結直腸癌cerbBCD44v6及nm23表達與臨床病理特征及預后的相

1、 結直腸癌結直腸癌c-erbb-2、cd44v6 及及nm23表達表達 與臨床病理特征及預后的相關性研究與臨床病理特征及預后的相關性研究 碩士研究生碩士研究生 張張 建建 兵兵 導導 師師 陳莉教授陳莉教授 腫瘤的復發(fā)和轉移是當今腫瘤治療最棘手的問題之一。據統(tǒng)計，有90%以上的癌癥病人死于腫瘤的復發(fā)或轉移。研究腫瘤細胞轉移的分子基礎及其與癌基因及抑癌基因的關系，已成為目前腫瘤防治研究的熱點問題。真核細胞增殖調控是一個多因素、多環(huán)節(jié)、涉及到細胞內眾多分子事件的復雜過程。在細胞增殖調控中，大多數癌基因是促進與發(fā)揮正調作用，而抑癌基因則是抑制與負調作用。它們在正常細胞中可能有調節(jié)細胞正常生長、抑制腫

2、瘤形成的作用，它們的失活或缺失會導致細胞增殖失控或癌變。 癌基因癌基因c-erbb-2又稱為neu 或 her-2。c-erbb-2編碼分子量為185ku 的穿膜蛋白，與表皮生長因子受體（egfr）同源，該蛋白可以抑制酪氨酸激酶活性，c-erbb-2過度表達和擴增可見于多種腫瘤。已有很多研究表明，乳腺癌c-erbb-2的高水平表達常常與較大的原發(fā)瘤體積、較多的腋下淋巴結轉移及較差的內分泌治療反應性有關，預示著更早、更多的術后復發(fā)及較短的生存期1，2。 粘附分子粘附分子cd44是淋巴細胞的一種歸巢受體，為高度異質性的單鏈跨膜糖蛋白，參與細胞與細胞間、細胞與基質間的粘連，有標準型（cd44s）和變

3、異型（cd44v）兩型。據報道，其變異體cd44v6 過表達與結直腸癌的侵襲能力有關3，4。核苷二磷酸激酶（核苷二磷酸激酶（ndpk/ nm23）屬nme基因家族，被認為參與了同惡性腫瘤轉移相關的多種調節(jié)活動。nm23異常改變一方面可引起微管聚合而成的紡錘體異常，導致非整倍體形成；另一方面可通過細胞骨架及細胞素等信號反應性的改變引起細胞運動，從而參與侵襲和轉移過程。研究發(fā)現嚙齒動物實驗性腫瘤的轉移能力與nm23基因的表達呈密切負相關5，bertheau 等6在甲狀腺惡性腫瘤中研究證實nm23及基因產物的表達與腫瘤的轉移和預后相關密集，nm23的mrna 下調與腫瘤的淋巴結轉移和低生存率有關。

4、結直腸癌（結直腸癌（colorectal carcinoma）是人類常見惡性腫瘤之一，對人類的健康構成了極大威脅。近年來對結直腸癌相關基因產物的檢測已逐步和早期診斷、發(fā)病機制、病理特征、估計預后等密切聯系起來，但研究結果不盡一致7-10。目前分子病理學研究認為，結直腸癌的發(fā)生是個多階段、多因素作用的過程，主要是由于癌基因激活、抑癌癌基因激活、抑癌基因及基因及dna修復基因突變或功能缺失所致修復基因突變或功能缺失所致。我們應用免疫組織化學方法同時檢測結直腸癌中癌基因蛋白c-erbb-2、cd44v6及nm23的表達，并探討其與病理特征和臨床預后的相關性。 1.1材料材料1.1.1臨床資料： 92

5、例結直腸癌： 28例：有十年以上隨訪結果 64例：無隨訪結果以上病例均為結直腸原發(fā)性腺癌，不含腺瘤癌變的病例，都只作了結直腸癌根治手術，未作化療、放療等輔助治療。男性49例，女性43例，年齡2475歲（中位55歲）。結腸癌27例，直腸癌65例。根據國際抗癌聯盟（uicc）的tnm分期標準11（見表1）作臨床分期：期19例，期28例，期37例，期8例。表表1 uicc結直腸癌結直腸癌tnm分期標準分期標準 a. nm定義定義 分期分期 描述描述原發(fā)腫瘤（t） tx 原發(fā)腫瘤資料不詳 t0 原發(fā)灶不能確定 tis 原位癌 t1 腫瘤侵入粘膜下層 t2 腫瘤侵入肌層 . t3 腫瘤穿過肌層到漿膜下或

