原位雜交組織化學

1、第八章第八章 原位雜交組織化學原位雜交組織化學原位雜交組織化學（原位雜交組織化學（ISHHISHH）原理：原理：用標記的用標記的DNADNA或或RNARNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。序列的方法。特點：特點：雜交在載玻片上的細胞進行。雜交在載玻片上的細胞進行。分類：分類：根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同- DNA-DNA DNA-DNA雜交、雜交、 DNA-RNADNA-RNA雜交、雜交、 RNA-RNARNA-RNA雜交雜交根據(jù)探針標記物是否直接被檢測根據(jù)探針標記物是否直接被檢測 直接法、間接法直接法、間接法一一 原

2、位雜交的由來與發(fā)展原位雜交的由來與發(fā)展（一）核酸分子雜交技術(shù)（一）核酸分子雜交技術(shù)v按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種v液相雜交：液相雜交：參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 液相分子雜交技術(shù)包括：液相分子雜交技術(shù)包括： 吸附雜交吸附雜交 發(fā)光液相雜交發(fā)光液相雜交 液相夾心雜交液相夾心雜交 復性速率液相分子雜交復性速率液相分子雜交v固相雜交：固相雜交： 是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微用的有硝酸纖維素

3、濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。孔板等），另一條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交技術(shù)包括：固相雜交技術(shù)包括： 菌落原位雜交菌落原位雜交 斑點雜交法斑點雜交法 Southern Southern印跡雜交印跡雜交 Northern Northern印跡雜交印跡雜交 組織原位雜交組織原位雜交（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近在近2020年飛躍發(fā)展的突出特點：年飛躍發(fā)展的突出特點： 由分子遺傳學研究提供的探針大量增加；由分子遺傳學研究提供的探針大量增加； 探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了；探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了； 非放射性

4、標記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實驗室的常非放射性標記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應用的診斷技術(shù)。規(guī)技術(shù)和臨床日常應用的診斷技術(shù)。 新的非放射性標記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。新的非放射性標記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。二二 原位雜交組織化學基本技術(shù)原位雜交組織化學基本技術(shù)v原位雜交的基本方法和應用原則：原位雜交的基本方法和應用原則： 雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； 雜交；雜交； 雜交后處理；雜交后處理； 顯示（顯示（visualizati

5、onvisualization）：）： 放射性自顯影顯色、非放射性標記顯色放射性自顯影顯色、非放射性標記顯色（一）原位雜交的基本要求（一）原位雜交的基本要求1 1 固定固定2 2 玻片和組織切片的處理玻片和組織切片的處理3 3 雜交雜交4 4 雜交后處理雜交后處理5 5 顯示顯示6 6 對照實驗和對照實驗和ISHHISHH結(jié)果的判斷結(jié)果的判斷 1 1 固定固定 固定劑的應用和選擇原則：固定劑的應用和選擇原則： 保持細胞結(jié)構(gòu)；保持細胞結(jié)構(gòu)； 最大限度地保持細胞內(nèi)最大限度地保持細胞內(nèi)DNADNA或或RNARNA水平；水平； 使探針易于進入細胞或組織。使探針易于進入細胞或組織。 vDNADNA：比較

6、穩(wěn)定，對于比較穩(wěn)定，對于DNADNA的定位來說，固定劑的種類的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。和濃度并不十分重要。vRNARNA：易被降解，在易被降解，在RNARNA的定位上，要使的定位上，要使RNARNA的降解減少的降解減少到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時間十分到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。v固定劑：固定劑：多聚甲醛、醋酸多聚甲醛、醋酸- -酒精混合液、酒精混合液、BouinsBouins固定劑、固定劑、 CarnoysCarnoys液液 優(yōu)缺點：優(yōu)缺點： 沉淀性固定劑：沉淀性固定劑

7、：酒精酒精/ /醋酸混合液、醋酸混合液、BouinsBouins液、液、 CarnoysCarnoys液液 能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存RNARNA， 且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。 戊二醛：戊二醛：能較好地保存能較好地保存RNARNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。 多聚甲醛：多聚甲醛：仍被公認為仍被公認為ISHHISHH較為理想的固定劑。較為理想的固定劑。 多聚甲醛多聚甲醛mRNAmRNA的定位的

