Dissolving nitric acid 2ml Solution （salmon ）Heating 15min 75 水解后氧化反應(yīng)水解后氧化反應(yīng) 本品約10mg 醇制KOH試液2ml 煮沸5min 放冷 加

31、水4ml 乙醚10ml 振搖靜置 溶液分層 （取乙醚液2ml） 加2，2-聯(lián)吡啶 乙醇溶液 三氯化鐵 乙醇溶液 溶 液(血紅色) Redox after hydrolyzing reaction Drugs about10mg Potassium hydroxide solution 2ml Boiling 5min Cooling Adding water 4ml ether 10ml Shaking and standing ether solution Adding 2，2-dipyridine Ethanol solution Ferric chloride Ethanol solut

32、ion Solution (sanguine) Prepared by ethanol Ultraviolet spectrum 本品的0.01%無(wú)水乙醇液在波長(zhǎng)284nm處有最大吸收；在波長(zhǎng)254nm處有最小吸收，可資鑒別。 Thin-layer chromatography 將供試品點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙醚（4：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)1015cm后，取出，于空氣中晾干，噴以濃硫酸，在105加熱5min，-生育酚、-生育酚醋酸酯、-生育醌的Rf值分別為0.5、0.7和0.9。 v Impurities: free tocopherol 利用游離生育酚的還原性，用硫酸鈰滴定液（0.01m

33、ol/L）滴定，以二苯胺為指示劑。中國(guó)藥典維生素E其中所含的游離生育酚不得超過(guò)2.15%BP(1998)規(guī)定不得超過(guò)1.0%。 Tocopherol is titrated by cerium sulfate .The indicator is diphenylamine .In Chp,vitamin E contains not more than 2.15 percent of free tocopherol ,v Assays Gas chromatographyCeriumetric titration High-performance liquid chromatography D

34、etermination of vitamin A and vitamin E in human serum by RP-HPLC Gas chromatographyConditions and system suitability Carrier gas: nitrogen. Stationary phase: silicone (OV-17) .Support : diatomaceous earth, which is washed by acid and then silanized. Column temperature: 265. Detector : flame ionizat

35、ion detector. Column efficiency above 500 (vitamine E). Resolution: between the peaks of vitamine E and the internal standard substance is more than 2. 校正因子測(cè)定校正因子測(cè)定 取正三十二烷適量，加正己烷溶解并稀釋成每1ml中含1.0mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取維生素E對(duì)照品約20mg，精密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10ml。密塞，振搖使溶解，取13l注入氣相色譜儀，計(jì)算校正因子 。測(cè)定方法測(cè)定方法 取本品約20mg，精

36、密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10ml，密塞，振搖使溶解；取13l注入氣相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。 Calculation 校正因子（f）= As/ms Ar/mrAs內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰高或峰面積Ar對(duì)照品的峰高或峰面積 ms 加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量,mg mr加入對(duì)照品的量,mg 含量（mx）= f Ax As /ms Ax供試品峰高或峰面積As 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)得峰高或峰面積mx供試品的量，mgms、 f 意義同上 Ceriumetric titration (ChP77) 由于硫酸鈰溶于酸性水而不溶于醇，游離生育酚溶于醇而不溶于水，因此，在滴定中兩者有析出的可能，使終點(diǎn)不明顯，影響測(cè)定結(jié)果。

37、 本法僅適用于純度高的維生素E，對(duì)于雜質(zhì)較多的供試品采用本法時(shí)，由于終點(diǎn)不明顯而使結(jié)果不準(zhǔn)確。 本法必須先將維生素E水解成生育酚后才能測(cè)定。 Characteristics Discussion 由于硫酸鈰溶于酸性水而不溶于醇，游離生育酚溶于醇而不溶于水，故溶液需有一定量的乙醇，乙醇濃度太高或太低均使硫酸鈰和生育酚析出，使終點(diǎn)不明顯，影響測(cè)定結(jié)果。 Principle OCOC16H33CH3CH3CH3CH3CH3OH2SO4OC16H33CH3CH3CH3CH3OHCe4+OCH3CH3CH3OCH3C16H33OHCe3+2+Circumfluence High performance

38、liquid chromatography (JP13)色譜條件 色譜柱為內(nèi)徑4mm，長(zhǎng)1530cm的不銹鋼柱，填充以粒徑510m 的十八烷基鍵合硅膠固定相。流動(dòng)相為甲醇-水（49:1），紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)為292nm。生育酚比醋酸生育酚先出峰，且二峰的分離度應(yīng)大于2.6。 重現(xiàn)性試驗(yàn)：重復(fù)試驗(yàn)3次，峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.8 。 Principles A gaseous mobile phase flows under pressure through a heated tube either coated with a liquid stationary phase or packed w

