人源化單克隆抗體的構建技術(共6頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上人源化單克隆抗體的構建技術摘要：單克隆抗體從問世到現(xiàn)在已廣泛應用于臨床，經(jīng)歷了一段曲折的發(fā)展歷程。其中人源化抗體是一個重要的里程碑，并伴隨著一系列重大的技術革新，如PCR 技術、抗體庫技術、轉基因動物等?？贵w技術從最初的嵌合抗體、改型抗體逐漸發(fā)展為今天的人源化抗體。本文綜述了人源化單克隆抗體的構建技術。關鍵詞：人源化，單克隆抗體，構建從20世紀70年代英國學者Milstein和德國學者Kohler利用細胞融合技術首次成功地制備出單克隆抗體以來1，單克隆抗體在醫(yī)學、生物學、免疫學等諸多學科中發(fā)揮了巨大的作用。單克隆抗體可用于分析抗原的細微結構及檢驗抗原抗體未知的結構關系

2、，還可用于分離、純化特定分子抗原，甚至用于臨床疾病的診斷和治療等。然而，單克隆抗體技術在臨床治療應用中的進展卻很慢，主要原因是目前單克隆抗體大多是鼠源性的，而鼠源性單克隆抗體應用于人體治療時存在諸多問題：一是不能有效地激活人體中補體和Fc受體相關的效應系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。因此，在保持對特異性抗原表位高親和力的基礎上進行人源化改造，減少異源抗體的免疫原性，成為單克隆抗體研究的重點2。隨著對抗體基因的研究和DNA分子重組技術的應用，通過基因改造獲得特異性抗體成為可能。

3、1989年Huse等首次構建了抗體基因庫，從而使抗體的研究從細胞水平進入到分子水平，并推動了第3代抗體基因工程抗體技術的發(fā)展。至此，抗體的產(chǎn)生技術經(jīng)歷了三個階段：經(jīng)典免疫方法產(chǎn)生的異源多克隆抗體；細胞工程產(chǎn)生的鼠源單克隆抗體及基因工程產(chǎn)生的人源單克隆抗體。人源化抗體就是指抗體的可變區(qū)部分（即Vh和Vl區(qū)）或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應。人源化抗體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發(fā)展為今天的人源化抗體。1 嵌合抗體的構建抗體分子與抗原結合特異性由L鏈和H鏈V區(qū)決定，抗體C區(qū)可作為異源蛋白誘發(fā)免疫反應，產(chǎn)生抗小鼠抗體（human a

4、nti-mouse antibody，HAMA）。將小鼠單克隆抗體C區(qū)用人抗體C區(qū)代替而拼接成嵌合抗體(chimeric antibody)，這樣表達的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個抗體分子的近2/3部分都是人源的。這樣產(chǎn)生的抗體，減少了異源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結合抗原的能力。嵌合抗體(chimeric antibody) 屬第一代人源化抗體，有60%70%的人源區(qū)域，是目前研究較多也較為成熟的基因工程抗體，人鼠嵌合抗體基因工程改造策略主要包括：（1）從鼠雜交瘤中克隆V區(qū)基因。（2）選擇合適的人C區(qū)基因。（3）構建載體并在一定表達系統(tǒng)中表達根據(jù)嵌

5、合抗體H鏈和L鏈基因是否克隆、表達與同一載體與否，可將基因工程嵌合抗體的表達分為共轉染表達模式(co-transfection model)和單載體轉染表達模式(single vector transfection model)。根據(jù)所需達到的功能，人重鏈的恒定區(qū)可為IgA、IgD、IgE、IgG 或IgM中的一種。通常，人源抗體包括嵌合抗體常采用IgG，因其對不同的亞基都合適。1986 年，Jones3等用寡核苷酸構建出小鼠抗半抗原4-羥基-3-硝基苯乙?；核?NP)的免疫球蛋白VH 基因，其中編碼VH 互補決定區(qū)(CDR)的序列來自小鼠的單抗，編碼構架區(qū)(FR) 的序列來自與鼠抗NP 單