8、定位 將組織固定于將組織固定于4%4%多聚甲醛磷酸緩沖液中多聚甲醛磷酸緩沖液中1 12h2h，在冷凍，在冷凍前浸入前浸入15%15%蔗糖溶液中，置蔗糖溶液中，置44冰箱過夜，次日切片或保冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入入4%4%多聚甲醛約多聚甲醛約10min10min，空氣干燥后保存在，空氣干燥后保存在-70-70。如冰。如冰箱溫度恒定，在箱溫度恒定，在-70-70可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果

9、。果。v病理學活檢取材病理學活檢取材 福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測本對檢測DNADNA和和mRNAmRNA有時也可獲得雜交信號。有時也可獲得雜交信號。v石蠟包埋切片石蠟包埋切片 由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片，同時，核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片，同時，在包埋的過程中可減低在包埋的過程中可減低mRNAmRNA的含量。的含量。v冷凍切片冷凍切片 應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。也可獲得滿意效果。2 2 玻片和組織

10、切片的處理玻片和組織切片的處理 （1 1）玻片的處理）玻片的處理 熱肥皂刷洗熱肥皂刷洗 自來水清洗自來水清洗 清潔液中浸泡清潔液中浸泡24h 24h 清水洗凈清水洗凈 烘干烘干 95%95%酒精中浸泡酒精中浸泡24h 24h 蒸餾水沖洗蒸餾水沖洗 烘干烘干 烘箱溫度烘箱溫度150150過夜以去除過夜以去除RNARNA酶酶 蓋玻片硅化處理蓋玻片硅化處理 錫箔紙包裹無塵存放錫箔紙包裹無塵存放（2 2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 根據(jù)應用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探根據(jù)應用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。針長度而定。 常用方法：

11、常用方法： 稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑 Triton X-100Triton X-100、酒精或、酒精或某些消化酶等。某些消化酶等。 優(yōu)點優(yōu)點: : 通過去蛋白作用增強組織通透性和探針的穿透性通過去蛋白作用增強組織通透性和探針的穿透性, ,提高雜提高雜交信號交信號. . 缺點缺點: : 減低減低RNARNA的保存的保存, ,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài)影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài). .因此，在用量及孵因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。育時間上應慎為掌握。（3 3）減低背景染色）減低背景染色 v預雜交（預雜交（PrehybridizationPrehybridization）: :

12、是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。而減低背景染色。v雜交后洗滌雜交后洗滌: : 采用低濃度的采用低濃度的RNARNA酶溶液（酶溶液（20g/ml20g/ml）洗滌一次，去）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的除殘留的和內(nèi)源性的RNARNA酶，減低背景染色。酶，減低背景染色。（4 4）防止）防止RNARNA酶的污染酶的污染 在整個雜交前處理過程

13、都需戴消毒手套。在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。 所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤烘烤消除消除RNARNA酶酶, ,亦可用消毒鍋。亦可用消毒鍋。 要破壞要破壞RNARNA酶，最低溫度必須在酶，最低溫度必須在150150左右。左右。 消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出 時空氣污染。時空氣污染。 雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。3 3 雜交（雜交（HybridisationHybridisation）雜交雜交: :核酸探針

14、進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。 是是ISHHISHH中關鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。中關鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。 雜交方式雜交方式: :是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。 加蓋片的目的加蓋片的目的 防止孵育過程中的高溫（防止孵育過程中的高溫（5050左右）導致雜交液的蒸發(fā)左右）導致雜交液的蒸發(fā); ; 硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑, ,無氣泡無氣泡, ,不會影響不會影響組織切片與雜交液的接觸組織切片與雜交液的接觸; ; 蓋玻片自身重量能與雜交

