成都大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目申請表

1、附件1項目編號 _成 都 大 學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目申請表項目名稱：基于生物工程技術(shù)的卷葉貝母有效組分生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究項目負(fù)責(zé)人：陳然所在學(xué)院、年級：生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院生物工程07級1班聯(lián)系電話子郵件：286804486指導(dǎo)教師：王躍華項目起止時間：起于：2000年10月止于：2012年10月填表日期：二九 年 十 月 十九日成都大學(xué)教務(wù)處制填表說明1、成都大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃”項目申請表由立項負(fù)責(zé)人逐項認(rèn)真填寫，填寫內(nèi)容必須實事求是，表達明確嚴(yán)謹(jǐn)，空缺項要填“無”。并用A4紙打印，于左側(cè)裝訂成冊。2、申請參加成都大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃”項目團隊人數(shù)一般以23

2、人為主，最多不得超過3人。3、項目負(fù)責(zé)人填寫完申請表后，必須請指導(dǎo)教師審核，并填寫意見和簽名。4、成都大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃”項目申請表由申報學(xué)生所在學(xué)院初審，簽署意見后（一式兩份），由學(xué)院教務(wù)辦一起報送教務(wù)處實踐教學(xué)管理科。5、如填表有不明事宜，請與教務(wù)處實踐教學(xué)管理科聯(lián)系和咨詢。聯(lián)系電話：84616053項目名稱基于生物工程技術(shù)的卷葉貝母有效組分生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究申請經(jīng)費項目負(fù)責(zé)人姓 名學(xué) 號所在學(xué)院、專業(yè)班級項目中分工簽字陳然200710511135生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院生物工程07級1班實驗安排、操作、總結(jié)項目成員李頔200710511143生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院生物工程07級1班數(shù)據(jù)整理，實驗操作舒平

3、200710511138生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院生物工程07級1班實驗準(zhǔn)備，操作劉毓均200710511214生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院生物工程07級1班實驗準(zhǔn)備，操作指導(dǎo)教師情況姓 名王躍華職稱教授學(xué)歷/學(xué)位碩士所在學(xué)院生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院E-mail地址Wangyaohua888聯(lián)系電話139800217901.課題來源：科研 教學(xué) 設(shè)計 工程 自選 其他（ ）2.課題類別：工學(xué) 理學(xué) 文學(xué) 管理 經(jīng)濟 其他（ ）一、 項目簡介和前期基礎(chǔ)：（包括項目簡介300500字；項目前期準(zhǔn)備）1、項目簡介本項目首次將生物工程的組織培養(yǎng)技術(shù)、多倍體誘導(dǎo)技術(shù)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)有機結(jié)合，在離體培養(yǎng)條件下，成功地誘導(dǎo)培育出卷葉貝母有效組分含

4、量高、生長速度快的懸浮培養(yǎng)體系；進一步探明卷葉貝母四倍體懸浮培養(yǎng)物中有效成分的積累動態(tài)和時空分布規(guī)律，并完成對培養(yǎng)物中各化學(xué)物質(zhì)的提取、分離和純化的工藝研究；最終實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)卷葉貝母生物堿和甾體皂甙類藥物有效組分，極大地緩解卷葉貝母藥材市場的緊缺和更有效地保護卷葉貝母野生植物資源。 2、前期基礎(chǔ) 在王躍華教授、孫雁霞博士等的大力指導(dǎo)下，我院師生已成功完成了苦蕎麥、喜樹、川芎、川黃柏、杜仲、板藍(lán)根、紅花、青蒿等的多倍體誘導(dǎo)以及含量提取的研究。我們的團隊也參加了川黃柏系列現(xiàn)代生物工程技術(shù)與示范和名貴中藥材川貝母的四倍體懸浮培養(yǎng)體系的建立課題的研究以及進行了對川貝母總生物堿的含量測定、小白鼠

5、藥理實驗研究，有非常好的動手和動腦能力，為保證課題的順利完成奠定了基礎(chǔ)。實驗室充足的實驗條件以及相關(guān)設(shè)備，為保證項目的完成提供了設(shè)備支持。川貝母含量測定數(shù)據(jù)： 不同外植體生物堿含量外植體類型吸光度總生物堿含量（%）50.25040.163740.27250.1972芽0.17580.1644疏松愈傷組織0.22970.1557褐變0.36000.2624小白鼠藥理實驗數(shù)據(jù)：二、項目方案和研究內(nèi)容：（研究意義與目的、現(xiàn)狀、工作思路、方法及擬解決主要問題等）1、項目應(yīng)用前景   目前卷葉貝母野生資源蘊量不足100萬公斤，每年可供采挖的卷葉貝母資源不足50萬公斤，而市場