6、至無腹膜的結腸周圍或直腸周圍組織 t4 腫瘤穿過臟層腹膜或直接侵入其它器官組織表表1 uicc結直腸癌分期結直腸癌分期 a. t m定義定義 分期分期 描述描述區(qū)域淋巴結（n） nx 區(qū)域淋巴結資料不詳 no 無淋巴結轉移 n1 腫瘤轉移至13個結腸（直腸）周圍淋巴結 n2 腫瘤轉移至4個結腸（直腸）周圍淋巴結 n3 腫瘤轉移至主要血管沿途的任何淋巴結表表1 uicc結直腸癌分期結直腸癌分期 a. tn定義定義 分期分期 描述描述遠處轉移（m） mx 不能確定有無轉移 m0 無遠處轉移 m1 有遠處轉移 表表1 uicc結直腸癌分期結直腸癌分期 b. 分期標準分期標準 期別期別 t n m 0

7、 tis n0 m0 t1 ,t2 n0 m0 t3,t4 0 0 ny 1,2,3 0 ny ny 1 1.1.2病理資料：92例結直腸癌中，高分化腺癌16例，中分化腺癌45例，低分化腺癌21例，粘液腺癌10例。對全部病例觀察了鏡下腫瘤生長方式（推進式為主34例，圖1；浸潤性為主58例，圖2）以及瘤周淋巴樣細胞聚集情況（21例見有大量淋巴樣細胞浸潤，圖3；71例無大量淋巴樣細胞浸潤，圖2）。 1.1.3主要試劑及實驗材料： c-erbb-2 單克隆抗體（克隆系tab250），工作濃度1：100；cd44v6單克隆抗體（克隆系2f10）, 工作濃度1：100；nm23單克隆抗體（克隆系m-04

8、21），工作濃度1：80?？乖迯鸵簽?.01m、ph6.0 枸櫞酸鹽緩沖液，dab顯色。以上試劑、二抗及sp試劑盒均為dako公司產品。免疫標記陽性對照組織來自乳腺癌、胃癌。 1.2 方法方法 1. 2.1 標本及玻片的處理：所有標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，34m連續(xù)切片。每例選取四張切片貼于經多聚賴氨酸處理的玻片上，70 oc烘烤2小時，1張進行he染色，其余3張進行免疫組織化學染色。 1.2.2 he染色： 主要步驟：主要步驟： 石蠟切片石蠟切片 脫蠟脫蠟 梯度乙醇水化梯度乙醇水化 蘇木素染色蘇木素染色 鹽酸乙醇分化鹽酸乙醇分化 返藍返藍 伊紅染色伊紅染色 梯度乙醇脫水梯度乙醇脫

9、水 透明透明 封固封固 1.2.3 c-erbb-2、cd44v6及 nm23免疫組織化學染色： 主要步驟：主要步驟： 石臘切片脫蠟至水石臘切片脫蠟至水 去內源性酶去內源性酶 抗原修復（高壓鍋煮沸放氣抗原修復（高壓鍋煮沸放氣3分鐘分鐘,nm23不需）不需） 一抗一抗 二抗二抗 sp復合復合物物 dab顯色顯色 水洗，蘇木素復水洗，蘇木素復染，封片。染，封片。 1.1.2.4 免疫組織化學檢測結果分析方法： c-erbb-2、cd44v6 陽性定位在細胞膜出現棕黃色顆粒，nm23陽性定位在細胞漿出現棕黃色顆粒。著色細胞10%為陰性，10%為陽性。1.2.5 統(tǒng)計學處理方法： 運用stata 7.

10、0統(tǒng)計軟件（美國計算機資源中心研制）進行統(tǒng)計學處理。不同組間表達率的比較采用fisher精確檢驗；對有隨訪結果的病例用cox比例風險模型進行單因素和多因素生存分析，并對有預后意義的指標作出kaplan-meier生存曲線。2.1 結直腸癌癌基因蛋白表達與臨床病結直腸癌癌基因蛋白表達與臨床病理參數的關系理參數的關系 92例結直腸癌中，44例c-erbb-2陽性（圖4、5），陽性率47.8%；51例cd44v6陽性（圖6、7），陽性率55.4%；39例nm23陽性（圖8、9），陽性率42.4%。c-erbb-2、cd44v6及nm23表達與組織分型、uicc分期、腫瘤生長方式及瘤周淋巴樣細胞浸潤的