15、液吸附達到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。雜交注意環(huán)節(jié)雜交注意環(huán)節(jié) （1 1）探針的濃度）探針的濃度 原則原則: :探針濃度必須給予該實驗最大的信探針濃度必須給予該實驗最大的信/ /噪比值。最佳原噪比值。最佳原則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。度為目的。雜交液的量要適當雜交液的量要適當: :以以101020l/20l/每張切片為宜。每張切片為宜。雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落, ,過量過量的雜交液含核酸探針濃度過高

16、，易導致高背景染色等后果。的雜交液含核酸探針濃度過高，易導致高背景染色等后果。 （2 2）探針的長度）探針的長度 最佳長度應在最佳長度應在5050100100個堿基之間。個堿基之間。 探針短探針短- - 易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。 500500個堿基的探針個堿基的探針- - 雜交時間約需雜交時間約需20h20h左右。左右。 200200500500個堿基的探針個堿基的探針- - 可應用可應用. . 超過超過500500個堿基的探針個堿基的探針- - 在雜交前最好用堿或水解酶進在雜交前最好用堿或水解酶進 行水解，使其變成短的片段，行水解，使其變成短的片段

17、， 達到實驗所需求的堿基數(shù)。達到實驗所需求的堿基數(shù)。 （3 3）雜交的溫度和時間）雜交的溫度和時間 雜交溫度：雜交溫度： DNADNA或或RNARNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。原位雜需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。原位雜交中，交中，DNADNA、RNARNA探針需要的探針需要的TmTm分別是分別是9090、9595，這種，這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和甲酰胺甲酰胺，減，減低低TmTm。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異。根據(jù)探針的種類不同，溫

18、度略有差異。 雜交時間：雜交時間： 16-20h16-20h或孵育過夜或孵育過夜甲酰胺：甲酰胺：在雜交液中占在雜交液中占50%50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應溫度，利于左右；調(diào)節(jié)雜交反應溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。硫酸葡聚糖：硫酸葡聚糖：在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占10%10%左右；是一左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合作用，因而能種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核大大增

19、加雜交液的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。酸探針。甲酰胺和硫酸葡聚糖：甲酰胺和硫酸葡聚糖： （4 4）雜交嚴格度（）雜交嚴格度（Hybridization stringencyHybridization stringency） 雜交嚴格度：雜交嚴格度：表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。及不完全配對雜交體的鑒別程度。 錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，

20、提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。但敏感性降低，反應亦然。v低嚴格度：低嚴格度：雜交及沖洗條件在雜交及沖洗條件在Tm35Tm354040之間，高鹽或低之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有甲酰胺濃度。大約有70%70%90%90%的同源性核苷酸序列被結(jié)的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。合，可導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。 v中嚴格度：中嚴格度：Tm 20-30Tm 20-30的范圍。的范圍。v高嚴格度：高嚴格度：為為 Tm10-15Tm10-15，低鹽和高甲酰胺濃度。只有，低鹽和高甲酰胺

21、濃度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。4 4 雜交后處理雜交后處理v包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的：目的：通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件：洗滌的條件：如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共

22、同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。v注意事項：注意事項： 漂洗過程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗過程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。 放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測背景染色作為改善漂洗程序的指針。背景染色作為改善漂洗程序的指針。5 5 顯示顯示 Visualization 又稱檢測系統(tǒng)又稱檢測系統(tǒng) Detection system根據(jù)核酸探針標記物

23、的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。測系統(tǒng)進行不同顯色處理。放射自顯影：放射自顯影： 圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。 非放射性核酸探針雜交的細胞或組織：非放射性核酸探針雜交的細胞或組織： 酶檢測系統(tǒng)顯色酶檢測系統(tǒng)顯色 顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。6 6 對照實驗和對照實驗和ISHHISHH結(jié)果的判斷結(jié)果的判斷 Northern Northern 和和 SouthernSouthern印跡雜交法。印跡雜交法。 可用結(jié)合的免疫組織化學和可用結(jié)合