6、每年的需求量約400萬公斤，這種供需矛盾導(dǎo)致了卷葉貝母市場價格節(jié)節(jié)攀升。當(dāng)前除一些知名品牌（如川貝枇杷膏、蛇膽川貝液等）目前仍堅持用正品卷葉貝母外，許多中小企業(yè)廣泛采用卷葉貝母的替代品，如太白貝母、湖北貝母、東貝母、浙貝母（小個）、平貝母、伊貝母等，市場上甚至出現(xiàn)了大量偽品，如米貝母、一輪貝母、麗江山慈菇、老鴉瓣、唐菖蒲等直接影響了藥品制劑的質(zhì)量和治療效果，也給臨床用藥安全造成了極大的影響。   卷葉貝母屬于高原瀕危藥材，目前存在人工栽種難度大、藥材生長周期長、有效成分含量低等問題。利用生物技術(shù)建立卷葉貝母高產(chǎn)四倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，可大規(guī)模、快速生產(chǎn)有效成分含量

7、高、質(zhì)量可控的優(yōu)質(zhì)卷葉貝母藥材原料，較好地解決卷葉貝母藥用植物栽培周期長，繁殖較困難的難題；并且該技術(shù)是在無菌條件下進行的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，可排除病菌和蟲害的侵?jǐn)_，嚴(yán)格控制藥材質(zhì)量，完全解決農(nóng)藥殘留和重金屬含量問題，生產(chǎn)出真正意義上的綠色藥物；同時，通過對卷葉貝母離體培養(yǎng)條件的改變，還可進一步篩選出具有明顯生理活性的新物質(zhì)。因此，采用生物技術(shù)生產(chǎn)卷葉貝母中藥材具有非常廣泛的應(yīng)用前景。       2、立項的必要性及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢（1）卷葉貝母資源狀況分析      卷葉

8、貝母Fritillaria cirrhosa D. Don是百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，為名貴的川產(chǎn)道地藥材，堪稱藥中之寶。卷葉貝母有效成分為貝母生物堿和甾體皂甙類?，F(xiàn)代研究表明卷葉貝母為最常用、最有效的止咳化痰藥，常用于肺熱燥咳,干咳少痰,陰虛勞嗽,咯痰帶血。除此之外卷葉貝母在臨床上還可以用于治療肝硬化腹水和小便淋瀝。根據(jù)曹新偉等人的研究表明卷葉貝母中還可能含有核苷類和酚酸類非生物堿活性物質(zhì)，在核苷類中腺苷對擴張冠狀動脈,松弛平滑肌，鎮(zhèn)定中樞神經(jīng)和血小板的凝集均有一定的療效，這一研究結(jié)果預(yù)示著隨著對卷葉貝母活性成分的不斷深入研究，其用途還將進一步增多。據(jù)統(tǒng)計,目前以卷葉貝母為主藥或包含

9、卷葉貝母的中成藥有130多種，年產(chǎn)值約為50億元；同時卷葉貝母也是我國重要的出口商品，創(chuàng)匯率高。隨著醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，人們對卷葉貝母的需求量還將進一步增加，最終導(dǎo)致其價格不斷攀升，藥材市場的缺口越來越大。       卷葉貝母屬于高原瀕危藥材，長期以來主要靠采挖野生藥材為主，由于長期濫采濫挖，再加上生態(tài)環(huán)境惡化，卷葉貝母野生資源銳減，正面臨枯竭的境地。據(jù)全國中藥資源普查可知，卷葉貝母藥物資源被列入我國野生藥材資源保護條例的29種國家重點保護植物藥材之一，同時也被中國珍稀瀕危植物紅皮書確定為漸危種，是國家三級瀕危保護植物。 （2）卷葉

10、貝母人工栽種現(xiàn)狀分析      大量開展人工栽種卷葉貝母藥材是解決其供不應(yīng)求的重要途徑。卷葉貝母人工種植方式主要為有性繁殖和營養(yǎng)繁殖2種情況。有性繁殖即種子繁殖，雖然卷葉貝母種子繁殖系數(shù)高,但種子地處高原,不易采集, 加之卷葉貝母種子存在形態(tài)后熟和生理后熟的特性，因此用種子萌發(fā)要經(jīng)過很長時間的休眠期,并且種子出苗率低,整齊度不理想，生長周期長。究其原因在于卷葉貝母種子休眠機制目前尚未得到系統(tǒng)揭示,而種子層積作用的效果也有待于進一步的研究。當(dāng)前卷葉貝母在生產(chǎn)中多采用營養(yǎng)繁殖，即用鱗莖進行無性繁殖, 這樣方式不僅用種量大, 造成藥材的浪費， 而且長

