人源化單克隆抗體的構(gòu)建技術(shù)(共6頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上人源化單克隆抗體的構(gòu)建技術(shù)摘要：?jiǎn)慰寺】贵w從問(wèn)世到現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于臨床，經(jīng)歷了一段曲折的發(fā)展歷程。其中人源化抗體是一個(gè)重要的里程碑，并伴隨著一系列重大的技術(shù)革新，如PCR 技術(shù)、抗體庫(kù)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等?？贵w技術(shù)從最初的嵌合抗體、改型抗體逐漸發(fā)展為今天的人源化抗體。本文綜述了人源化單克隆抗體的構(gòu)建技術(shù)。關(guān)鍵詞：人源化，單克隆抗體，構(gòu)建從20世紀(jì)70年代英國(guó)學(xué)者M(jìn)ilstein和德國(guó)學(xué)者Kohler利用細(xì)胞融合技術(shù)首次成功地制備出單克隆抗體以來(lái)1，單克隆抗體在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多學(xué)科中發(fā)揮了巨大的作用。單克隆抗體可用于分析抗原的細(xì)微結(jié)構(gòu)及檢驗(yàn)抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)系

2、，還可用于分離、純化特定分子抗原，甚至用于臨床疾病的診斷和治療等。然而，單克隆抗體技術(shù)在臨床治療應(yīng)用中的進(jìn)展卻很慢，主要原因是目前單克隆抗體大多是鼠源性的，而鼠源性單克隆抗體應(yīng)用于人體治療時(shí)存在諸多問(wèn)題：一是不能有效地激活人體中補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。因此，在保持對(duì)特異性抗原表位高親和力的基礎(chǔ)上進(jìn)行人源化改造，減少異源抗體的免疫原性，成為單克隆抗體研究的重點(diǎn)2。隨著對(duì)抗體基因的研究和DNA分子重組技術(shù)的應(yīng)用，通過(guò)基因改造獲得特異性抗體成為可能。

3、1989年Huse等首次構(gòu)建了抗體基因庫(kù)，從而使抗體的研究從細(xì)胞水平進(jìn)入到分子水平，并推動(dòng)了第3代抗體基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展。至此，抗體的產(chǎn)生技術(shù)經(jīng)歷了三個(gè)階段：經(jīng)典免疫方法產(chǎn)生的異源多克隆抗體；細(xì)胞工程產(chǎn)生的鼠源單克隆抗體及基因工程產(chǎn)生的人源單克隆抗體。人源化抗體就是指抗體的可變區(qū)部分（即Vh和Vl區(qū)）或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對(duì)人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)。人源化抗體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發(fā)展為今天的人源化抗體。1 嵌合抗體的構(gòu)建抗體分子與抗原結(jié)合特異性由L鏈和H鏈V區(qū)決定，抗體C區(qū)可作為異源蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗小鼠抗體（human a

4、nti-mouse antibody，HAMA）。將小鼠單克隆抗體C區(qū)用人抗體C區(qū)代替而拼接成嵌合抗體(chimeric antibody)，這樣表達(dá)的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個(gè)抗體分子的近2/3部分都是人源的。這樣產(chǎn)生的抗體，減少了異源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。嵌合抗體(chimeric antibody) 屬第一代人源化抗體，有60%70%的人源區(qū)域，是目前研究較多也較為成熟的基因工程抗體，人鼠嵌合抗體基因工程改造策略主要包括：（1）從鼠雜交瘤中克隆V區(qū)基因。（2）選擇合適的人C區(qū)基因。（3）構(gòu)建載體并在一定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)根據(jù)嵌

5、合抗體H鏈和L鏈基因是否克隆、表達(dá)與同一載體與否，可將基因工程嵌合抗體的表達(dá)分為共轉(zhuǎn)染表達(dá)模式(co-transfection model)和單載體轉(zhuǎn)染表達(dá)模式(single vector transfection model)。根據(jù)所需達(dá)到的功能，人重鏈的恒定區(qū)可為IgA、IgD、IgE、IgG 或IgM中的一種。通常，人源抗體包括嵌合抗體常采用IgG，因其對(duì)不同的亞基都合適。1986 年，Jones3等用寡核苷酸構(gòu)建出小鼠抗半抗原4-羥基-3-硝基苯乙酰基己酸(NP)的免疫球蛋白VH 基因，其中編碼VH 互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列來(lái)自小鼠的單抗，編碼構(gòu)架區(qū)(FR) 的序列來(lái)自與鼠抗NP 單

