吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對(duì)胃癌組織的體外作用

1、大學(xué)課堂教學(xué)的組織行為與教學(xué)模式【摘要】大學(xué)課堂教學(xué)組織柔比星和其他化療藥物對(duì) 胃癌組織溫?zé)釁f(xié)同的作用，探討化療藥物與溫?zé)峄煹膮f(xié)同 作用機(jī)制。方法利用36個(gè)病例的手術(shù)切除胃癌組織，建立 人胃癌組織體外立體培養(yǎng)作用模型，mts pms比色法檢測(cè)組 織培養(yǎng)物活性以了解化療藥物以及溫?zé)峄煹囊至鲂Ч?tunel熒光檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡，he染色研究評(píng)價(jià)藥物對(duì)胃癌 組織在組織形態(tài)學(xué)上的改變并進(jìn)行電鏡觀(guān)察。結(jié)果ddp、畫(huà)c 和thp對(duì)胃癌組織的殺傷均具有較強(qiáng)的溫?zé)釁f(xié)同關(guān)系，thp單 獨(dú)處理和溫?zé)釁f(xié)同處理均具有較強(qiáng)的抑制作用，和其他3種 藥物抑制率比較具有顯著性差異。thp和溫?zé)釁f(xié)同處理效果 和胃癌病例組

2、織學(xué)分級(jí)有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小、 臨床分期和術(shù)前cea水平無(wú)關(guān)。thp溫?zé)釁f(xié)同處理凋亡指數(shù) 和其他3種藥物比較具有顯著性差異。he染色表明，thp和 溫?zé)崽幚砗?，胃癌組織大部崩解，細(xì)胞變性壞死。電鏡分析 表明經(jīng)thp和溫?zé)釁f(xié)同處理后細(xì)胞胞膜內(nèi)陷，胞漿空泡化， 并出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚，同時(shí)核膜消失。結(jié)論thp對(duì)胃癌組織具 有良好的溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)和腫瘤殺傷效果，具有進(jìn)一步臨床研 究?jī)r(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】吡柔比星；溫?zé)嵝?yīng)；胃癌chemotherapyenincombinationwithffectsofpirarubicihyperthermiaongastriccancertissuesin vitr

3、oabstract :objective comparisonoftheeffectsofpirarubicin (thp)incombinationwithhyperthermiaongastriccancertissuesinvitroandtodiscusstheunderlying invitrothreedimensionalactingmodelswereestablishedwith tissuebiopsiesfrom36patientswithpathologicallyconfirmedgastricce llviabilitywasmeas uredbymts pmsfl

4、uorescencedetectionin situapoptosis,hestainingwasusedtostu fdrugtreatedgastri d synergisticeffecrtumortissuesweretrmiaandthreedrugsi thp,andmitomycin (p edsuperiorcytotoxi gsoncancer,histomo suggestedstrongkil cancertissues,incl uestructure,celluldyhistomorphologyo cmicroscopeobserve tswereobserveda

5、fte reatedwithhyperthe ncludingcisplatin, =),whilethpexhibit ceffectstootherdrurphologicalstudies lingeffectsofthpon udingdisruptedtiss ardegradationandnecrosis,karyopyknos isandkaryolysis,al sowithlossofologicalgrading(p=),whileirrelatedtopatients1gender,age,tumorsize ，clinialstagingandpreoperative

6、cealevels (p>).theapoptosisindexhassignificantdiff erencecomparedtiipandtheotherthreetreatedbythp,thegastrictissuesdisaggregation,andelectronmicroscopeobservedcellmembraneinvagination,endochylemamembrane synergisticeffectsofpirarubicinincombinationwithhyperthermiawereevident；cytotoxicityofpirarub

7、icinwasthermallyenhancedconsiderablybymildhyperthermiaongastriccancermaybeapot entialtherapeuticd rugforintra perito nealchemohyperther mia.keywords：pira rubicin； hypertherm ia； gastriccancer0引言消化道惡性腫瘤是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前手術(shù)切 除仍是治療消化道腫瘤的首選方法，但對(duì)進(jìn)展期胃腸道惡性 腫瘤，根治手術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率。術(shù)中腹腔內(nèi)溫?zé)峁嘧?化療（itraope rativeperitoneal

