實驗四果蠅唾腺染色體的觀察

1、實驗四 果蠅唾腺染色體的觀察溫度：21-24 攝氏度 大氣壓：80.1-82.42Kpa 日期：2016.4.28姓名：鄭元躍 學(xué)號：20140322225 班級：14級生物二班一 目的1、觀察果蠅唾腺染色體的形態(tài)特征；2、掌握剝離果蠅幼蟲唾液腺的技術(shù)以及制作唾腺染色體玻片標(biāo)本的方法；3、觀察果蠅唾液腺染色體的結(jié)構(gòu)特征及了解果蠅唾腺染色體在遺傳學(xué)研究中的意義；二 原理雙翅目昆蟲(搖蚊、果蠅等)幼蟲期的唾腺細(xì)胞很大，其中的染色體稱為唾腺染色體。這種染色體比普通染色體大得多，寬約5um，長約400um，相當(dāng)于普通染色體的100150倍，因而又稱為巨大染色體。唾腺染色體處于體細(xì)胞染色體聯(lián)會配對狀態(tài)。

2、并且唾腺染色體經(jīng)過多次復(fù)制而并不分開，每條染色體大約有10004000根染色體絲的拷貝，所以又稱多線染色體。多線染色體經(jīng)染色后，出現(xiàn)深淺不同、密疏各別的橫紋，這些橫紋的數(shù)目和位置往往是恒定的，代表著果蠅等昆蟲的種的特征；如染色體有缺失、重復(fù)、倒位易位等，容易在唾腺染色體上觀察出來。觀察多線染色體的特征：巨大；體細(xì)胞中同源染色體配對，所以細(xì)胞中染色體只可以觀測出半數(shù)(n)；各染色體的異染色質(zhì)的著絲粒部分互相靠攏形成染色中心(chromocenter)；橫紋有深淺、疏密的不同，各自對應(yīng)排列，這意味著基因的排列。果蠅的染色體組成 由于在唾腺細(xì)胞中8條染色體之間以著絲粒相互連結(jié)在一起形成染色

3、盤或異染中心和同源染色體之間的假聯(lián)會，經(jīng)堿性染料染色后，可以觀察到一個染色較深的染色盤和以染色盤為中心向外輻射出的5條染色體臂。在這些染色體臂上可以看到染色深淺不同，被稱為明帶和暗帶的橫紋，這些橫紋的位置、寬窄、數(shù)目都具有物種的特異性，不同物種，不同染色體的不同部位形態(tài)和位置是固定的，因此根據(jù)染色體各條臂帶紋特征和各條臂端部帶紋的特征能準(zhǔn)確識別各條染色體。在染色體臂上還可看到某些帶紋通過染色體的界旋、膨大形成的疏松區(qū)和巴爾比尼環(huán)，其富含轉(zhuǎn)錄出來的RNA ，因此不著色，是基因活動的區(qū)域。在個體發(fā)育的不同階段，疏松區(qū)或巴爾比尼環(huán)在染色體上出現(xiàn)的部位不同，因此可以研究基因的表達，開展各種染

4、色體變異的研究等等。黒腹果蠅（Drosophila melanogaster）染色體的組成；有4對染色體。其中一對為性染色體（XY或XX），XX染色體為頂端著絲粒染色體，呈桿狀，Y染色體為“J”形；第二對、第三對染色體均為中央著絲粒染色體，呈“V”形；第四對染色體短小，為頂端著絲粒染色體，呈點狀，附在染色盤邊緣。由于唾腺染色體的假聯(lián)會，X染色體的一端在異染中心上，另一端游離；而第二對、第三對染色體著絲粒在中央，可以從異染中心呈“V”字形向外伸展出四條臂（2L、2R、3L、3R），Y染色體著絲粒附近的異染色質(zhì)參與了染色中心的形成，所以理想的片子，不管雌雄果蠅的唾腺細(xì)胞在顯微鏡下均可見五條長臂（X

5、、2L、2R、3L、3R)和一條短臂（第四條染色體臂不易觀察）。雄果蠅唾腺細(xì)胞中的X染色體臂比雌果蠅的稍細(xì)。在染色體臂上可觀察到許多明暗相間的帶。黒腹果蠅（Drosophila melanogaster）唾腺染色體特點：(1)巨大；    (2)體聯(lián)會現(xiàn)象決定了染色體只有半數(shù)；    (3)各個染色體中異染色質(zhì)多的著絲粒部分相互靠攏形成染色中心； (4)橫紋有深淺、數(shù)目、疏密的不同，各自對應(yīng)排列，這意味著基因的排列，具有種的特異性。    (5)多線染色體（與中期高度螺旋的染