6、抗的FR 同源程度較高的人骨髓瘤蛋白，通過(guò)人抗NP 重鏈可變區(qū)基因(hVHNP) 與含有人重鏈恒定區(qū)序列的表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)染到只分泌抗NP輕鏈的小鼠雜交瘤細(xì)胞J558L中， 結(jié)果獲得可特異結(jié)合NP的人源化嵌合抗體?？迪驏|等4從分泌抗人甲狀腺球蛋白的雜交瘤細(xì)胞株hTg-60中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出鼠源性單克隆抗體hTg-60的VH及VL基因，經(jīng)基因測(cè)序分析，設(shè)計(jì)出人源化抗體的基因引物，獲得抗Tg單克隆抗體人源化VH及VL基因并將其克隆入真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，表達(dá)人源化嵌合hTg抗體。成功獲得了6株能穩(wěn)定分泌抗hTg人源化嵌合抗體的細(xì)胞株

7、。2 CDR 移植抗體的構(gòu)建盡管嵌合抗體Fc段換成了人源化，但V區(qū)保留的鼠源性保守序列仍能誘發(fā)HAMA，因此嵌合抗體不能徹底地消除鼠免疫原性，還需進(jìn)一步對(duì)鼠源抗體的V區(qū)進(jìn)行改造?？贵wV區(qū)由CDR和骨架區(qū)（FR）組成。CDR是抗體識(shí)別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決定了抗體的特異性，而骨架區(qū)序列及其立體結(jié)構(gòu)較為保守，是嵌合抗體誘發(fā)HAMA的主要原因，因此將鼠單克隆抗體CDR移植到人單克隆抗體的V區(qū)框架上，使人單克隆抗體獲得鼠單克隆抗體結(jié)合特異性，并減少異源性。這樣獲得的改型抗體也稱CDR移植抗體(CDR grafting antibody)。然而，抗原雖然主要和抗體的CDR接觸，但FR區(qū)也常參與作用，影

8、響CDR的空間構(gòu)型。因此換成人源FR區(qū)后，這種鼠源CDR和人源FR相嵌的V區(qū)，可能改變了單抗原有的CDR構(gòu)型，往往明顯降低抗原-抗體反應(yīng)的親和力， 甚至喪失與抗原結(jié)合的能力5。因此解決骨架區(qū)對(duì)CDR的影響，對(duì)CDR序列和框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和加工是十分重要的。V區(qū)CDR移植的設(shè)計(jì)原則是：（1）以Kabat的方法為基礎(chǔ)選擇頂端環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列和緊鄰CDR兩側(cè)的骨架序列：（2）對(duì)骨架區(qū)中影響抗原結(jié)合部位的氨基酸殘基改為親本鼠單克隆抗體的殘基；（3）對(duì)抗體V區(qū)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)分析，選擇與親本鼠單克隆抗體同源性高的序列；（4）保留V區(qū)N末端氨基酸序列，尤其是L鏈V區(qū)N末端序列。將人改型V區(qū)基因與人Ig C區(qū)基

9、因連接，構(gòu)成完整的人免疫球蛋白基因即可進(jìn)行表達(dá)。Couto 等6首先利用計(jì)算機(jī)模建和實(shí)驗(yàn)探索找到一個(gè)最簡(jiǎn)模板。以此模板對(duì)抗乳腺表皮抗原BA46 的抗體Mc3 成功地進(jìn)行了人源化。由于人源化抗體( 嵌合或CDR 移植抗體) 內(nèi)還含有10%30%的鼠源蛋白，因而在臨床應(yīng)用時(shí)，或多或少地存在一些免疫排斥反應(yīng)，沒(méi)有達(dá)到治療性抗體發(fā)展的最終目標(biāo)抗體完全人源化。3 完全人源化抗體的構(gòu)建全人源化抗體是指將人類抗體基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動(dòng)物中，使動(dòng)物表達(dá)人類抗體，達(dá)到抗體完全人源化的目的。目前生產(chǎn)完全人源化抗體的方法主要包括抗體庫(kù)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)

10、，這2 種制備技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)至今，孰優(yōu)孰劣尚未可知7。3.1 抗體庫(kù)技術(shù)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)開(kāi)創(chuàng)了一條簡(jiǎn)便快捷的基因工程抗體生產(chǎn)路線，為人源化抗體的制備提供了新途徑。噬菌體抗體庫(kù)( phage antibody library) 技術(shù)是20 世紀(jì)90 年代初期抗體工程領(lǐng)域的重大研究進(jìn)展，它結(jié)合了噬菌體展示與抗體組合文庫(kù)技術(shù)，把外源的DNA 插入噬菌體編碼的外殼蛋白p或p的基因中，使外源DNA 片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體外殼蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌體庫(kù)的產(chǎn)生、結(jié)合抗原的展示抗體的篩選、展示有高親和力抗體的噬菌體擴(kuò)增、有高親和力的抗體的分離和定性的具體步驟8。其基本方法是從人外周血淋巴細(xì)