11、久如此栽種, 還易引起品系的退化, 降低對病蟲害的抵抗力, 產(chǎn)量也隨之大幅度下降。2006年國家科技部確立了“卷葉貝母等瀕危藥材野生撫育和野生變家種研究”的“十一五”支撐項目（2006BAI06A13），較好地解決了卷葉貝母優(yōu)質(zhì)資源的選育及提純復(fù)壯、野生撫育播種方式和野生撫育采挖方式等關(guān)鍵技術(shù)，在一定程度上解決了卷葉貝母的人工栽種的問題。但由于卷葉貝母植物具有耐寒、喜濕、怕高溫、喜蔭蔽的特殊生理特性，只能生長在海拔35004500米的高山灌叢和草甸等地帶，這就給卷葉貝母藥材野生撫育的人工栽培和生產(chǎn)管理帶來了許多困難，同時也在很大程度上限制了卷葉貝母藥材的大規(guī)模生產(chǎn)。另外，利用野生撫育技術(shù)栽培的

12、卷葉貝母藥材，生長周期和野生藥材一樣都需要4-5年較長的時間，并且藥材中總生物堿的含量沒有明顯地增高。當(dāng)前我國要實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化與四川省提出的“7+3”優(yōu)勢培育產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點領(lǐng)域，正好進一步促使了傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代生物工程技術(shù)相結(jié)合。為此，本課題采用生物工程的組織培養(yǎng)技術(shù)、多倍體誘導(dǎo)技術(shù)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，很好地解決卷葉貝母藥用植物栽培困難、生長周期長、有效成分含量低的難題，極大地提高有效成分生產(chǎn)率，排除病菌和蟲害的侵?jǐn)_，并從源頭上嚴(yán)格控制藥材質(zhì)量，保證卷葉貝母藥材的“安全、高效、穩(wěn)定、可控”問題，大力開發(fā)卷葉貝母藥材資源。（3）卷葉貝母生物工程繁育的優(yōu)勢分析  

13、0;  由于卷葉貝母藥材在生長過程中對環(huán)境的溫度、土質(zhì)、氣候等條件有特殊的要求，采用生物技術(shù)生產(chǎn)卷葉貝母中藥材可不受外界環(huán)境影響，通過篩選出高產(chǎn)的卷葉貝母細(xì)胞株系進行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，并對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行有效調(diào)控，可得到產(chǎn)率高，產(chǎn)量、質(zhì)量可靠和可控的優(yōu)質(zhì)中藥原料，最終實現(xiàn)卷葉貝母名貴中藥材快速規(guī)范化生產(chǎn)的目的。        近年來，為了快速繁殖卷葉貝母以緩解卷葉貝母野生資源面臨的危機，國內(nèi)許多科技工作者進行了組織培養(yǎng)方面的研究工作，并取得一定的成果。例如高燕等人通過研究貝母離體培養(yǎng),研究了貝母基因型、溫光條件、

14、激素配比對貝母愈傷及不定芽的影響，研究出誘導(dǎo)貝母愈傷組織的最佳培養(yǎng)基及誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基，建立了完整的不依賴于基因型的貝母植株再生體系。李強、傅華龍等人在研究組培卷葉貝母鱗莖形成和發(fā)育過程中，獲得愈傷組織、胚性愈傷組織、胚狀體、小鱗莖和大鱗莖等，通過對總生物堿含量測定結(jié)果顯示，組織培養(yǎng)生產(chǎn)的卷葉貝母鱗莖總生物堿含量是野生及市售川貝的24倍；并且還進行了游離全蛋白電泳比較，測得組培鱗莖與野生鱗莖的游離全蛋白圖譜完全一致。高山林等人探索出卷葉貝母鱗莖快速增殖的最佳條件，并對組織培養(yǎng)卷葉貝母的化學(xué)成分和藥理作用進行了研究，檢測了通過組織培養(yǎng)獲得的鱗莖和商品鱗莖有一致的化學(xué)成分，都具有生物堿、有機

15、酸、皂甙氨基酸等13種化學(xué)物質(zhì)；通過藥理實驗結(jié)果顯示，組培川貝與野生川貝具有同樣鎮(zhèn)咳祛痰作用，兩藥毒性均較低，比較安全。由此可見，通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)的鱗莖可以有效地保持原商品藥材的有效化學(xué)成分，完全可以用組培川貝代替野生川貝供藥用，預(yù)示用組培技術(shù)進行川貝鱗莖的器官培養(yǎng)是擴大川貝藥用資源的有效途徑。      藥用植物是一類具有特殊用途的經(jīng)濟植物，多倍體誘導(dǎo)技術(shù)已成為選育優(yōu)良品種，提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的有效途徑。這主要是由于藥用植物一般以植物的特定器官為收獲對象供藥用,由于多倍體植株染色體加倍,往往具有器官“巨型性”特征,能較好地滿足藥材生產(chǎn)的要求