11、關系見表2。 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n c-erbb-2 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 組織類型 高分化腺癌 16 10 6 37.5 中分化腺癌 45 23 22 48.9 低分化腺癌 21 9 12 57.1 粘液腺癌 10 6 4 40.0 p=0.658 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n cd44v6 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 組織類型 高分化腺癌 16 8 8 50.0 中分化腺癌 45 21

12、24 53.3 低分化腺癌 21 7 14 66.7 粘液腺癌 10 5 5 50.0 p=0.696 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n nm23 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 組織類型 高分化腺癌 16 9 7 43.8 中分化腺癌 45 27 18 40.0 低分化腺癌 21 13 8 38.1 粘液腺癌 10 4 6 60.0 p=0.690 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n c-erbb-2 陰性陰性 陽性陽性 陽

13、性率陽性率% uicc分期 、期 47 31 16 34.0 期 37 15 22 59.5 期 8 2 6 75.0 p=0.018* 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n cd44v6 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% uicc分期 、期 47 28 19 40.4 期 37 10 27 73.0 期 8 3 5 62.5 p=0.009* 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n nm23 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% uic

14、c分期 、期 47 29 18 38.3 期 37 18 19 51.4 期 8 6 2 25.0 p=0.300 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n c-erbb-2 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 腫瘤生長方式 推進式為主 34 21 13 38.2 浸潤性為主 58 27 31 53.4 p=0.197 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n cd44v6 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 腫瘤生長方式 推進式為主 34 1

15、7 17 50.0 浸潤性為主 58 24 34 58.6 p=0.516 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n nm23 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 腫瘤生長方式 推進式為主 34 23 11 32.4 浸潤性為主 58 30 28 48.3 p=0.190 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n c-erbb-2 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 瘤周淋巴樣細胞浸潤 有大量淋巴樣細胞浸潤 21 16 5 23.8 無大量淋巴

16、樣細胞浸潤 71 32 39 54.9 p=0.014* 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n cd44v6 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 瘤周淋巴樣細胞浸潤 有大量淋巴樣細胞浸潤 21 13 8 38.1 無大量淋巴樣細胞浸潤 71 28 43 60.6 p=0.084 表表2 c-erbb-2、cd44v6、nm23表達表達與結直腸癌臨床病理參數的關系與結直腸癌臨床病理參數的關系 n nm23 陰性陰性 陽性陽性 陽性率陽性率% 瘤周淋巴樣細胞浸潤 有大量淋巴樣細胞浸潤 21 11 10 47.6 無大量

17、淋巴樣細胞浸潤 71 42 29 40.8 p=0.622注：p為fisher精確檢驗值 * 示p0.05 *示p0.01 由表2可見，c-erbb-2表達與uicc分期及瘤周淋巴樣細胞浸潤有關（p0.05），而與組織分型及腫瘤生長方式無明顯關系。cd44v6表達與uicc分期有關（p0.01），而與其余參數無關。nm23表達與上述各項參數間均無明顯關系。2.2 結直腸癌的單因素和多因素生結直腸癌的單因素和多因素生存關系分析存關系分析隨訪十年以上的28例結直腸癌臨床病理特征、癌基因蛋白表達與隨訪結果見表3。表表3 28例結直腸癌臨床病理特征、癌基因蛋白例結直腸癌臨床病理特征、癌基因蛋白表達與生

18、存資料表達與生存資料 生存時間（例） 5年（%） 510年（%）10年（%）組織類型高、中分化腺癌（20） 3(15.0) 10(50.0) 7(35.0)低分化、粘液 腺癌（8） 6(75.0) 2(25.0) 0uicc分期 、期（17） 2(11.8) 8(47.0) 7(41.2) 、期（11） 7(63.6) 4(36.4) 0 腫瘤生長方式 推進式（10） 2(20.0) 3(30.0) 5(50.0) 浸潤性（18） 7(38.9) 9(50.0)2(11.1) 表表3 28例結直腸癌臨床病理特征、癌基因蛋白例結直腸癌臨床病理特征、癌基因蛋白表達與生存資料表達與生存資料生存時間（

19、例） 5年（%） 510年（%） 10年（%）瘤周淋巴樣細胞浸潤 有大量淋巴樣細胞（6） 0 2(33.3) 4(66.7) 無大量淋巴樣細胞（22 9(40.9) 10(45.5) 3(13.6) c-erbb-2 (16) 2(12.5) 7(43.75) 7(43.75) (12) 7(58.3) 5(41.7) 0 cd44v6 (14) 4(28.6) 3 (21.4) 7(50.0) (14) 5(35.7) 9(64.3) 0 nm23 (15) 7(46.7) 7(46.7) 1(6.6) (13) 2(15.4) 5(38.5) 6(46.1) 對表3進行單因素cox模型分析

