瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程

1、；瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程凝膠電泳操作注意事項(xiàng)：1. 緩沖系統(tǒng)：在沒(méi)有離子存在時(shí)，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí)，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5u

2、g的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過(guò)多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。5. 電泳系統(tǒng)的變化會(huì)影響DNA的遷移，加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的。6. DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來(lái)決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。瓊脂糖加樣時(shí)候注意事項(xiàng)：1、 用移液搶將樣品加至點(diǎn)樣孔

3、。每孔點(diǎn)樣的體積一般少于25ul，因此吸取每一個(gè)樣品時(shí)，操作要穩(wěn)當(dāng)且細(xì)心。2、 常加一定量的蔗糖來(lái)增加樣品的濃度，以使每個(gè)樣品停留在各自的點(diǎn)樣孔中。3、 在樣品中加入水溶性的陰離子追蹤染料（如溴酚藍(lán)），用以看出樣品移動(dòng)的距離。4、 在一個(gè)或幾個(gè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量樣品，電泳結(jié)束后，根據(jù)已知分子質(zhì)量的帶的相應(yīng)位置可用來(lái)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、 電泳一般是在追蹤染料泳動(dòng)到膠的80%部位時(shí)停止。注意電泳期間，電泳槽蓋要安全蓋好，以防止液體蒸發(fā)，又可以降低電擊的可能性。6、 電泳結(jié)束后，將膠浸沒(méi)在1mg/L的溴化乙錠（EB）中，5min后即可看到DNA帶，EB通過(guò)插入在雙螺旋的配對(duì)核苷酸之間同NDA結(jié)合。另

4、一種方法是電泳時(shí)，在膠中加入EB。7、 在紫外燈下，由于EB發(fā)出強(qiáng)烈的橘紅色的熒光，所以可以看到DNA帶。利用這種方法檢測(cè)的界限是每條帶約10ng DNA。帶上塑料安全眼鏡可防止紫外光對(duì)眼睛的傷害。可用尺子來(lái)測(cè)量每條帶至點(diǎn)樣孔的距離。同樣，利用特制的照相機(jī)和調(diào)焦器，也可以對(duì)凝膠拍照。8、 如果要對(duì)某一條帶（如質(zhì)粒）進(jìn)一步分析，可用小刀將含該帶的凝膠切割下來(lái)，從帶中回收DNA。瓊脂糖核酸電泳實(shí)驗(yàn)操作流程 1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，定量

5、加入電泳緩沖液（一般2030 ml）；3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4.室溫下3045分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒(méi)過(guò)膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；6.在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒(méi)的凝膠加樣孔內(nèi)；7.接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng) (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60100V電壓，電泳2040min即可；8. 根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳；9.電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。  瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍 瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（b