16、。所以多倍體誘導(dǎo)可更大幅度的提高藥材的產(chǎn)量；另外，藥用植物由于染色體數(shù)目加倍，也使得染色體上基因調(diào)控有效化學(xué)成分含量較正常二倍體也增高，使得次生代謝產(chǎn)物含量也明顯的增加，從而進一步提高了藥用植物的質(zhì)量。目前自然環(huán)境遭到嚴(yán)重的破壞，野生藥用植物資源種類和數(shù)量急劇減少，為了更好地解決這一問題，開展藥用植物的多倍體誘導(dǎo)是非常重要的。高山林等人最早成功地培育了四倍體丹參優(yōu)良品系,陳柏君等人采用秋水仙素成功誘導(dǎo)了黃芩同源四倍體，王強、傅華龍等人用秋水仙素誘導(dǎo)出卷葉貝母多倍體愈傷組織，這在卷葉貝母的多倍體研究中是首次報道,對本項目的研究具有一定的指導(dǎo)意義。     

17、 當(dāng)前，卷葉貝母的生物技術(shù)研究主要在試管苗培育、鱗莖再生和多倍體誘導(dǎo)等方面取得了一定的成果。但是，市場上卷葉貝母商品仍然短缺，究其原因主要是因為目前在卷葉貝母中使用的生物技術(shù)，都是采用的單一技術(shù)，研究的技術(shù)成果很難大規(guī)模的應(yīng)用在生產(chǎn)實踐中。如采用卷葉貝母組織培育獲得的試管苗應(yīng)用于大田生產(chǎn)時，需要嚴(yán)格的馴化條件和操作管理，且在馴化過程中，試管苗在離體條件下形成的根系往往不能發(fā)揮作用而需要重新生根，從而造成移栽成活率低，在實際生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)是一種廣義組織培養(yǎng)，該技術(shù)不需要完成整個試管苗的培養(yǎng)過程，僅通過對愈傷組織和小鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，將游離的細(xì)胞和小鱗莖懸浮在液體培養(yǎng)

18、基中進行的一種培養(yǎng)方法。此種懸浮培養(yǎng)方式使得培養(yǎng)物生長速度明顯加快，生長周期大大縮短，操作的技術(shù)難度有效降低，并且適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，是目前生產(chǎn)藥用植物有效成分最有希望的途徑之一。（4）生物工程技術(shù)在中藥增產(chǎn)中研究現(xiàn)狀分析     懸浮培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今藥用植物實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的必經(jīng)之路，傳統(tǒng)中藥材對土地、氣候、生長年限等環(huán)境條件有很大的依賴性。利用生物技術(shù)培養(yǎng)高產(chǎn)細(xì)胞株系，大規(guī)模進行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，并不斷改善植物細(xì)胞體外培養(yǎng)條件，可大大地提高藥材細(xì)胞中次生代謝的含量，并且還可以通過向培養(yǎng)基中添加藥物合成的前體物質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)將其轉(zhuǎn)化為目的化合物，以此來增加有

19、效成分的含量，最終實現(xiàn)名貴中藥材快速大規(guī)模生產(chǎn)藥物的目的。     近年來,懸浮培養(yǎng)技術(shù)日益完善，國內(nèi)外學(xué)者利用該技術(shù)已進行了幾十種藥材的有效成分生產(chǎn),其中人參 、紅豆杉、毛地黃、紫草、日本黃連等都已實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。如抗癌藥物紫杉醇的藥用植物紅豆杉的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，已可用75 t發(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)，實現(xiàn)了大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)水平；中國藥科大學(xué)組培室已進行了人參的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)，并對其培養(yǎng)細(xì)胞進行化學(xué)成分（皂甙、灰分、金屬離子、氨基酸）和藥理活性（急性毒性、鎮(zhèn)靜作用、抗疲勞作用、抗高溫作用、吞噬機能）比較分析,結(jié)果與種植人參無差異；我國工程院院士、上海

