動力學(xué)親和力

1、動力學(xué)/親和力分析基礎(chǔ)知識介紹Biacore Training2什么是動力學(xué)和親和力?動力學(xué) 反應(yīng)發(fā)生的速度? 與時間相關(guān) 結(jié)合 分子間結(jié)合的速度 解離 分子復(fù)合物解離的速度 動力學(xué)分析能夠確定在一個給定的時間跨度內(nèi)，分子復(fù)合物是否能夠結(jié)合還是完全解離親和力 分子間結(jié)合的強度? 與時間無關(guān) 親和力分析能夠確定反應(yīng)處于平衡狀態(tài)（結(jié)合與解離形成動態(tài)平衡）時，復(fù)合物的濃度Biacore Training3動力學(xué)分析和親和力分析的相關(guān)性?細胞本身就是一個動態(tài)系統(tǒng) 極少處在平衡狀態(tài)同樣的親和力，不同的反應(yīng)，動力學(xué)數(shù)據(jù)一般并不相同 動力學(xué)數(shù)據(jù)提供了更多的信息Biacore Training4同樣的親和力，

2、不同的動力學(xué)所有4個化合物的親和力數(shù)據(jù)相同 KD = 10 nM = 10-8 M結(jié)合動力學(xué)常數(shù)可有不同數(shù)量級范圍內(nèi)的改變，本例中為4個數(shù)量級kon koff (M-1s-1) (s-1)106 10-2105 10-3104 10-4103 10-5時間濃度 = 1000 nM30 min60 min所有靶位點被占據(jù)Response時間30 min60 min濃度 = 100 nMBiacore Training5用Biacore獲得動力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)的3種方式監(jiān)測結(jié)合和解離速率 親和力 動力學(xué) 監(jiān)測穩(wěn)態(tài)水平 親和力 動力學(xué) 監(jiān)測溶液中游離的分析物分子 親和力 動力學(xué) Biacore Tra

3、ining61:1 動力學(xué)模型的速率方程ABABABkakdABAssociation:Dissociation:Net rate equation:whereka-1s -1 -1M s kddissociation rate constantassociation rate constantkdABAB-ddtkaABddtABkakdABABddtABM/sM-1s-1s-1MMMBiacore Training7平衡常數(shù)(Equilibrium constants)The equilibrium constants:-1M the constantequilibrium associa

4、tionthe dissociation constantequilibriumkakdkdkaABA BMABA BAt equilibrium:AssociationDissociationkdABABkas-1M s-1-1MMMKAKDBiacore Training8Biacore中的平衡和動力學(xué)A 是溶液中的待分析物(analyte) A的游離濃度由流動系統(tǒng)控制，在檢測中保持恒定AB 是結(jié)合復(fù)合物 AB的濃度可通過直接檢測RU得到，表示為RB 是偶聯(lián)在傳感芯片上的分子 總濃度能用 RU表示, 相當(dāng)于最大結(jié)合反應(yīng)理論值 Rmax B的游離濃度即 Rmax-R A + B AB kak

5、d我們無需知道復(fù)合物和配體的實際濃度！Biacore Training9Biacore中的速率和親和力ABkakdABkakdABABddtABRU/sMRURUdRdtkakdmax RRRCAB has one binding site and reacts with immobilized ligandhas n identical and independent binding sitess-1M s-1-1Biacore Training10傳感圖中的變量和表示方式Biacore Training11傳感圖中的信息Rmax, Req 和 KD的關(guān)系Biacore Training12

6、物質(zhì)遷移（Mass Transport）在Biacore中，和動力學(xué)測量相關(guān)的一種現(xiàn)象 描述生物分子從溶液向芯片表面轉(zhuǎn)移的過程 和生物分子間的相互作用無關(guān)在Biacore中，所檢測到的反應(yīng)速率是物質(zhì)遷移現(xiàn)象和分子間的相互結(jié)合作用的綜合結(jié)果 通過使用合適的反應(yīng)環(huán)境，質(zhì)量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的影響能夠被最大程度地控制Biacore Training13什么是物質(zhì)遷移?擴散的物質(zhì)遷移 單一樣品在靜態(tài)的系統(tǒng)中分析物梯度經(jīng)過一定的時間，靠近芯片表面的分析物的濃度將會逐漸降低，并逐漸在溶液中形成一個分析物濃度梯度Biacore Training14分析物的消耗和補充 分析物由持續(xù)流動的樣品所補充 隨著流速的下降，擴散

7、效應(yīng)會逐漸占據(jù)主導(dǎo)性、 在配體/分析物表面發(fā)生的生物分子相互作用流動相高度流動相高度擴散距離擴散距離123Biacore Training15減少物質(zhì)遷移的影響 更低的 Rmax (ligand密度)高進樣流速 高流速有效減少了擴散距離可選的預(yù)設(shè)分析模式中已考慮了物質(zhì)遷移效應(yīng)實驗設(shè)計Biacore Training17實驗設(shè)計穩(wěn)態(tài)實驗-分析親和力通過一系列不同的分析物濃度，確定達到穩(wěn)態(tài)的結(jié)合水平較高的偶聯(lián)水平濃度范圍至少應(yīng)該覆蓋芯片表面的 20-80% 飽和度(RMAX)設(shè)置對照芯片表面設(shè)置至少一個濃度的樣品重復(fù)設(shè)置零濃度樣品Biacore Training18必須考慮的幾個因素動力學(xué)分析試劑純度偶聯(lián)方法偶聯(lián)水平配體活性樣品流速分析物濃度范圍Biacore Training19分析物濃度動力學(xué)分析濃度應(yīng)該覆蓋所有范圍的結(jié)合曲線（低濃度飽和濃度）設(shè)置至少一個濃度的樣品重復(fù)設(shè)置零濃度樣品Biacore Training20總結(jié)親和力分析 獲得親和力平衡常數(shù) 適合分析結(jié)合和