24、的免疫組織化學和ISHHISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應應mRNAmRNA共存于同一細胞中。共存于同一細胞中。 預先將切片用預先將切片用DNADNA酶或酶或RNARNA酶消化，然后用酶消化，然后用ISHHISHH技術(shù)證明技術(shù)證明丟失的是丟失的是DNADNA或或RNARNA。事先與特異性的。事先與特異性的cRNAcRNA或或cDNAcDNA進行雜交。進行雜交。再進行再進行ISHHISHH，其結(jié)果應為陰性。由于同一，其結(jié)果應為陰性。由于同一RNARNA探針和組織內(nèi)探針和組織

25、內(nèi) mRNAmRNA序列順序是相同的，應用其進行序列順序是相同的，應用其進行ISHHISHH，結(jié)果應為陰性。，結(jié)果應為陰性。 檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應在無標記探針檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應在無標記探針的情況下進行。的情況下進行。 多因素都將影響多因素都將影響ISHHISHH的實驗結(jié)果。的實驗結(jié)果。（二）核酸探針（二）核酸探針v1 1 核酸探針的種類核酸探針的種類v2 2 探針的標記與應用探針的標記與應用 1 1 核酸探針的種類核酸探針的種類 （1 1）按標記方式分類）按標記方式分類 直接法和間接法：直接法和間接法： ）直接標記探針）直接標記探針 應用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（應

26、用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（FITCFITC）或羅丹明）或羅丹明RhodamineRhodamine等熒光物質(zhì)的等熒光物質(zhì)的dNTPdNTP或或NTPNTP直接標記探針，雜交洗滌后即可在直接標記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。顯微鏡下檢測。 ）間接標記探針）間接標記探針 采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標記探針，采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微進行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。鏡下觀察分析。兩種方

27、法的比較：兩種方法的比較：v（1 1）直接標記的）直接標記的DNADNA探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯示雜交信號，簡單方便，而間接標記的探針雜交后需示雜交信號，簡單方便，而間接標記的探針雜交后需通過繁瑣的檢測步驟；通過繁瑣的檢測步驟；v（2 2）間接標記的探針可進行多步驟信號放大，但其受）間接標記的探針可進行多步驟信號放大，但其受配基親和力的影響。而直接標記的信號放大一般受到配基親和力的影響。而直接標記的信號放大一般受到限制，目前多用限制，目前多用DuponDupon公司的公司的TSATSA系統(tǒng)進行直接標記信系統(tǒng)進行直接標記信號的放大。號的放大。v（3 3）對于多色）

28、對于多色FISHFISH，往往選擇直接標記法標記探針。，往往選擇直接標記法標記探針。 （2 2）按核酸性質(zhì)分類）按核酸性質(zhì)分類 DNA DNA探針探針 cDNA cDNA探針探針 RNA RNA探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針（3 3）按染色體上位置分類：）按染色體上位置分類： 重復序列探針重復序列探針 涂染探針涂染探針 基因探針及其它基因探針及其它2 2 探針的標記與應用探針的標記與應用 v切口平移法（切口平移法（Nick translationNick translation）v隨機引物法隨機引物法 (Random Primer)(Random Primer)v末端標記法末端標記法vPC

29、RPCR標記法標記法v體外轉(zhuǎn)錄標記法體外轉(zhuǎn)錄標記法不同模板需不同標記方法不同模板需不同標記方法 生物素標記生物素標記cRNAcRNA探針探針在原位雜交組織化學中的應用在原位雜交組織化學中的應用1 1 光敏生物素標記光敏生物素標記cRNAcRNA探針的應用探針的應用2 2 酶促生物素標記酶促生物素標記cRNAcRNA探針的應用探針的應用v1 1 光敏生物素標記光敏生物素標記cRNAcRNA探針的應用探針的應用 光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照101020min20min，生物素就結(jié)合在，生物素就結(jié)合在DNADNA或或RNARNA分子上，

30、屬于化學修飾法，分子上，屬于化學修飾法，此方法簡單；成本低；適用于大量制備（此方法簡單；成本低；適用于大量制備（50ug50ug）。）。v光敏生物素試劑種類：光敏生物素試劑種類： 光生物素（乙酸鹽）光生物素（乙酸鹽） 補骨脂素生物素。補骨脂素生物素。 生物素生物素- -聚乙二醇聚乙二醇- -當歸素（當歸素（BPABPA）：在長波）：在長波UVUV下它可與下它可與DNADNA堿基共價鍵結(jié)合。堿基共價鍵結(jié)合。BPABPA反應物與反應物與DNADNA結(jié)合比光敏生物素更特結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應，這個特異性可使異，在可見光下它不與核酸反應，這個特異性可使BPABPA只只標記粗制