8、hy perthermiachemotherapy，iphc)直接作用于上述復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移部位，對(duì)預(yù)防胃腸道 惡性腫瘤根治術(shù)后復(fù)發(fā)有一定作用，且副作用小，是近年來(lái) 國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。然而，對(duì)于浸潤(rùn)腹膜下較深的腫瘤， hipec化療后仍有腹膜復(fù)發(fā)。因此，研究和應(yīng)用穿透性好的 藥物，提高藥物穿透能力，增強(qiáng)熱的滲透效應(yīng)將是今后的研 究方向。本研究擬建立胃癌組織小塊三維培養(yǎng)技術(shù)，研究吡 柔比星對(duì)胃癌組織的溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)和作用機(jī)制。1材料和方法胃癌標(biāo)本x xxx年本院行根治性胃大部切除或胃全切 的胃癌手術(shù)標(biāo)本36例，均經(jīng)病理學(xué)明確診斷。其中，男22 例，女14例，年齡3385歲，平均歲。患者臨床分期、病

9、理組織學(xué)分類(lèi)、術(shù)前cea水平和腫瘤直徑資料，見(jiàn)表1。表 1胃癌病例背景資料和thp溫?zé)嵋种坡驶熕幬镯樸K(ddp)購(gòu)自齊魯制藥廠(chǎng)，吡柔比星(thp)由深圳萬(wàn)樂(lè) 醫(yī)藥有限公司提供，絲裂霉素為日本協(xié)和發(fā)酵產(chǎn)品，氟尿嘧 啶注射液為浙江海普制藥公司產(chǎn)品。藥物儲(chǔ)存液根據(jù)說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行配制，儲(chǔ)存于-20°c冰箱。試劑和耗材無(wú)酴紅rpm 11640和胎牛血清為hyclone公 司產(chǎn)品；mts購(gòu)自promega公司；硫酸酚臻甲釀(phenazine methosulfate,pms)、dmso、新霉素和兩性霉素b均為si gma 公司產(chǎn)品；膠原蛋白海綿為北京益而康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為10 xx

10、，海綿使用前剪成大?。?4孔培養(yǎng)板為costar 產(chǎn)品。溫?zé)嵝?yīng)研究根據(jù)hoffman1等方法，手術(shù)標(biāo)本剝離表 面的脂肪和纖維組織，用pbs清洗其表面的血污和臟物，然 后將標(biāo)本置于含有抗生素的浸泡液中浸泡15mi n。再加入 1640培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，用手術(shù)刀將標(biāo)本盡量切割成1mm大小 的小塊，3塊組織塊加入膠原海綿上，然后轉(zhuǎn)移至已預(yù)加培 養(yǎng)基的24孔板孔中，培養(yǎng)箱37°c培養(yǎng)過(guò)夜。第二天每孔沿 孔壁緩慢加入含有藥物的培養(yǎng)基ml，每個(gè)藥物濃度3個(gè)平行 孔，于42°c作用lh，然后吸出藥物，培養(yǎng)基洗2次，加入 新鮮培養(yǎng)液lml繼續(xù)培養(yǎng)3d。目前thp在溫?zé)峄煼矫娴膽?yīng) 用報(bào)道甚

11、少，本研究參考其靜脈用藥劑量(40mg/m2)，濃度設(shè) 定為32ug/ml。其他藥物濃度參考文獻(xiàn)報(bào)道1，其中，ddp 處理濃度為50以/1111，麗(：濃度為151/1111，氟尿嘧啶為350 p g /ml。(以dpbs配制成2mg/ml，pm濾膜過(guò)濾除菌，分裝。pms 的配制：以pbs配制成100mmol/l的貯存液，ym濾膜過(guò)濾 除菌，4°c避光保存。mts pms使用液：在新配制的mts 中以20 : 1體積比加入pms混和即用。mtspms測(cè)定方法:24孔培養(yǎng)板每孔加入looul的mts pms使用液，繼續(xù)培 養(yǎng)4h后，振蕩10 min,每孔取100 yl，以490nm的波

12、長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，取三個(gè)平行孔均值。抑制率（%）=（加藥孔0d-空白孔0d） / （對(duì)照孔0d-空白孔 od） x100熒光檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡藥物處理后的組織小塊置于恒 冷箱冰凍切片機(jī)切片架上，待組織塊冷凍變硬后切片，厚度 為57um。4°/。多聚甲醛中4°c固定30min，1 00冰上穿透5min, pbs洗滌3次，共15min。加入fitc標(biāo) 記的tune1反應(yīng)混合物，37°c濕盒反應(yīng)90min,然后用pbs 洗滌3次，共3 0min，80%磷酸甘油封片。取非壞死區(qū)熒光顯 微鏡觀(guān)察計(jì)數(shù)200個(gè)以上細(xì)胞，作陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)。組織和細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究藥物處理后的組織小塊置于10