6、抗的FR 同源程度較高的人骨髓瘤蛋白，通過人抗NP 重鏈可變區(qū)基因(hVHNP) 與含有人重鏈恒定區(qū)序列的表達載體連接，并轉染到只分泌抗NP輕鏈的小鼠雜交瘤細胞J558L中， 結果獲得可特異結合NP的人源化嵌合抗體?？迪驏|等4從分泌抗人甲狀腺球蛋白的雜交瘤細胞株hTg-60中提取總RNA，逆轉錄-酶鏈聚合反應(RT-PCR)擴增出鼠源性單克隆抗體hTg-60的VH及VL基因，經(jīng)基因測序分析，設計出人源化抗體的基因引物，獲得抗Tg單克隆抗體人源化VH及VL基因并將其克隆入真核表達載體，轉染中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，表達人源化嵌合hTg抗體。成功獲得了6株能穩(wěn)定分泌抗hTg人源化嵌合抗體的細胞株

7、。2 CDR 移植抗體的構建盡管嵌合抗體Fc段換成了人源化，但V區(qū)保留的鼠源性保守序列仍能誘發(fā)HAMA，因此嵌合抗體不能徹底地消除鼠免疫原性，還需進一步對鼠源抗體的V區(qū)進行改造?？贵wV區(qū)由CDR和骨架區(qū)（FR）組成。CDR是抗體識別和結合抗原的區(qū)域，直接決定了抗體的特異性，而骨架區(qū)序列及其立體結構較為保守，是嵌合抗體誘發(fā)HAMA的主要原因，因此將鼠單克隆抗體CDR移植到人單克隆抗體的V區(qū)框架上，使人單克隆抗體獲得鼠單克隆抗體結合特異性，并減少異源性。這樣獲得的改型抗體也稱CDR移植抗體(CDR grafting antibody)。然而，抗原雖然主要和抗體的CDR接觸，但FR區(qū)也常參與作用，影

8、響CDR的空間構型。因此換成人源FR區(qū)后，這種鼠源CDR和人源FR相嵌的V區(qū)，可能改變了單抗原有的CDR構型，往往明顯降低抗原-抗體反應的親和力， 甚至喪失與抗原結合的能力5。因此解決骨架區(qū)對CDR的影響，對CDR序列和框架結構進行分析和加工是十分重要的。V區(qū)CDR移植的設計原則是：（1）以Kabat的方法為基礎選擇頂端環(huán)狀結構序列和緊鄰CDR兩側的骨架序列：（2）對骨架區(qū)中影響抗原結合部位的氨基酸殘基改為親本鼠單克隆抗體的殘基；（3）對抗體V區(qū)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫分析，選擇與親本鼠單克隆抗體同源性高的序列；（4）保留V區(qū)N末端氨基酸序列，尤其是L鏈V區(qū)N末端序列。將人改型V區(qū)基因與人Ig C區(qū)基

9、因連接，構成完整的人免疫球蛋白基因即可進行表達。Couto 等6首先利用計算機模建和實驗探索找到一個最簡模板。以此模板對抗乳腺表皮抗原BA46 的抗體Mc3 成功地進行了人源化。由于人源化抗體( 嵌合或CDR 移植抗體) 內(nèi)還含有10%30%的鼠源蛋白，因而在臨床應用時，或多或少地存在一些免疫排斥反應，沒有達到治療性抗體發(fā)展的最終目標抗體完全人源化。3 完全人源化抗體的構建全人源化抗體是指將人類抗體基因通過轉基因或轉染色體技術，將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體完全人源化的目的。目前生產(chǎn)完全人源化抗體的方法主要包括抗體庫技術和轉基因技術

10、，這2 種制備技術競爭至今，孰優(yōu)孰劣尚未可知7。3.1 抗體庫技術噬菌體抗體庫技術的出現(xiàn)開創(chuàng)了一條簡便快捷的基因工程抗體生產(chǎn)路線，為人源化抗體的制備提供了新途徑。噬菌體抗體庫( phage antibody library) 技術是20 世紀90 年代初期抗體工程領域的重大研究進展，它結合了噬菌體展示與抗體組合文庫技術，把外源的DNA 插入噬菌體編碼的外殼蛋白p或p的基因中，使外源DNA 片段對應的表達產(chǎn)物融合在噬菌體外殼蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌體庫的產(chǎn)生、結合抗原的展示抗體的篩選、展示有高親和力抗體的噬菌體擴增、有高親和力的抗體的分離和定性的具體步驟8。其基本方法是從人外周血淋巴細