20、，結果見表4。 表表4. 結直腸癌單因素生存分析結直腸癌單因素生存分析(cox比例風險模型比例風險模型)結果結果 風險比 標準誤 z統(tǒng)計量 p值 95可信區(qū)間組織分型 4.316485 2.070272 3.05 0.0021.686075 11.05054uicc分期 6.158393.069948 3.65 0.0002.318166 16.36025 腫瘤生長方式 3.236392 1.677992 2.27 0.023 1.171477 8.941054瘤周淋巴樣細胞浸潤 5.977281 4.484426 2.38 0.0171.373706 26.00839c-erbb-2 5.5

21、19218 2.756547 3.42 0.0012.073714 14.68947cd44v6 2.576888 1.232054 1.98 0.0481.009535 6.577633nm23 .2552479 .1230412 -2.83 0.005.0992302 .6565691 由表4可見，結直腸癌組織分型、 uicc分期、腫瘤生長方式、瘤周大量淋巴樣細胞浸潤及c-erbb-2、cd44v6、nm23表達均與預后有關（p0.05）。對表3進行多因素cox模型分析結果見表5 表表5. 結直腸癌多因素生存分析結直腸癌多因素生存分析(cox比例風險模型比例風險模型)結果結果 風險比 標準

22、誤 z統(tǒng)計量 p值 95可信區(qū)間uicc分期 10.88877 6.41264 4.05 0.000 3.43310934.53587c-erbb-2 5.724749 3.2123253.11 0.002 1.90599717.19454nm23 .3072231 .1580824 -2.29 0.022 .1120639 .8422513 由表5可見，只有uicc分期、c-erbb-2和nm23表達具有獨立的預后意義（p0.05），即uicc、期，c-erbb-2過表達及nm23表達減少與結直腸癌的不良預后有關（圖1a-3a）。 生存率圖1 a uicc分 期的k a p l an_mei

23、er生 存 曲 線生存時間( 年)0510150.000.250.500.751.00iii、i v期i、i i期 生存率圖2 a c-erbb-2表 達的k a p l an_meier生 存 曲 線生存時間( 年)0510150.000.250.500.751.00( + )( - ) 生存率圖3 a nm23表 達的k a p l an_meier生 存 曲 線生存時間( 年)0510150.000.250.500.751.00( + )( - )31 c-erbb-2的表達及其意義的表達及其意義 c-erbb-2 癌基因 位于17號染色體q21區(qū)帶上，與表皮生長因子受體（egfr）基因

24、具有同源性，編碼具有抑制酪氨酸激酶活性的穿膜蛋白（分子量185ku）。通過分析腫瘤細胞中c-erbb-2基因在dna、mrna或其產物的不同水平上質和量的變化與腫瘤侵襲轉移表型之間的相關性，或通過基因轉染使轉染腫瘤細胞獲得轉移能力的實驗，已證明該基因與一些腫瘤的進展和轉移有關。 目前已有較多證據表明c-erbb-2基因過表達與乳腺癌的較差預后有關1，2，但有關該基因與結直腸癌關系的研究較少。yamaguchi等12和yang等13報道發(fā)生肝轉移的結直腸癌c-erbb-2蛋白的陽性率顯著高于無肝轉移的結直腸癌。 nakae等14報道c-erbb-2蛋白的陽性率在dukes d期顯著高于dukes

25、 a、b、c期。本組92例結直腸癌免疫酶標結果顯示，c-erbb-2陽性率與uicc分期呈正相關（p0.05）,與瘤周大量淋巴樣細胞浸潤呈負相關（p0.05）,但與組織類型及腫瘤生長方式無明顯相關性(p0.05)13,15。對有10年以上隨訪資料的28例結直腸癌研究表明, c-erbb-2陰性者5年生存率(87.5%)明顯高于c-erbb-2陽性者(41.7% ,p0.05)，并且經作多因素cox回歸模型分析提示， c-erbb-2過表達與結直腸癌的不良預后有關。32 cd44v6的表達及其意義的表達及其意義 cd44是分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白分子,主要參與細胞-細胞、細胞-基質之間的

