顯微鏡的使用和細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色

1、exercise oneexercise one顯微鏡的使用和細(xì)菌的簡(jiǎn)顯微鏡的使用和細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色單染色制作者：黃海嬋（制作者：黃海嬋（）telor實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容顯微鏡介紹油鏡的使用原理染色原理目的要求目的要求 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序作業(yè)作業(yè)顯微鏡的使用細(xì)菌簡(jiǎn)單染色的流程實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理顯微鏡介紹顯微鏡介紹w普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡(nikon)w歐林巴斯（歐林巴斯（olympus）生物顯微鏡）生物顯微鏡w麥克奧林生物顯微鏡顯微鏡的構(gòu)造顯微鏡的構(gòu)造機(jī)械裝置機(jī)械裝置光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)鏡座鏡座載物臺(tái)載物臺(tái)鏡

2、臂鏡臂標(biāo)本夾和標(biāo)本移動(dòng)尺標(biāo)本夾和標(biāo)本移動(dòng)尺粗調(diào)螺旋和細(xì)調(diào)螺旋粗調(diào)螺旋和細(xì)調(diào)螺旋聚光鏡升降螺旋聚光鏡升降螺旋接目鏡接目鏡接物鏡及鏡頭轉(zhuǎn)換器接物鏡及鏡頭轉(zhuǎn)換器聚光鏡聚光鏡虹彩光圈虹彩光圈反光鏡反光鏡顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率w1.放大倍數(shù)放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù) 2. 顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率 是表示顯微是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為：離的能力，可用公式表示為： d=/2nsin(/2 ) 式中式中d d：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。的最短距離。

3、：可見光的波長(zhǎng)（平均可見光的波長(zhǎng)（平均0.550.55 m) m) n:n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。射率。 ：鏡口角（即入射角）。鏡口角（即入射角）。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理油鏡使用的原理油鏡使用的原理w油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相其折射率與玻片的相近近），則幾乎不發(fā)生折射，

4、），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。而使物象更加清晰。油浸沒(méi)物鏡油浸沒(méi)物鏡 介質(zhì)：左空氣；右香柏油介質(zhì)：左空氣；右香柏油實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原理染色劑和染色原理回目錄頁(yè)回目錄頁(yè)w由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對(duì)以上），對(duì)光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒(méi)有光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒(méi)有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過(guò)染色后，和直接計(jì)算菌數(shù)外

5、，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過(guò)染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完美無(wú)缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過(guò)程中微美無(wú)缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過(guò)程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意?；罴?xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意。w微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)

6、染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。滲透、吸附作用等。 化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸引等。引等。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原理染色劑和染色原理w染色劑染色劑 染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型：染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型： 1. 酸性染料：酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。 2. 堿性染料：堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 3. 中

7、性（復(fù)合）染料：中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，如伊紅、美蘭等，wright染料和染料和gimsa染料等（常用于細(xì)胞核染色）。染料等（常用于細(xì)胞核染色）。 4. 單純?nèi)旧簡(jiǎn)渭內(nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，這類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（sudan b)的染料。的染料。w細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，ph值大約在值大約在25之間，故在中性、堿性之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶

8、陽(yáng)電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽(yáng)電的堿性離時(shí)染料離子帶陽(yáng)電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽(yáng)電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料堿性染料進(jìn)行染色。進(jìn)行染色。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原理染色劑和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌的三種基本形態(tài)細(xì)菌的三種基本形態(tài)球菌球菌（spherical coccus）:包括雙球菌、鏈球菌、葡萄球菌、四包括雙球菌、鏈球菌、葡萄球菌、四鏈球菌、八疊球菌等鏈球菌、八疊球菌等桿菌桿菌(rod-shaped bacillus)：短小、粗大、細(xì)長(zhǎng)、棒狀、分支短小、粗大、細(xì)長(zhǎng)、棒狀