20、醫(yī)科大學(xué)的胡之壁教授建立了丹參酮的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)丹參培養(yǎng)物具有丹參酮和隱丹參酮的合成能力，證明了來源于組培根的懸浮培養(yǎng)物中的隱丹參酮的含量為原植物的6.8倍。這充分展示了生物工程技術(shù)在生產(chǎn)藥物有效組分方面的光輝前景。而目前還未見有關(guān)利用生物工程技術(shù)大規(guī)模地生產(chǎn)卷葉貝母有效成分的研究報道。為此本課題采用多項現(xiàn)代生物工程技術(shù)，通過對卷葉貝母離體培養(yǎng)材料的誘導(dǎo)培育，篩選出生長速度快、卷葉貝母有效組分含量高、藥理作用優(yōu)于原藥材、無毒副作用和安全可靠的卷葉貝母快速繁殖細(xì)胞系，進一步建立生產(chǎn)條件可控并能大規(guī)?？焖偕a(chǎn)卷葉貝母有效組分的培養(yǎng)體系，很好地解決了卷葉貝母藥材在傳統(tǒng)生產(chǎn)過程中存在的生長條件苛

21、刻、周期長，藥材產(chǎn)量和有效成分含量低等問題，最終實現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)卷葉貝母生物堿和甾體皂甙等藥物有效組分，以緩解卷葉貝母藥材市場的緊缺和更有效地保護卷葉貝母野生植物資源。3、主要目標(biāo)：采用多項生物工程技術(shù)，初步建立卷葉貝母有效組分規(guī)?；焖俜敝臣?xì)胞系，為卷葉貝母有效組分工業(yè)化快速生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。4、主要內(nèi)容（1） 建立卷葉貝母快速繁殖體系篩選出有效組分含量高、適宜進行細(xì)胞和鱗莖懸浮培養(yǎng)的卷葉貝母外植體和最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，建立卷葉貝母愈傷組織和鱗莖快速繁殖培養(yǎng)體系。（2）建立卷葉貝母多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系為了明顯提高藥材中有效組分的含量和增加藥材的產(chǎn)量，進行卷葉貝母愈傷組織、鱗莖和種子的多倍體

22、誘導(dǎo)以及對誘導(dǎo)后材料進行染色體核型鑒定試驗。將培養(yǎng)的愈傷組織、鱗莖和種子接種到含有特定濃度的秋水仙素培養(yǎng)基上進行多倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)；將培養(yǎng)的愈傷組織、鱗莖、種子置于含有特定濃度的秋水仙素溶液中進行一定時間浸泡誘導(dǎo)處理；對所誘導(dǎo)的多倍體材料進行細(xì)胞染色體核型鑒定，篩選出誘導(dǎo)成功的卷葉貝母多倍體組織。 （3） 建立快速高產(chǎn)的卷葉貝母多倍體懸浮培養(yǎng)體系卷葉貝母多倍體愈傷組織和鱗莖的懸浮培養(yǎng)基本培養(yǎng)基MS、B5、SH、White等的篩選；培養(yǎng)基中激素配比、接種量、光照條件、碳源、pH值等因素對培養(yǎng)細(xì)胞和鱗莖的生長速度和有效組分含量的影響研究；對卷葉貝母多倍體懸浮細(xì)胞和鱗莖進行細(xì)胞活力的測定，測定培養(yǎng)細(xì)胞的

23、生長曲線。（4）多倍體培養(yǎng)產(chǎn)物成份累積及時空分布規(guī)律研究采用動態(tài)采樣檢測的方法，應(yīng)用HPLC等檢測技術(shù)對卷葉貝母四倍體懸浮培養(yǎng)物中有效組分的動態(tài)積累及時空分布規(guī)律進行研究。（5）卷葉貝母培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化及藥效毒理評價研究采用化學(xué)分離等技術(shù)對培養(yǎng)產(chǎn)物有效組分進行提取、分離和純化工藝研究；采用比較藥理學(xué)和毒理學(xué)方法對卷葉貝母多倍體懸浮培養(yǎng)產(chǎn)物進行全面系統(tǒng)的藥效學(xué)和安全性評價研究。（6）規(guī)?；焖俜庇夹g(shù)體系優(yōu)化初步建立根據(jù)上述研究結(jié)果，優(yōu)化培養(yǎng)條件，完善基于生物工程技術(shù)的卷葉貝母有效組分的快速繁育關(guān)鍵技術(shù)，初步建立大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)卷葉貝母藥材藥用成分的技術(shù)體系。5、擬采用的技術(shù)路線優(yōu)良川貝母種質(zhì)外