6、色體相區(qū)別）若有缺失、易位、倒位、重復(fù)等現(xiàn)象，很容易在唾腺染色體上識別出來。果蠅唾腺染色體核型圖 果蠅唾腺染色體模式圖果蠅唾腺染色體圖三 材料與方法材料：黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）三齡幼蟲用具：顯微鏡、放大鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片試劑：1%醋酸洋紅、HCl、生理鹽水方法：1.剝離唾腺： 在一干凈的載玻片上滴一滴生理鹽水，選擇行動遲緩、肥大、爬在瓶壁上即將化蛹的三齡幼蟲，或者選擇經(jīng)低溫處理的果蠅三齡幼蟲置于載玻片上。每只手各持一個解剖針，在解剖鏡下進行操作。由于果蠅的唾腺位于幼蟲體前1/3-1/4處，所以左手持解剖針按壓住蟲體后端三分之一的部位，

7、固定幼蟲，右手持解剖針扎住幼蟲頭部口器部位，適當(dāng)用力向右拉唾腺腺體隨之而出。唾腺是一對透明的棒狀腺體，外有白色的脂肪組織（不透明）。去除幼蟲其它組織部分，并把唾腺周圍的白色脂肪剝離干凈。     2.解離： 在唾腺組織上滴一滴1滴HCl，解離1-2min ，以松軟組織，利于染色體的分散。     3.染色：  吸去 HCl，用水沖洗2-3次后滴加醋酸洋紅染液染色10min。     4.壓片：&#

8、160;染色完成后，蓋上干凈的蓋片，并覆一層濾紙。將片子放在實驗臺上，用大拇指用力壓住，并橫向揉幾次。（注意不要使蓋片移動，用力和揉動是一個方向，不能來回揉。當(dāng)腺體被染成紅色后，用濾紙擦去染液周圍一圈的黑色沉淀物，再用蒸餾水沖洗23次，然后加上蓋玻片，在蓋玻片上方再植蓋一層濾紙，用鑷子在蓋玻片，輕輕敲擊幾下。再用拇指按住蓋玻片用力下壓，把腺體細(xì)胞壓破，把染色體壓散開壓片時放載玻片的桌面要干，不要使蓋片滑動。制好的玻片標(biāo)本用蠟封住蓋玻片四周以防干燥。經(jīng)低溫冷凍處理的材料經(jīng)解離，染色加蓋片后不必敲擊鏡檢即可看到分散良好的唾腺染色體5.鏡檢：   再用高倍鏡觀察。

9、60;   流程：解剖唾腺轉(zhuǎn)到載玻片上加1滴 Hcl解離1min 吸去HCl水洗醋酸洋紅染色10min 蓋片、壓片鏡檢注意事項；1.一定加生理鹽水，否則唾腺易干。 2.將脂肪組織清除干凈。 3.水不可太多，否則幼蟲會漂浮而且活躍。 4.染色時間不可過長，否則背景也著色。 5.壓片時要揉。 6.染色完以后，將舊的染色液吸去，加新的染色液，再壓片。四 結(jié)果與分析X2L3L3R4 2R 40×顯微鏡下看到的結(jié)果五 討論與結(jié)論所做出的唾腺染色體能觀察到有8條，而且制作的材料都是果蠅的三齡幼蟲，制作的步驟為剝離，解離，漂洗，染色，壓片

10、。和前人的做法大致相同，在制作過程中我們沒有考慮外界因素的影響，不同條件下染色體的膨松區(qū)的結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化；每個人和一個所選的三齡幼蟲大小不一樣，而導(dǎo)致實驗結(jié)果有差異。在實驗的過程中，通過用不同大小的三齡幼蟲所拉出的唾腺染色體進行壓片觀察，通過對比觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)越大的三齡幼蟲所觀察到的染色體越明顯，更好的數(shù)出染色體條數(shù)。能更快的做出實驗結(jié)果。通過實驗中總結(jié)與觀察，實驗中應(yīng)把握：（1）位于幼蟲體前約三分之一處。（2）是囊狀結(jié)構(gòu)，常附著不透明的帶狀脂肪。（3）唾腺細(xì)胞較大，輪廓清晰。（4）要將脂肪組織清除干凈，否則影響觀察，壓片時不能來回揉壓。（5）由于樣品難用肉眼觀察到，在各步操作過程中（如沖洗