13、%中性甲醛中4°c固定48h 經(jīng)系列乙醇脫水，石蠟包埋后切片。切片經(jīng)蘇木素和伊紅染 色，顯微鏡下觀(guān)察溫?zé)峄熐昂竽[瘤組織形態(tài)學(xué)變化；用于 電鏡分析的標(biāo)本采用2%戊二醛固定，然后依次經(jīng)四氧化硪處 理和梯度脫水后，包埋并切片鏡檢。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件?；熕幬餃?zé)釁f(xié)同作用與單 獨(dú)化療藥物兩組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；各個(gè)化療藥物間作用 的差異分析采用單向方差分析，t hp對(duì)胃癌組織的抑制作用 和一些臨床因素的相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析，計(jì)算 spearman相關(guān)系數(shù)。2結(jié)果溫?zé)峄煂?duì)胃癌組織的作用4種藥物對(duì)胃癌組織均具有一定的殺傷作用，見(jiàn)表2。 其中，ddp、醒c和thp三種藥

14、物具有溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)，溫?zé)崽?理的抑制作用均較單獨(dú)處理有所增強(qiáng)；5 fu未見(jiàn)明顯溫?zé)?協(xié)同效應(yīng)。thp單獨(dú)處理和溫?zé)釁f(xié)同處理均具有較強(qiáng)的抑制 作用，和其他3種藥物抑制率比較具有顯著性差異。表2藥 物對(duì)胃癌組織的溫?zé)釁f(xié)同抑制率對(duì)胃癌組織作用和臨床因素的關(guān)系th p對(duì)胃癌組織的抑制作用和一些臨床因素的相關(guān)性研 究表明，thp對(duì)腫瘤的抑制效應(yīng)和年齡、性別、術(shù)前cea水 平、臨床分期和腫瘤大小無(wú)關(guān)，而與腫瘤的病理學(xué)分級(jí)有關(guān)。 隨著組織分級(jí)從高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌到印 戒細(xì)胞癌，thp抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。37°c時(shí)spearman相關(guān) 系數(shù)y=_，p=; 42°c時(shí)spea

15、rman相關(guān)系數(shù)y而其他幾種化療藥物ddp、麗c、5 fu無(wú)論是在37°c或者是 42°c情況下，對(duì)腫瘤的抑制效應(yīng)和年齡、性別、術(shù)前cea水 平、臨床分期、腫瘤大小和腫瘤組織分級(jí)均無(wú)關(guān)。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)4種藥物對(duì)胃癌組織均具有一定的凋 亡誘導(dǎo)作用，見(jiàn)表3，圖la、b。其中，ddp、mmc和thp三 種藥物具有溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)，溫?zé)崽幚砭^單獨(dú)處理具有顯著 增加的凋亡指數(shù)。thp溫?zé)釁f(xié)同處理均具有較強(qiáng)的凋亡效應(yīng)， 其凋亡指數(shù)和其他3種藥物比較具有顯著性差異。表3四 種藥物的溫?zé)峄煂?duì)胃癌組織的凋亡誘導(dǎo)作用染色和電鏡分析h e染色結(jié)果表明，thp和溫?zé)釁f(xié)同對(duì) 胃癌組織具有顯著的殺傷

16、效應(yīng)，光鏡視野下腫瘤組織喪失完 整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞嚴(yán)重壞死，細(xì)胞核大部分固縮，胞 漿散失并伴有大量核碎片化現(xiàn)象，見(jiàn)圖lc、d。電鏡分析表 明經(jīng)thp和溫?zé)釁f(xié)同處理后細(xì)胞呈現(xiàn)早期、中晚期凋亡特征， 胞膜內(nèi)陷，胞漿空泡化，并出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚，同時(shí)核膜消失，3討論胃癌占消化道腫瘤死亡人數(shù)的一半和各種惡性腫瘤死 亡總數(shù)的1/5,居惡性腫瘤死亡的前列。近些年來(lái)，隨著外 科手術(shù)的進(jìn)展，術(shù)后淋巴結(jié)復(fù)發(fā)已明顯減少，取而代之的是 腹腔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。如何預(yù)防術(shù)后腹腔復(fù)發(fā)是胃腸道腫瘤急待 解決的問(wèn)題。目前，術(shù)中腹腔內(nèi)溫?zé)峁嘧⒒熞阎饾u成為大多數(shù)學(xué)者 公認(rèn)的治療進(jìn)展期胃腸道腫瘤的有效方法。術(shù)中腹腔內(nèi)溫?zé)?灌注化療使胃