9、、分支螺旋菌螺旋菌(spired-shaped spirallum)：弧菌、螺菌弧菌、螺菌實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料w器材器材：顯微鏡顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、載波片、擦鏡紙、吸水紙、載波片、蓋玻片、接種蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、廢液缸、洗瓶環(huán)、酒精燈、廢液缸、洗瓶等。等。w細(xì)菌形態(tài)的染色標(biāo)本。細(xì)菌形態(tài)的染色標(biāo)本。w菌種菌種：培養(yǎng)培養(yǎng)1218h的枯草桿菌（的枯草桿菌（b.subtilisb.subtilis) )、 大腸桿菌（大腸桿菌（e.colie.coli）、）、 金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌（s.aureuss.aureus）w染色液和試劑染色液和試劑：石炭酸復(fù)紅、呂氏美藍(lán)石炭酸復(fù)紅、呂氏美藍(lán)、香柏

10、油、香柏油、二甲苯二甲苯( (或者或者乙醇乙醚溶液）等乙醇乙醚溶液）等-實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序顯微鏡的使用顯微鏡的使用w1.用前檢查用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 w2.調(diào)節(jié)光亮度調(diào)節(jié)光亮度 w3.低倍鏡觀察低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)：粗調(diào)、細(xì)調(diào) w4.依次再進(jìn)行依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察中倍、高倍觀察 w5.油鏡觀察油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。物象為止。 w6.換片換片：另?yè)Q新片，必

11、須從第三條開始操作。：另?yè)Q新片，必須從第三條開始操作。 w7.用后復(fù)原用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯（或者油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）乙醇乙醚溶液）擦擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。復(fù)原。主要是油鏡的使用主要是油鏡的使用顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)：顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)：1.不準(zhǔn)擅自拆卸不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件顯微鏡的任何部件, ,以免損壞。以免損壞。 2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不

12、能用手指或粗布，以保證光潔度，用鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度，用完油鏡必須進(jìn)行完油鏡必須進(jìn)行“三擦三擦”。 3.觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。免壓碎玻片或損傷鏡面。 4.觀察時(shí)，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛觀察時(shí)，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。 5.拿顯微

13、鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。更不可傾斜拿。 6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。實(shí)驗(yàn)程序細(xì)菌簡(jiǎn)單染色蒸餾水蒸餾水涂片涂片接種環(huán)接種環(huán)自然干燥自然干燥固定固定石炭酸復(fù)紅石炭酸復(fù)紅(呂式美蘭呂式美蘭)染色染色1min水洗水洗干燥干燥擦拭擦拭水洗時(shí)不要直接沖菌膜水洗時(shí)不要直接沖菌膜每位學(xué)生一人一組，取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，各做一塊涂片。每位學(xué)生一人一組，取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，各做一塊涂片。錄 像 演 示錄 像 演 示染色注意事項(xiàng)染

14、色注意事項(xiàng)w1.涂片過(guò)程中，去生理鹽水和細(xì)菌不宜過(guò)多，涂菌要均勻，不宜過(guò)厚涂菌要均勻，不宜過(guò)厚。w2.固定時(shí)溫度不可過(guò)高，以載玻片背面不燙手背為宜，因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)破壞細(xì)胞的形態(tài)溫度過(guò)高會(huì)破壞細(xì)胞的形態(tài)。w3.水洗時(shí)，不應(yīng)直接沖洗細(xì)菌涂面，水流不應(yīng)過(guò)大、過(guò)急，以免細(xì)菌涂面被沖掉以免細(xì)菌涂面被沖掉。錯(cuò)誤操作示范錯(cuò)誤操作示范實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告 根據(jù)觀察結(jié)果，畫出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖，并注明菌體染色后的顏色。思考題思考題w油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？應(yīng)特別注意些什么？w使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？w鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？實(shí) 驗(yàn) 一結(jié) 束下周實(shí)驗(yàn)下周實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革蘭氏染色和芽孢染細(xì)菌的革蘭氏染色和芽孢染色色（書中實(shí)驗(yàn)十一和實(shí)驗(yàn)十四）（書中實(shí)驗(yàn)十一和