11、胞或脾細胞中提取RNA 或基因組DNA，設計核苷酸引物，用PCR方法克隆人全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因組裝到噬菌體表達載體內(nèi)，與噬菌體外殼蛋白基因融合，感染大腸桿菌并使抗體片段表達于噬菌體。然后利用抗原抗體特異性結合而篩選出所需要的抗體，并進行克隆性擴增，獲得可溶性抗體片段(如Fab、scFV及dsFv等) ，即噬菌體抗體9。1989 年美國Scripps 研究所Lerner 實驗室首次應用噬菌體表面展示技術構建了噬菌體抗體庫10。該技術在制備基因工程抗體方面發(fā)展迅速，國內(nèi)外已有人源或鼠源抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbB2、gp120等噬菌體抗體的報道。Vitaliti 等11利用噬

12、菌體抗體庫技術制備了抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 的scFv，能明顯減慢腫瘤的生長。何小鵑12、朱建高13等利用該技術成功構建了大腸癌噬菌體抗體庫和鼻咽癌抗獨特型抗體庫，并從中篩選出全人源抗大腸癌單鏈抗體和鼻咽癌抗獨特型單鏈抗體。我國研究者成功地從SARS病毒噬菌體抗體庫中篩選出具有中和活性的抗S 蛋白Fab 片段抗體，體外實驗證明其可部分中和SARS 病毒活性，能明顯延緩細胞病變的過程14。3.2 轉基因技術全人抗體還可以通過小鼠的基因工程免疫方法獲得。產(chǎn)生一免疫反應的基因工程敲除鼠，然后用雜交瘤技術使小鼠的脾細胞或淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合。通過滅活內(nèi)源性的小鼠抗體基因，然后引進人源抗體基

13、因片段，當對人源抗體免疫的時候就可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生全人抗體分子。另一種方法是將人抗體基因微位點轉入小鼠體內(nèi)細胞，轉染色體小鼠的免疫抗原基因環(huán)境和人類非常相似。還有一種不同的方法是向免疫供體或混合性嚴重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴細胞，通過抗原免疫使小鼠脾細胞融合骨髓瘤細胞15。 轉基因小鼠制備的人抗體，其功效優(yōu)于其他技術生產(chǎn)的抗正常人體蛋白單抗。小鼠識別抗原和動員抗原的抗體系統(tǒng)仍保持完整，容易把人體蛋白識別為異物。此外，由于抗體是體內(nèi)產(chǎn)生的，經(jīng)歷了正常裝配和成熟過程，從而保證成品具有較高的靶結合親和力。但轉基因小鼠也存在一些缺陷，即轉基因通常有體細胞突變和其他獨特的序列，導致不完整的人序列；而且

14、，由于抗體是在小鼠體內(nèi)裝配，因而產(chǎn)生的單抗具有鼠糖基化的模式，所以這些單抗最終并不是全人源化的。需要進一步研究以改進此技術。4 總結限于嵌合抗體和改型抗體仍保留部分免疫原性，仍會導致部分反應，現(xiàn)在研究者已經(jīng)漸漸開始轉向更安全有效的全人抗體。最早制備全人抗體的方法是采用噬菌體表面呈現(xiàn)技術篩選獲得的針對目標抗原的人抗體可變區(qū)基因，再采用基因工程技術進行重組表達，但是這種全人抗體往往親和力較低?，F(xiàn)在，全人抗體幾乎完全轉向轉基因小鼠產(chǎn)生。為了使用更低廉的生產(chǎn)成本獲得更大的生產(chǎn)能力，研究者發(fā)展了動物乳腺反應器技術， 將抗體基因轉移至山羊或牛的體內(nèi)，特異地在乳腺中表達，表達的抗體被分泌到動物的乳汁中從而可

15、被收集純化16。如果能更好地解決畜群的傳代問題，轉基因動物生產(chǎn)人源化抗體的技術必將得到廣泛的應用，極有可能代替動物細胞培養(yǎng)，成為大規(guī)模生產(chǎn)人源化抗體藥物的常規(guī)技術。參考文獻1 Milstein KG. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificity J. Nature, 1975, 256(7): 495.2 朱學泰,謝溱,馬瑞君.單克隆抗體制備技術研究進展J.甘肅科技,2005,21(3): 108.3 Jones PT, Dear PH, Foote J. Replacing the

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