17、腸道腫瘤術(shù)后腹腔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)取得明顯療效， 并能顯著提高生存率，但其中還有許多細(xì)節(jié)問(wèn)題值得探討， 如化療藥物的選擇、具體方法的選擇、藥液容量、劑量的確 定等，都是亟待解決的問(wèn)題。吡柔比星化學(xué)結(jié)構(gòu)中有一四氫吡喃基團(tuán)，因此能夠部分 繞過(guò)gpl70糖蛋白所介導(dǎo)的對(duì)阿霉素的耐藥性2。研究表 明，白血病細(xì)胞hl 60對(duì)thp的攝入非常迅速，在lug/ml 的濃度下30s內(nèi)thp的累積攝入量為ug，主要吸收進(jìn)入細(xì) 胞核；而阿霉素僅為yg，大部分處于胞漿，同時(shí)，thp的排 出較慢，細(xì)胞內(nèi)能保留高濃度3。sugano等4在膀胱癌 腔內(nèi)灌注動(dòng)物模型中的研究表明，thp對(duì)癌腫有較強(qiáng)的穿透 性，能夠在60min內(nèi)穿透

18、23mm組織，而阿霉素僅能穿透1mm 因此，thp在溫?zé)峁嘧⒒熤芯哂休^好的臨床應(yīng)用前景。目前，國(guó)際上有關(guān)thp在溫?zé)峁嘧⒒熤械幕A(chǔ)研究和 臨床應(yīng)用的報(bào)道甚少。本研究結(jié)果顯示thp42°c協(xié)同對(duì)胃癌 組織的殺傷效應(yīng)高于目前的常用藥如ddp、mmc和5 fuo 本研究前期工作表明，人胃癌mgc 803細(xì)胞經(jīng)thp和溫?zé)?協(xié)同處理后，處于s期的細(xì)胞增多，g2/m期細(xì)胞減少5。有報(bào)道表明，thp對(duì)處于g2/m期細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)， 而對(duì)g0/1期細(xì)胞的殺傷作用較弱。由于溫?zé)釁f(xié)同不能增加 細(xì)胞對(duì)thp的攝取。因此，通過(guò)溫?zé)崽幚碜铚?xì)胞周期于g2/m 期，是增加細(xì)胞對(duì)thp的敏感性的重要機(jī)制

19、。臨床因素相關(guān)性分析表明，thp在37°c或者42°c的殺傷 作用和患者年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小和術(shù)前cea水 平?jīng)]有明顯關(guān)系，而與胃癌的組織病理學(xué)分級(jí)有關(guān)，其抑制 作用在高分化腺癌最強(qiáng)。國(guó)外臨床試驗(yàn)研究表明，術(shù)中溫?zé)?灌注化療的臨床療效和臨床分期有關(guān)，對(duì)于胃癌ii、iii期患者，術(shù)中溫?zé)峁嘧⒒熌軌蝻@著延遲復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)患者生存時(shí) 間，而對(duì)于iii期以上患者，術(shù)中腹腔內(nèi)溫?zé)峄煵o(wú)顯著性 生存優(yōu)勢(shì)6?？紤]本研究是局部對(duì)胃癌組織的體外研究， 影響因素相對(duì)比較少，而臨床研究結(jié)果與很多臨床因素有關(guān) 比如術(shù)中腹腔內(nèi)溫?zé)峄煹男g(shù)中副作用和相關(guān)并發(fā)癥的可 能對(duì)臨床療效均有影響。所以

20、thp對(duì)胃癌組織的抑制作用的 高低與臨床療效的好壞不一致并不矛盾。一般認(rèn)為在全身化療中，腫瘤分化程度低，thp的作用 效果好。而本研究結(jié)果提示腫瘤分化程度高，thp抑制腫瘤 組織作用效果好。這可能與本研究使用局部化療時(shí)藥物濃度 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高與全身化療的藥物濃度有關(guān)。由于thp的滲透性好， 滲透入細(xì)胞內(nèi)藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于耐藥蛋白將藥物泵出腫瘤 細(xì)胞的濃度，這時(shí)耐藥蛋白對(duì)抗拒化療所起的作用相對(duì)很小 故thp灌注化療對(duì)耐藥蛋白功能較完善的高分化的腫瘤細(xì)胞 效果更好。而其他的化療藥物如ddp、麗c、5 fu與組織學(xué) 分級(jí)無(wú)相關(guān)性的原因也可能與它們的滲透性相對(duì)較差有關(guān)。綜上所述，thp對(duì)胃癌組織具有良好的溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)和 腫瘤殺傷效果，具有腹腔內(nèi)溫?zé)峁嘧⒒煹难芯繎?yīng)用價(jià)值。 在臨床上選擇合適的臨床分期和組織學(xué)分級(jí)胃癌病例在e 手術(shù)期進(jìn)行術(shù)中腹腔內(nèi)溫?zé)峄熓怯幸饬x的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】furukawat，kubotat,hoffmanapplicationsofthehistoculturedrugresponseassayj. clincancerres,1995,1 (3):305311.2 furuka wat, kubotat, murata h, etspectraofanthracyclinesagainst