31、細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。他細胞大分子。v光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下：光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下： 石蠟切片脫蠟入水后，石蠟切片脫蠟入水后，PBSPBS洗；冰凍切片直接入洗；冰凍切片直接入PBSPBS洗。洗。 0.1mol/L0.1mol/L甘氨酸甘氨酸PBSPBS洗洗5min5min。 0.4%Trixtion X-100 PBS0.4%Trixtion X-100 PBS洗洗15min15min。 1ug/ml1ug/ml蛋白酶蛋白酶K K，3737保溫保溫30min30min。 4%4

32、%多聚甲醛多聚甲醛PBSPBS固定。固定。 0.1mol/L PBS0.1mol/L PBS洗洗2 23min3min。 0.25%0.25%乙酸酐乙酸酐10min10min。 2 2SSCSSC洗洗10min10min。 取取10ul10ul含相應含相應探針探針的雜交液滴于標本上，如果是的雜交液滴于標本上，如果是cDNAcDNA探探針，則用前將探針于針，則用前將探針于9595水浴中保溫水浴中保溫10min10min，馬上冰浴冷，馬上冰浴冷卻，然后再用。卻，然后再用。10 10 蓋上硅化蓋玻片或蠟膜，蓋上硅化蓋玻片或蠟膜，4343濕盒保溫濕盒保溫1216h1216h。11 411 4SSCSS

33、C洗脫蓋片，并在同一液中，洗脫蓋片，并在同一液中，3737漂洗漂洗10-30min10-30min。12 212 2SSCSSC（含（含20ug/mlRNaesA20ug/mlRNaesA，適于，適于RNARNA探針）探針）3737洗洗30min30min。13 113 1SSCSSC，0.10.1SSCSSC，3737各漂洗各漂洗10-30min10-30min。14 0.05mol/L PBS14 0.05mol/L PBS洗洗4 45min5min。15 3%BSA15 3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS0.4%Triton X-100 PBS配）配）3737保溫保溫3

34、0min30min。16 16 堿性磷酸酶堿性磷酸酶室溫室溫13h13h。17 0.05mol/L PBS17 0.05mol/L PBS洗洗4 45min5min。18 18 緩沖液緩沖液洗洗2 25min5min。19 19 緩沖液緩沖液洗洗2 25min5min。20 20 NBT/BCIPNBT/BCIP液液顯色，室溫，暗處顯色，室溫，暗處3h3h。21 20mmol/L EDTA21 20mmol/L EDTA，pH8.0pH8.0終止顯色。終止顯色。22 22 甘油明膠直接封片。甘油明膠直接封片。2 2 酶促生物素標記酶促生物素標記cRNAcRNA探針的應用探針的應用原理：原理：酶

35、促生物素標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加酶促生物素標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針DNA DNA 中，制成標記探針，中，制成標記探針，敏感度高于化學修飾法，但操作程序復雜，產(chǎn)量低，成本高。敏感度高于化學修飾法，但操作程序復雜，產(chǎn)量低，成本高。反應步驟如下：反應步驟如下： 用用PBSPBS沖洗黏附有切片的載玻片。沖洗黏附有切片的載玻片。 將載玻片浸入將載玻片浸入0.3%H0.3%H2 2O O2 2，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。 PBS PBS洗洗2 23min3min，加入抗生物素血清和正常山

36、羊血清，室，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫溫1h1h或或44過夜。過夜。 PBS PBS洗洗2 23min3min。 加生物素化室溫加生物素化室溫30min30min孵育。孵育。 PBS PBS洗洗2 23min3min。 應用應用ABCABC復合物與等量的復合物與等量的1%1%牛血清白蛋白牛血清白蛋白-PBS-PBS液混合，室液混合，室 溫孵育溫孵育1h1h。 PBS PBS洗洗2 23min3min。 DAB DAB溶液孵育溶液孵育3-15min3-15min。 水洗，復染，脫水，透明和以甘油水洗，復染，脫水，透明和以甘油/PBS/PBS或或DPXDPX封固。封固。地高辛標記地高辛標