11、、吸水等）要小心謹(jǐn)慎，以免樣品丟失。（6）掌握好染色時間，時間過短則染色效果不明顯，時間過長則容易使背景染色，影響觀察。（7）觀察唾液腺染色體制片，尋找形態(tài)良好、分散適中的圖像仔細(xì)觀察染色中心及各條臂的特點。由于短小的第染色體不易觀察到，所以?？吹矫黠@的5條臂。雄果蠅的Y染色體主要由異染色質(zhì)組成，幾乎包含在染色中心內(nèi)，因此雄果蠅的X染色體臂比雌果蠅的X染色體臂要細(xì)一些。文獻1任莉萍、聶永青、許樹成.果蠅唾腺染色體的制作技術(shù)研究J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2010,38(25):13609-13610.2彭曉云.果蠅唾腺染色體觀察材料的制備J.生物學(xué)通報.2008,43（4）：55-56.3劉麗影、劉文靜

12、、邵紅.果蠅唾腺染色體四種染色體方法的比較J.佳木斯大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）.2007,25(3):424-426.4趙錦惠、劉中華.果蠅唾腺染色體制片方法的改進J.生物學(xué)通報.2011,46(6):52-53.5龔惠明.果蠅唾腺染色體制片應(yīng)注意的問題J.生物學(xué)教學(xué).2007，32（10）：27-28.6洪正樹.獲取果蠅三齡幼蟲的簡便方法J.生物學(xué)通報.2002,37(4):62-63.7鄒玉蘭、林擁軍.如何培養(yǎng)具有良好唾腺染色體的果蠅三齡幼蟲J.養(yǎng)殖與飼養(yǎng).2009,(7):3-4.8胡甘.用于果蠅唾腺染色體實驗材料的培養(yǎng)方法J.實驗科學(xué)與技術(shù).2007，5（5）：38-52.9潘新法、許宏慶

13、.不同濃度的苯酚品紅對果蠅唾腺染色體的染色效果J.生物學(xué)雜志，2002,19（5）：26-2710楊大翔.“果蠅唾腺染色體的制備與觀察實驗”的背景知識J.生物學(xué)教學(xué)，2005,30（4）：37-3911彭曉云.果蠅唾腺染色體觀察材料的制備J.生物學(xué)通報，2008,43（4）：55-5612王華峰、那冬晨.果蠅唾腺染色體觀察實驗教學(xué)的改革與探索J.實驗室科學(xué)，2009,13（5）：69-7113劉麗影，劉文靜，邵紅.果蠅唾腺染色體四種染色方法的比較J.佳木斯大學(xué)學(xué)報，2007,25（3）：425-42714郝大翠，姚明鏡，劉焰，蔡明歷.果蠅唾腺染色體試材準(zhǔn)備及觀察方法的改進J.生物學(xué)通報，201

14、0,45（4）：48-5115龔慧明.果蠅唾液腺染色體制片應(yīng)注意的問題J.生物學(xué)教學(xué)，2007,32（10）：27-2916洪正樹.獲取果蠅三齡幼蟲的簡便方法J.生物學(xué)通報，2002,37（4）62-6317鄒玉蘭，林擁軍.如何培養(yǎng)具有良好唾腺染色體的果蠅三齡幼蟲J.養(yǎng)殖與飼養(yǎng)，2009，10（7）：3-518何蘭花，盧家現(xiàn).用改良苯酚品紅染色液替代醋酸洋紅染色液的研究J.生物學(xué)雜志，2000,17（2）：28-31作業(yè)1、何謂多線染色體？答：多線染色體：果蠅的唾腺細(xì)胞停止在分裂間期（永久間期 ），染色 體核蛋白纖維不斷復(fù)制，平行排列形成巨大而伸展的多線染色體唾腺染色體經(jīng)過多次復(fù)制而并不分開，

15、每條染色體大約有10004000根染色體絲的拷貝，所以又稱多線染色體(polytene chromosome)。核內(nèi)DNA多次復(fù)制產(chǎn)生的子染色體平行排列，且體細(xì)胞內(nèi)同源染色體配對，緊密結(jié)合在一起，從而阻止了染色體纖維進一步聚縮，形成體積很大的由多條染色體組成的結(jié)構(gòu)叫多線染色體。多線化的細(xì)胞處于永久間期，體積也相應(yīng)增大，它存在于雙翅目昆蟲的幼蟲組織內(nèi)，如唾液腺、氣管等。特點：多線染色體不是生長到一定程度就進入有絲分裂，而是不斷生長，繼續(xù)復(fù)制，而且新的復(fù)制體總是沿其全長整齊地與原來的染色體并列著的，因而染色體就生長得極其龐大。例如，在果蠅唾腺細(xì)胞中每一個多線染色體都是經(jīng)過大約9個循環(huán)的復(fù)制產(chǎn)生的，