26、特異性粘附過程。人類cd44基因定位于11號染色體短臂，全長約50kb，共由20個高度保守的外顯子組成。外顯子按照轉錄方式不同可分為組成型外顯子（c）和變異性拼接外顯子(v)兩大類,變異性拼接外顯子共有10個,其中較為重要的第6位變異性拼接外顯子(cd44v6)的過度轉錄已被發(fā)現與一些上皮性腫瘤的進展和轉移有關。 有作者報道cd44v6過表達的結直腸癌易于轉移 3，4 ,還有作者報道cd44v6表達減少與結直腸癌的更強侵襲性和不良預后有關 9，16，17 ，但morrin等 10 和jungling等18的最近報道認為cd44v6的表達與結直腸癌進展沒有明顯關系。 本組92例結直腸癌進行cd4

27、4v6標記的陽性率與uicc分期之間具有相關性（p.01），即、期cd44v6陽性率明顯高于、期，但期陽性率（73.0%）卻高于期（62.5%）。此外，cd44v6表達與組織類型、腫瘤生長方式及瘤周淋巴樣細胞浸潤間無明顯相關性。 在有10年以上隨訪資料的28例結直腸癌中，cd44v6的表達與10年生存率間無明顯相關性。weg-remers等 17 及chun等19 的研究表明，cd44v6在正常結腸粘膜內很少表達，而在結直腸癌組織中的陽性率顯著增高。 因此，cd44基因可能只是在結直腸癌的腫瘤形成過程中發(fā)揮一定作用9,19 。33 nm23的表達及其意義 人類nm23基因定位于17號染色體長臂

28、（17q21），該基因全長8.5kb，由5個外顯子及4個內含子組成，編碼蛋白質分子量約17000（17kda）。nm23基因產物ndpk與微管聚集、g蛋白信號傳遞、細胞與周圍組織粘附力、完整的基底膜形成及轉錄調節(jié)等有關20，21?，F已發(fā)現nm23基因主要有h1、h2兩種類型，多數研究認為h1亞型與腫瘤轉移的關系最密切。在人類腫瘤中，該基因的改變有基因丟失、突變、表達異常22.起初，人們通過動物實驗發(fā)現nm23基因具有抑制腫瘤轉移的作用，以后不少研究報道結直腸癌中nm23表達減少與腫瘤晚期及遠處轉移有關23-25，并且tannapfel等 26 研究認為nm23表達減少可作為評價結直腸癌具有淋巴

29、結轉移潛能的一項獨立指標。cheah等27報道nm23表達與結直腸癌臨床分期呈反比（分期越晚，表達越少），但與性別、年齡、腫瘤分化程度及5年生存率等無明顯關系。最近，katakura等 28 報道nm23表達可作為預測非小細胞肺癌良好預后的一項獨立指標，但forte等29認為nm23尚不能作為結直腸癌的一項獨立預后指標。 本組92例結直腸癌的nm23表達與組織類型、uicc分期、腫瘤生長方式及瘤周淋巴樣細胞浸潤均無明顯相關性，但經對有隨訪結果的結直腸癌中nm23表達作多因素cox回歸模型分析提示，nm23陰性病例預示更差的預后。因而我們贊同nm23基因具有抗腫瘤轉移的潛能 28 ，認為nm23

30、表達減少預示結直腸癌更強的侵襲性和易于轉移擴散。 34 其它臨床病理因素其它臨床病理因素341 uicc分期：本研究發(fā)現該分期與c-erbb-2、cd44v6的表達具有明顯相關性，提示c-erbb-2、cd44v6癌基因過表達的結直腸癌可能具有更強的侵襲性。通過對有隨訪資料的結直腸癌uicc分期作多因素cox回歸模型分析證實，該分期具有顯著獨立的預后意義 18，29 。342 組織類型：本研究發(fā)現組織類型與c-erbb-2、cd44v6及nm23基因蛋白表達無明顯相關性 13，18，27。雖然單因素cox模型分析顯示低分化腺癌、粘液腺癌的預后明顯差于高、中分化腺癌 30，但經作多因素cox模型分析發(fā)現組織類型不能作為獨立的預后指標 31 。 343 腫瘤生長方式：近年研究認為結直腸癌腫瘤的推擠式（膨脹性）生長比浸潤性生長的預后好31,32。并且jass等 33 提出的結直腸癌分期方法中將腫瘤生長方式作為預后的重要指標之一。本組研究顯示，結直腸癌腫瘤生長方式與c-erbb-2、cd44v6及nm23的表達無明顯關系。單因素cox模型生存分析顯示浸潤性生長比膨脹性（推擠式）生長的結直腸癌預后要差，但經多因素cox模型分析顯示腫瘤生長方式不能作為獨立的預后指標。344 瘤周淋