37、記cRNAcRNA探針的應探針的應用用地高辛標記地高辛標記cRNAcRNA探針的應用探針的應用原理：原理： 地高辛（地高辛（DigDig）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無交叉反應，地高辛標記于其抗體與其它任何固醇類似物無交叉反應，地高辛標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTPdUTP）上形成）上形成Dig-11-dUTPDig-11-dUTP。通過。通過隨即引物或缺口平移法，將隨即引物或缺口平移法，將Dig-11-dUTPDig-11-dUTP與探針的核酸分子與探針的核酸分子相連，構(gòu)成相連，構(gòu)成Dig-

38、Dig-配基標記的核酸探針。配基標記的核酸探針。 將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的抗地高辛抗體結(jié)合物作為酶標或熒光標記，再分熒光素的抗地高辛抗體結(jié)合物作為酶標或熒光標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以達到檢測目的。別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以達到檢測目的。 常用的免疫酶學檢測方法：常用的免疫酶學檢測方法： Dig-HRPDig-HRP檢測系統(tǒng)：檢測系統(tǒng)： 以以DAB/HDAB/H2 2O O2 2為

39、底物，結(jié)果為棕色；為底物，結(jié)果為棕色； 以以4-4-氯氯-1-1-萘酚萘酚/ H/ H2 2O O2 2為底物，結(jié)果為藍色。為底物，結(jié)果為藍色。 Dig-AKPDig-AKP檢測系統(tǒng)：檢測系統(tǒng)： 以以BCIP/NBTBCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍紫色沉淀。為底物，結(jié)果為藍紫色沉淀。 AKPAKP靈敏度和分辨率較靈敏度和分辨率較HRPHRP高，但高，但HRPHRP的優(yōu)點為廉價、穩(wěn)定。的優(yōu)點為廉價、穩(wěn)定。地高辛標記的核酸探針較穩(wěn)定，地高辛標記的核酸探針較穩(wěn)定，-20-20儲存可達儲存可達2 2年，隨時可以年，隨時可以取用，但在現(xiàn)實應用中，人們?nèi)圆捎眯迈r的地高辛標記取用，但在現(xiàn)實應用中，人們?nèi)圆捎?/p>

40、新鮮的地高辛標記3-63-6個個月以內(nèi)的核酸探針。為節(jié)省核酸探針的用量，凡使用過的含有月以內(nèi)的核酸探針。為節(jié)省核酸探針的用量，凡使用過的含有探針的雜交液也可反復多次使用。探針的雜交液也可反復多次使用。地高辛標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點，對人體無害，不受地高辛標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點，對人體無害，不受半衰期限制，探針可長期保存。與生物素標記探針相比，地高半衰期限制，探針可長期保存。與生物素標記探針相比，地高辛探針不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。辛探針不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。 由于地高辛標記由于地高辛標記cRNAcRNA探針在原位雜交細胞化學中已愈來愈得到探針在原位雜交細胞化學中已愈來愈得到廣泛的應用，我們在基本方法中較詳細的敘述其操作過程廣泛的應用，我們在基本方法中較詳細的敘述其操作過程 。地高辛探針的應用地高辛探針的應用 基本操作步驟：基本操作步驟： 1 1）組織處理）組織處理 冷凍切片：冷凍切片：切片貼在預先清潔、高溫處理并涂以粘附劑切片貼在預先清潔、高溫處理并涂以粘附劑的載玻片上，先在的載玻片上，先在3737預干燥預干燥4h4h，然后置于，然后置于3737烤箱中過烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片在夜。經(jīng)過上述處理的切片在-20-20可保存周，在可保存周，在- -7070可保存數(shù)月之久，也有報告可保存數(shù)年之久的，但仍