24、植體篩選無菌體系建立最佳培養(yǎng)條件的建立建立秋水仙堿誘導(dǎo)川貝母多倍體體系多倍體懸浮培養(yǎng)物成分的測定與含量分析多倍體懸浮培養(yǎng)產(chǎn)物的藥理學(xué)及安全性評價建立川貝母多倍體懸浮體系初步建立川貝母四倍體懸浮培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)多倍體鑒定外植體的選擇  卷葉貝母無菌體系的建立  篩選出卷葉貝母鱗莖及愈傷組織誘導(dǎo)、增殖的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件  秋水仙素處理不同濃度、時間以及處理方式的確定  秋水仙素誘導(dǎo)離體培養(yǎng)體系的建立  卷葉貝母四倍體的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)的鑒定  卷葉貝母四倍體細(xì)胞的篩選&#

25、160;  卷葉貝母四倍體細(xì)胞懸浮體系的建立 卷葉貝母四倍體懸浮培養(yǎng)物成分的提取、純化、結(jié)構(gòu)分析和含量測定 對卷葉貝母四倍體懸浮培養(yǎng)產(chǎn)物進行全面系統(tǒng)的藥理學(xué)和毒理學(xué)和安全性科學(xué)評價 建立在離體培養(yǎng)條件下，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)卷葉貝母有效組分的關(guān)鍵技術(shù)。6、研究方案本課題的研究方法是依靠組織培養(yǎng)技術(shù)、多倍體誘導(dǎo)技術(shù)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)為支撐點，篩選出卷葉貝母愈傷組織和鱗莖分化增殖的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，研究出種子完成生理、形態(tài)后熟的最佳層積條件，采用將秋水仙素加入培養(yǎng)基中和制備成浸泡液兩種方式誘導(dǎo)卷葉貝母同源四倍體，并運用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的技術(shù)建立高產(chǎn)

26、、穩(wěn)定的卷葉貝母四倍體細(xì)胞懸浮體系，最終實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)卷葉貝母藥用成分的目的。（1）建立卷葉貝母快速繁殖體系通過對卷葉貝母各種外植體、激素配比、培養(yǎng)溫度、光照強度、培養(yǎng)時間以及接種量等多方面篩選研究，確立卷葉貝母愈傷組織和鱗莖快速增殖的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，建立大規(guī)模的卷葉貝母無菌離體培養(yǎng)體系。（2）建立卷葉貝母多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系為了提高藥材中有效組分的含量和增加藥材的產(chǎn)量，選擇生長狀況良好的卷葉貝母愈傷組織團塊和小鱗莖，以及已采用赤霉素并結(jié)合低溫沙藏層積處理后完成生理和形態(tài)后熟的種子，使用將秋水仙素藥劑加入培養(yǎng)基中和用秋水仙素溶液浸泡處理兩種方法誘導(dǎo)卷葉貝母多倍體；并依據(jù)不同的誘導(dǎo)材料，

27、確立出使用秋水仙素溶液的最佳濃度與處理時間。（3）建立快速高產(chǎn)的卷葉貝母多倍體懸浮培養(yǎng)體系和多倍體培養(yǎng)產(chǎn)物成份累積及時空分布規(guī)律研究采用植物形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等技術(shù)對誘導(dǎo)后的材料進行多倍體鑒定，選擇多倍體誘導(dǎo)率高、生長狀況好和有效組分含量高的卷葉貝母材料進行懸浮培養(yǎng)。依據(jù)使用卷葉貝母多倍體的材料，從基本培養(yǎng)基的種類、激素配比、接種量、光照條件、碳源、pH值等多方面進行深入研究，確立影響卷葉貝母多倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長的因素。測定培養(yǎng)細(xì)胞的活力，繪制出懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線，科學(xué)的確立多倍體懸浮培養(yǎng)的繼代時間和生產(chǎn)周期。定時取樣檢測懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中生物堿和甾體皂甙化學(xué)物質(zhì)的變化，弄清卷葉貝母

28、有效組分的積累動態(tài)和時空分布規(guī)律。開展生物轉(zhuǎn)化研究，將懸浮培養(yǎng)基中的蔗糖濃度提高和適當(dāng)添加外源前體，進一步提高卷葉貝母各有效組分的含量。（5）卷葉貝母培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化及藥效毒理評價研究采用化學(xué)分離和制藥工程技術(shù)完成對懸浮培養(yǎng)物中的有效成份進行提取、分離和純化工藝研究，并制備卷葉貝母培養(yǎng)有效組分產(chǎn)物的供試品，采用比較藥理學(xué)和，完成供試品與野生卷葉貝母止咳、化痰、平喘等傳統(tǒng)藥效學(xué)比較研究；采用比較毒理學(xué)的方法，完成卷葉貝母培養(yǎng)有效組分安全性評價研究。（6）規(guī)模化快速繁育技術(shù)體系優(yōu)化初步建立根據(jù)研究結(jié)果，調(diào)整相關(guān)參數(shù)，優(yōu)化培育條件，并放大生產(chǎn)工藝，完善基于生物工程技術(shù)的卷葉貝母有效組分的快速繁育關(guān)鍵