11、胞或脾細(xì)胞中提取RNA 或基因組DNA，設(shè)計(jì)核苷酸引物，用PCR方法克隆人全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因組裝到噬菌體表達(dá)載體內(nèi)，與噬菌體外殼蛋白基因融合，感染大腸桿菌并使抗體片段表達(dá)于噬菌體。然后利用抗原抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆性擴(kuò)增，獲得可溶性抗體片段(如Fab、scFV及dsFv等) ，即噬菌體抗體9。1989 年美國(guó)Scripps 研究所Lerner 實(shí)驗(yàn)室首次應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建了噬菌體抗體庫(kù)10。該技術(shù)在制備基因工程抗體方面發(fā)展迅速，國(guó)內(nèi)外已有人源或鼠源抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbB2、gp120等噬菌體抗體的報(bào)道。Vitaliti 等11利用噬

12、菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備了抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 的scFv，能明顯減慢腫瘤的生長(zhǎng)。何小鵑12、朱建高13等利用該技術(shù)成功構(gòu)建了大腸癌噬菌體抗體庫(kù)和鼻咽癌抗獨(dú)特型抗體庫(kù)，并從中篩選出全人源抗大腸癌單鏈抗體和鼻咽癌抗獨(dú)特型單鏈抗體。我國(guó)研究者成功地從SARS病毒噬菌體抗體庫(kù)中篩選出具有中和活性的抗S 蛋白Fab 片段抗體，體外實(shí)驗(yàn)證明其可部分中和SARS 病毒活性，能明顯延緩細(xì)胞病變的過(guò)程14。3.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)全人抗體還可以通過(guò)小鼠的基因工程免疫方法獲得。產(chǎn)生一免疫反應(yīng)的基因工程敲除鼠，然后用雜交瘤技術(shù)使小鼠的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過(guò)滅活內(nèi)源性的小鼠抗體基因，然后引進(jìn)人源抗體基

13、因片段，當(dāng)對(duì)人源抗體免疫的時(shí)候就可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生全人抗體分子。另一種方法是將人抗體基因微位點(diǎn)轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染色體小鼠的免疫抗原基因環(huán)境和人類非常相似。還有一種不同的方法是向免疫供體或混合性嚴(yán)重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴細(xì)胞，通過(guò)抗原免疫使小鼠脾細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞15。 轉(zhuǎn)基因小鼠制備的人抗體，其功效優(yōu)于其他技術(shù)生產(chǎn)的抗正常人體蛋白單抗。小鼠識(shí)別抗原和動(dòng)員抗原的抗體系統(tǒng)仍保持完整，容易把人體蛋白識(shí)別為異物。此外，由于抗體是體內(nèi)產(chǎn)生的，經(jīng)歷了正常裝配和成熟過(guò)程，從而保證成品具有較高的靶結(jié)合親和力。但轉(zhuǎn)基因小鼠也存在一些缺陷，即轉(zhuǎn)基因通常有體細(xì)胞突變和其他獨(dú)特的序列，導(dǎo)致不完整的人序列；而且

14、，由于抗體是在小鼠體內(nèi)裝配，因而產(chǎn)生的單抗具有鼠糖基化的模式，所以這些單抗最終并不是全人源化的。需要進(jìn)一步研究以改進(jìn)此技術(shù)。4 總結(jié)限于嵌合抗體和改型抗體仍保留部分免疫原性，仍會(huì)導(dǎo)致部分反應(yīng)，現(xiàn)在研究者已經(jīng)漸漸開(kāi)始轉(zhuǎn)向更安全有效的全人抗體。最早制備全人抗體的方法是采用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選獲得的針對(duì)目標(biāo)抗原的人抗體可變區(qū)基因，再采用基因工程技術(shù)進(jìn)行重組表達(dá)，但是這種全人抗體往往親和力較低?，F(xiàn)在，全人抗體幾乎完全轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。為了使用更低廉的生產(chǎn)成本獲得更大的生產(chǎn)能力，研究者發(fā)展了動(dòng)物乳腺反應(yīng)器技術(shù)， 將抗體基因轉(zhuǎn)移至山羊或牛的體內(nèi)，特異地在乳腺中表達(dá)，表達(dá)的抗體被分泌到動(dòng)物的乳汁中從而可

15、被收集純化16。如果能更好地解決畜群的傳代問(wèn)題，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人源化抗體的技術(shù)必將得到廣泛的應(yīng)用，極有可能代替動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，成為大規(guī)模生產(chǎn)人源化抗體藥物的常規(guī)技術(shù)。參考文獻(xiàn)1 Milstein KG. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificity J. Nature, 1975, 256(7): 495.2 朱學(xué)泰,謝溱,馬瑞君.單克隆抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展J.甘肅科技,2005,21(3): 108.3 Jones PT, Dear PH, Foote J. Replacing the

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