16、所以每條多線染色體至少包含了500-1000條單染色體(DNA纖絲)，某些昆蟲的多線染色體包含了多達16000條。經(jīng)過醋酸洋紅或地衣紅染色后，在高倍光鏡下就可以看到每條多線染色體都是由暗帶和明間帶直線交替組成的。同時也已證明，大部分DNA存在于暗區(qū)帶之內(nèi)，每條區(qū)帶都相應(yīng)于染色體上染色粒的聚合區(qū)域，它能被堿性染料染得很深，孚爾根染色呈現(xiàn)陽性，而明間帶則幾乎不著色。以后又證明了每條區(qū)帶都包括幾個或幾十個基因位點。2、你如何證明你看到的是唾腺染色體？答：（1）由于在唾液腺細(xì)胞中8條染色體之間以著絲?；ハ噙B結(jié)在一起形成染色盤或異染中心和同源染色體之間的假聯(lián)會，經(jīng)堿性染料染色后，可以觀察到一個染色較深的

17、染色盤和以染色盤為中心向外輻射出的5條染色體臂。 (2)在這些染色體臂上可以看到染色深淺不同，被稱做明帶、暗帶的橫紋，這些橫紋的位置，寬窄、數(shù)目都具有物種的特異性。不同物種，不同染色體的不同部位形態(tài)位置是固定的。因此根據(jù)染色體各條臂帶紋特征和各條臂端部帶紋特征能準(zhǔn)確識別各條染色體。 (3)在染色體臂上還可看到某些帶紋通過染色體的解旋、膨大形成的疏松區(qū)和巴爾比尼氏環(huán)，其富含轉(zhuǎn)錄出來的RNA，因此不著色。（4）唾液腺細(xì)胞處于永久早期，染色體解旋呈伸展?fàn)顟B(tài)在幼蟲發(fā)育過程中細(xì)胞核中的DNA多次復(fù)制，但細(xì)胞、細(xì)胞核不分裂。復(fù)制后的染色單體DNA不分開，從而形成了多線染色體。（5）每一臂上所有的橫紋的大小

18、和位置是恒定的，即具有種的特征。3.在昆蟲學(xué)中，二齡幼蟲，三齡幼蟲有何生物學(xué)意義？生態(tài)學(xué)意義？遺傳學(xué)意義？答： 果蠅是完全變態(tài)發(fā)育的生物之一，二齡幼蟲，三齡幼蟲是其變態(tài)發(fā)育的重要特點。從初生卵發(fā)育至新羽化的成蟲為一個完整的發(fā)育周期，在25，60相對濕度條件下，大約為10天。通過控制養(yǎng)殖的溫度，可以加速和減緩果蠅的發(fā)育。果蠅個體很小，幼蟲在三齡時達到最大，約2毫米，成年果蠅也僅為23毫米。新羽化的雌性成蟲大約8小時之后即可進行交配，交配之后大約40小時開始產(chǎn)卵，第4-5天出現(xiàn)產(chǎn)卵高峰。性成熟雌性果蠅生殖能力很強，產(chǎn)卵初期每天可達5070枚，累計產(chǎn)卵可達上千枚。 黑腹果蠅是最普遍應(yīng)用于遺傳學(xué)的果蠅

19、，也是奠定經(jīng)典遺傳學(xué)基礎(chǔ)的重要模式生物之一，對其染色體組成和表型、基因編碼和定位的認(rèn)識，是其它生物無法比擬的。基于清晰的遺傳背景和便捷的遺傳操作，果蠅在發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域也都占據(jù)了不可替代的位置。隨著神經(jīng)科學(xué)的興起，許多遺傳操作在該領(lǐng)域不斷發(fā)展和成熟，為在果蠅中進行神經(jīng)科學(xué)的研究打下了堅實的基礎(chǔ)?？傊?，果蠅在近一個世紀(jì)以來的生物學(xué)舞臺上占有舉足輕重的地位，在各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用使其成為一種理想的模式生物，不論在已往、現(xiàn)在和將來都將為人類探索生命科學(xué)的真諦做出不可磨滅的貢獻。4、試著分別設(shè)計一個以動物（果蠅除外）、植物、微生物為材料的“細(xì)胞遺傳學(xué)實驗”。 答：動物的“細(xì)胞遺傳學(xué)實驗”：以小鼠作為實驗材料；方法：（1）取雄性小鼠，以每克體重4微克注射秋水仙素（約1mL），14-16h后，用斷 頭法處死小鼠，取出睪丸用生理鹽水（0.9% NaCl溶液）洗去血污，置于解剖盤中。（2）將睪丸放入裝有1mL 0.3% KCl溶液的小燒杯中剪碎（液體呈乳白色）。（3）用銅網(wǎng)過濾到刻度離心管中，再加0.3% KCl溶液至4mL。 （4） 37靜置30mins，低滲處理。 （5）以800-1000r/min離