29、技術(shù)，初步建立大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)卷葉貝母藥材藥用成分的技術(shù)體系。7、本項目擬解決以下關(guān)鍵問題 （1）解決了卷葉貝母藥用植物在自然界中生長要求條件苛刻，種子繁殖困難，藥材生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量和有效成分含量低等問題。通過采用生物工程技術(shù)進行藥材生產(chǎn)，可擺脫自然界的各種影響，極大地提高藥材生產(chǎn)率，排除病菌和蟲害的侵?jǐn)_，嚴(yán)格控制藥材質(zhì)量，大規(guī)模生產(chǎn)出有效成分含量高、優(yōu)質(zhì)可控真正意義上的綠色藥物。 （2）研制出快速大規(guī)模生產(chǎn)卷葉貝母藥材有效組分的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)，并將古老的中藥材生產(chǎn)與現(xiàn)代生物工程技術(shù)有機結(jié)合，實現(xiàn)了有目的生產(chǎn)我們需要藥材有效組分的目的，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展展示了光輝前景。8、關(guān)鍵

30、技術(shù)：（1）卷葉貝母高產(chǎn)、穩(wěn)定離體懸浮培養(yǎng)體系的建立，以及培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的篩選。（2）卷葉貝母懸浮培養(yǎng)物中有效成份的提取、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。（3）建立適宜在離體培養(yǎng)條件下，大規(guī)模快速生產(chǎn)卷葉貝母有效組分的生產(chǎn)工藝。9、應(yīng)用方案   該項目由四川省科技廳組織實施，產(chǎn)學(xué)研結(jié)合。以在蓉的科研院所為主要技術(shù)支撐單位，以成都的制藥有限公司技術(shù)擴散載體并配套投入，國家科技部、四川省科學(xué)技術(shù)廳、成都市科技局等政府部門給予支持，以科研創(chuàng)新與技術(shù)擴散的強勢結(jié)合為基礎(chǔ)，以卷葉貝母四倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立研究為突破口，研究與開發(fā)相結(jié)合，研究與產(chǎn)業(yè)相結(jié)合，技術(shù)平臺直接面向成都生物

31、醫(yī)藥科技孵化園，與國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)建立互惠、互利的緊密型伙伴關(guān)系，在新技術(shù)的推廣或擴散過程中，對外產(chǎn)生輻射和帶動。參考文獻：1 陳梅花,王慧春,朱艷媚,陳志.貝母的藥理研究J 安徽農(nóng)學(xué)通報 2007,13（1）：103-105. 2 譚豐蘋,高山林.生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對組培暗紫貝母小鱗莖生長的影響J. 植物資源與環(huán)境,1999,8(1) : 5255. 3高山林,朱丹妮，蔡朝暉，徐德然. 暗紫貝母鱗莖器官培養(yǎng)生長特征和生物堿累積的研究J.中國藥科大學(xué)學(xué)報,1992；23(3)：1 44 147.4唐魏，楊映根，桂耀林，郭仲琛等. 培養(yǎng)條件對平貝母愈傷組織分化的影響.生物技術(shù).1996,6(4):11-

32、14.5王 強,蘭利瓊,傅華龍.秋水仙素誘導(dǎo)川貝母(Fritillaria cirrhosaD.Don)愈傷組織多倍體的研究J. 武漢植物學(xué)研究,2002,20(6):449 452.6張海鳳,鄭輝,陳新華,郭寶林. 藥用植物多倍體研究進展J 河北林果研究，2008.23（2）：169-172. 7劉智慧.美國東部黑核桃種子層積催芽的探討.山西林業(yè)科技.2003.98李志亮,李風(fēng).三種貝母種子休眠解除的適溫測定.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物資源開發(fā)研究所.19959周良騮，謝中穩(wěn)，張袖麗.安徽貝母種子休眠與萌發(fā)的研究.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)部，合肥.1994.910 高文遠(yuǎn),李志亮,肖培根.浙貝母種子

33、兩種低溫解除休眠過程中過氧化物酶同工酶的電泳分析.中國中藥雜志.1997 11于婧,魏建和,陳士林,代勇,楊成民.川貝母種子休眠及萌發(fā)特性的研究J.中草藥.2008,7(39):10811084.12陳瑞陽.植物染色體標(biāo)本制作的新方法J.植物學(xué)報,1979，20（3）：297.13郭啟高,宋明,梁國魯. 植物多倍體誘導(dǎo)育種研究進展J. 生物學(xué)通報,2000,35 (2) :812-815.14李萍.劉惠娟.徐國鈞.徐路珊.余國奠. 中藥貝母類的研究珊湖北產(chǎn)貝母屬植物的核型研究J 國藥科人學(xué)學(xué)報. 1991，22（4）：19319615 金蘭，羅桂花 低溫解除川貝母種子休眠過程中酯酶和過氧化物酶