39、ith liquid stationary phase coated onto a solid support. The analyte is loaded onto the head of the column via a heated injection port where it evaporates. It then condenses at the head of the column, which is at a lower temperature. The oven temperature is then either held constant or programmed to

40、 rise gradually. Once on the column separation of a mixture occurs according to the relative lengths of time spent by its components in the stationary phase. Monitoring of the column effluent can be carried out with a variety of detectors. G C Apparatus A gas chromatograph consists of a carrier gas

41、source, an injection port, column, detector, and recording device. G C Applications 1.The identification of some unformulated drugs, particularly with regard to detection of process impurities. 2.Limit tests for solvent residues and other volatile impurities in drug substances. 3.Sometimes used for

42、quantification of drugs in formulations, particularly if the drug lacks a chromophore. 4.Measurement of drugs and their metabolites in biological fluids. G C Advantages 1.Capable of the same quantitative accuracy and precision as high-pressure liquid chromatography (HPLC), particularly when used in

43、conjunction with an internal standard. 2.Has much greater separating power than HPLC when used with capillary columns. 3.Readily automated. 4.Can be used to determine compounds which lack chromophores. 5.The mobile phase does not vary and does not require disposal and, even if helium is used as a ca

44、rrier gas, is cheap compared to the organic solvents used in HPLC. G C Limitations 1.Only thermally stable and volatile compounds can be analyzed. 2.The sample may require derivatisation to convert it to a volatile form, thus introducing an extra step in analysis and, potentially, interferants. 3.Qu

45、antitative sample introduction is more difficult because of the small volumes of sample injected. 4.Aqueous solutions and salts cannot be injected into the instrument. G CThe analysis of thiamineThe structure and properties structure propertiesThe identification testsAssays Non-aqueous titration Sil

46、icotungstic acid gravimetric method Ultraviolet spectroscopy Thiochrome-fluorescence Section 3v Structure 由氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過(guò)亞甲基連接而成的季銨化合物，噻唑環(huán)上季銨及嘧啶環(huán)上氨基，為兩個(gè)堿性基團(tuán)，可與酸成鹽。NNCH2NH2CH2NSCH2CH2OHCH3C12H17ClN4OS HCl ClHC lv Properties Solubility 本品在水中易溶，水溶液顯酸性反應(yīng)；在乙醇中微溶，在乙醚中不溶； Ultraviolet absorption 本品的12.5g/ml鹽酸溶

47、液（91000），在246nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，吸收系數(shù)為406436。 Oxidation 在堿性中，遇氧化劑鐵氰化鉀可被氧化為具有熒光的硫色素，后者溶于正丁醇中顯藍(lán)色熒光。 Reaction with alkaloid precipitation reagents 分子中含有兩個(gè)雜環(huán)（嘧啶和噻唑環(huán)）可與某些生物堿沉淀試劑反應(yīng)生成組分恒定的沉淀。 v Identification testsThiochrome reaction 維生素B1在堿性溶液中，可被鐵氰化鉀氧化生成硫色素。硫色素溶于正丁醇顯藍(lán)色熒光。 Precipitation reaction 維生素B1與碘化汞鉀生成淡黃色沉淀B

48、H2HgI4。 維生素B1與碘生成紅色沉淀BHII2。 維生素B1與硅鎢酸生成白色沉淀B2SiO2(OH)212WO34H2O。 維生素B1與苦酮酸生成扇形白色結(jié)晶。 v Assays Non-aqueous titration 中國(guó)藥典(2000)用本法測(cè)定維生素B1原料的含量。 Principle： 維生素B1分子中含有兩個(gè)堿性的已成鹽的伯胺和季銨基團(tuán)，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可與高氯酸作用。根據(jù)消耗高氯酸的量即可計(jì)算維生素B1的含量。 Titer： 每1ml的高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于16.86mg的C12H17ClN4OSHCl。 Silicotungstic ac

49、id gravimetric method (ChP90) Principle： 維生素B1在酸性溶液中與硅鎢酸作用產(chǎn)生沉淀，根據(jù)沉淀的重量和供試品的重量即可計(jì)算含量。 Titer： 1g沉淀相當(dāng)于0.1939g維生素B1。 取樣量宜在50mg左右，不得少于25mg，否則產(chǎn)生的誤差大。 干燥溫度恒定在80，以保證生成的沉淀含4分子結(jié)晶水，使換算因數(shù)為0.1939。 為了得到易過(guò)濾的沉淀，在酸性溶液中進(jìn)行沉淀。酸量不足時(shí)，所得沉淀過(guò)細(xì)，可通過(guò)過(guò)濾器造成損失；酸量稍過(guò)則無(wú)妨礙，因?yàn)榫S生素B1在酸性溶液中穩(wěn)定。 硅鎢酸用量與維生素B1的量為8：1。若試劑量太少則結(jié)果偏低；如硅鎢酸不純，則需增加用量。