34、同工酶的變化J. 青海師范大學(xué)學(xué)報.2007,4.16 宋廷杰，肖杰易，李祥洲.川貝母種子赤霉素處理試驗研究.四川省中醫(yī)藥研究院藥物種植研究所.17 張壽文,劉賢旺. 貝母屬植物的組織培養(yǎng)研究進展J. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（2）：187 - 19018耿茂林，馬琳，常莉，薛建平. 貝母組織培養(yǎng)研究進展J. 淮北煤炭師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版).2007，28(1):38 - 4219陳敏,陳和榮,鐘鳳林,等.川貝母組織培養(yǎng)的研究J.中國中藥雜志,1995,20(8):461 - 462.20蔡朝暉,李萍,高山林.中藥貝母的組織培養(yǎng)研究概況J.中草藥,1998,29(4):274 -

35、277.6周寶鈞.平貝母鱗莖組織培養(yǎng)的研究J.植物生理學(xué)通訊.1983，19（1）：30.21 王 強,蘭利瓊,傅華龍.秋水仙素誘導(dǎo)川貝母(Fritillaria cirrhosaD.Don)愈傷組織多倍體的研究J. 武漢植物學(xué)研究,2002,20(6):449 452.22 張海鳳,鄭輝,陳新華,郭寶林. 藥用植物多倍體研究進展J 河北林果研究，2008.23（2）：169-172. 23陳瑞陽.植物染色體標(biāo)本制作的新方法.植物學(xué)報，1979，20(3):297.24 宋福坤,趙勤. 湖北貝母與川貝母總生物堿含量的比較J. 藥學(xué)進展. 1998,22(1)；495025秦金山,王莉,牛德水.

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37、在藥用植物領(lǐng)域應(yīng)用進展J.中醫(yī)藥導(dǎo)報, 2006, 12 (2) : 83.31王曉杰.用川貝母組方治療肝硬化腹水J. 中醫(yī)雜志, 2004,45 (6) : 410.32陳晉宇.川貝母治小便淋瀝J. 中醫(yī)雜志, 2004, 45 (6) : 412.33曹新偉，陳四保，陳士林等.川貝母中非生物堿類成分的研究J.世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化基礎(chǔ)研究.2008，10（2）：83-8834 Leifert C, CassellsAC. Microbial hazards in plant tissue and cell cultures. In vitro Cellular&Developme

38、ntal Biology. Columbia: Mar/Apr 2001,37(2):133-13835 周立剛,楊崇仁,王君健. 露水草毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)J.云南植物研究1996;18(3):33634012hooykaasvan slogteren G M S,et al,1984.Natrue,311:76376436陶余敏; 唐錫華.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的可能性及問題J. 植物生理學(xué)通訊，1992，28（6）：40237 許建峰·高山紅景天愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天苷動力學(xué)與過程調(diào)控D. 大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文,1996: 3 - 2038劉佳佳，江文輝，趙國

39、玲等 銀杏致密細(xì)胞團顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯研究J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2001，13（4）：16-1939宋福坤,趙勤 湖北貝母與川貝母總生物堿含量的比較J. 藥學(xué)進展.1998年.22(1):49-5041樊君，朱四易，李寶璋 伊貝母細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究J 西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1995年12月，25（6）。42 呂東平,趙德修 ,黃艷，趙喬 前體對水母雪蓮懸浮培養(yǎng)細(xì)胞黃酮合成的影響J 云南植物研究 43 高山林,朱丹妮,蔡朝輝,徐德然.暗紫貝母鱗莖器官培養(yǎng)生長特征和生物堿累積的研究 J .中國藥科大學(xué)學(xué)報.1992，23(3):14414744 桂鏡生, 楊樹德. 川貝母與平貝母的資源狀況調(diào)查及市場供求分析.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2008，31（6）45 國務(wù)院. 野生藥材資源保護管理條例第四條.1987. 10.3046 聶小忠，對歷版.中國藥典所載川貝品種的探討 J .中國藥房.2008，19（9）：717718 47 耿茂林，馬 琳，常 莉，薛建平. 貝母組織培養(yǎng)研究進展 J .淮北煤炭師范學(xué)院學(xué)報 .2007，28(1)48 川貝母栽培技術(shù).華夏星火增刊.（農(nóng)村實用技術(shù)專輯 種植篇）2007，8 S567.249 李玉美.