50、 其他因素如沉淀劑加入的快慢、煮沸時(shí)間長(zhǎng)短及沉淀的洗滌等，也直接影響測(cè)定的結(jié)果。 Conditions Principle 維生素B1分子中具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，故具紫外吸收，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度即可定量。 Application 中國(guó)藥典（2000年版）收載的維生素B1片和維生素B1注射液，均采用本法測(cè)定。 Ultraviolet spectroscopy Thiochrome-fluorescence (USP) 原原 理理 硫色素反應(yīng)為維生素B1的專屬反應(yīng)，在一定條件下形成的硫色素與維生素B1濃度成正比，可用于維生素B1及制劑的含量測(cè)定。 Principle: Under basic co

51、nditions, reaction with ferricyanide, thiamine could be oxidized to form thiochrome, which possesses specific fluorescence ( blue , 435nm) after extracted by isobutyl alcohol. ExtractionConversion to thiochrome Separation of thio-chrome solutionPreparation of blankMeasurement of thiochrome Calculati

52、on Procedure: Fluorescence spectrophotometry Certain molecules, particularly those with a chromophore and a rigid structure, can be excited by UV/visible radiation, and will then emit the radiation absorbed at a longer wavelength. The radiation emitted can then be measured. Principles: Instrumentati

53、on Figure 7.2 shows a schematic diagram of a fluorescence spectrophotometer. Emission is observed at right angles to the light being used to excite the sample. The instrument has two monochromators: one to select the wavelength to be used for excitation of the sample, the other to scan the wavelengt

54、h range of the light emitted by the sample. 1.If the concentration of a solution prepared for fluorescence measurement is too high, some of the light emitted by the sample as fluorescence will be reabsorbed by other unexcited molecules in solution. 2.Heavy atoms in solution quench fluorescence by co

55、lliding with excited molecules so that their energy is dissipated. 3.Formation of a chemical complex with other molecules in solution can change fluorescence behavior. Factors interfering with fluorescence intensity 1. Determination of fluorescent drugs in low-dose formulations in the presence non-f

56、luorescent excipients. 2. In carrying out limit tests where the impurity is fluorescent or can be simply rendered fluorescent. 3. Widely used in bioanalysis for measuring small amounts of drug and for studying drug-protein binding. Applications Strengths A selective detection method and can be used

57、to quantify a strongly fluorescent compound in the presence of a larger amount of non-fluorescent material. Limitations The technique only applies to a limited number of molecules. Fluorescence is subject to interference by UV absorbing species, heavy ions in solution, and is affected by temperature

58、. The analysis of L-ascorbic acidThe structures and properties The structure The physical and chemical propertiesThe identification testsAssays Iodometric titration 2,6-dichloroindophenol titration High performance liquid chromatographySection 4v Structure 具有二烯醇結(jié)構(gòu), 內(nèi)酯環(huán)，二個(gè)手性碳原子（C4、C5）， 抗壞血酸性質(zhì)極為活潑，且具有

59、旋光性。OOOHOHCH2OHOHHC6H8O6v Properties Solubility 維生素C在水中易溶，水溶液呈酸性；在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。 The characteristics of glucose Reduction 分子中的二烯醇基具極強(qiáng)的還原性，易被氧化為二酮基而成為去氫抗壞血酸，加氫又可還原為抗壞血酸。在堿性溶液或強(qiáng)酸性溶液中能進(jìn)一步水解為二酮古羅糖酸。Hydrolysis 維生素C和碳酸鈉作用可生成單鈉鹽，不致發(fā)生水解，因雙鍵使內(nèi)酯環(huán)穩(wěn)定，但在強(qiáng)堿中，內(nèi)酯環(huán)可水解，生成酮酸鹽。 Acidity C3-OH由于受共軛效應(yīng)的影響，酸性較強(qiáng)（pK1=4.17）；

60、C2-OH的酸性極弱，故維生素C一般表現(xiàn)為一元酸，能與碳酸氫鈉作用生成鈉鹽。 Chirality 分子中具有兩個(gè)手性碳原子，故有四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體(Enantiomer)，其中L(+)-抗壞血酸活性最強(qiáng)。本品的比旋度為+20.5+21.5。Ultraviolet absorption 維生素C有共軛雙鍵，在稀礦酸溶液中在245nm波長(zhǎng)處有最大吸收；若在中性或堿性條件下，則紅移至265nm處 。v Identification tests Reacting with silver nitrate OOOHOHCH2OHOHHAgNO3OOOOCH2OHOHHHNO3Ag+ 2+ 2+ 2Princi