![4章目的基因的制備_第1頁](http://file2.renrendoc.com/fileroot_temp3/2021-11/14/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c166/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c1661.gif)
![4章目的基因的制備_第2頁](http://file2.renrendoc.com/fileroot_temp3/2021-11/14/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c166/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c1662.gif)
![4章目的基因的制備_第3頁](http://file2.renrendoc.com/fileroot_temp3/2021-11/14/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c166/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c1663.gif)
![4章目的基因的制備_第4頁](http://file2.renrendoc.com/fileroot_temp3/2021-11/14/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c166/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c1664.gif)
![4章目的基因的制備_第5頁](http://file2.renrendoc.com/fileroot_temp3/2021-11/14/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c166/a90230c7-e8cb-44b3-a9b3-5285fa58c1665.gif)
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、第四章第四章 目的基因的制備目的基因的制備一、目的基因一、目的基因 為使優(yōu)良性狀聚集于同一生物體,在為使優(yōu)良性狀聚集于同一生物體,在生物群體中分離其編碼蛋白(酶)的生物群體中分離其編碼蛋白(酶)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因基因,創(chuàng)造出有價(jià)值的新物種。,創(chuàng)造出有價(jià)值的新物種。生物界的長(zhǎng)期進(jìn)化積累了大量對(duì)人類生物界的長(zhǎng)期進(jìn)化積累了大量對(duì)人類有用的基因,這是一個(gè)寶貴的資源。有用的基因,這是一個(gè)寶貴的資源。 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)、核糖體識(shí)別區(qū)、編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)、核糖體識(shí)別區(qū)、編碼區(qū)(起譯碼起譯碼atg、orf、休止碼、休止碼tag或或taa或或tga)、終止轉(zhuǎn)錄區(qū)、終止轉(zhuǎn)錄區(qū)(1)原核生物基因的組成)原核生物基因的組成基因區(qū)
2、:操縱子?;蛑g有間隔序列基因區(qū):操縱子?;蛑g有間隔序列啟動(dòng)區(qū):?jiǎn)?dòng)區(qū):rna聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的片段聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的片段 sd區(qū):起譯碼區(qū):起譯碼atg上游約上游約10bp處的富含嘌呤的保守區(qū),其轉(zhuǎn)錄物:處的富含嘌呤的保守區(qū),其轉(zhuǎn)錄物: 5aggaggu3,核糖體,核糖體16s rrna識(shí)別、結(jié)合識(shí)別、結(jié)合mrna的位置的位置轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子:分別指基因或操縱子轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子:分別指基因或操縱子3 端提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的端提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的dna序列;協(xié)助序列;協(xié)助mrna聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助蛋白。聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助蛋白。 原核的終止子在終止點(diǎn)之前
3、有一回文結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)發(fā)夾原核的終止子在終止點(diǎn)之前有一回文結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)發(fā)夾 。 1 1、結(jié)構(gòu)基因的組成、結(jié)構(gòu)基因的組成基因區(qū):基因區(qū):atg + extrons + introns + taa(tga或或tag) 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū):轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū):r、m、trna分別由分別由rna聚合酶聚合酶、轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄。 編碼蛋白的啟動(dòng)子編碼蛋白的啟動(dòng)子( rna聚合酶聚合酶識(shí)別識(shí)別)可尋找三個(gè)保守區(qū):可尋找三個(gè)保守區(qū): -20-30的的tataa/ta區(qū)區(qū)(hogness框框):解鏈,決定起錄點(diǎn):解鏈,決定起錄點(diǎn) -75的的9bp共有序列共有序列g(shù)gt/ccaatct區(qū)區(qū)(caat框框): 與與rna
4、聚合酶結(jié)合有關(guān)聚合酶結(jié)合有關(guān) -75區(qū)上游有一共有序列區(qū)上游有一共有序列g(shù)ggcgc (gc框框):結(jié)合某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合某些轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄終止區(qū)轉(zhuǎn)錄終止區(qū):(3 3)其他基因組基因的組成)其他基因組基因的組成 質(zhì)粒質(zhì)粒(無內(nèi)含子無內(nèi)含子) 、 病毒病毒(重疊基因重疊基因) 、 線粒體線粒體(缺少缺少 sd序列序列) 、葉綠體、葉綠體(多順反子多順反子) 。(2)真核生物基因的組成)真核生物基因的組成2、基因的排列、基因的排列一般:直線排列于一般:直線排列于dnadna上,且兩基因之間有非編碼序列。上,且兩基因之間有非編碼序列。特例:特例:(1)重疊基因)重疊基因(2)重復(fù)基因)重復(fù)基因 約約30
5、%真核基因是多拷貝真核基因是多拷貝(3)加倍基因)加倍基因 較高等的生物基因組是二倍體或多倍體較高等的生物基因組是二倍體或多倍體 質(zhì)粒在宿主內(nèi)是多拷貝質(zhì)粒在宿主內(nèi)是多拷貝(3)基因重排)基因重排 基因組中同一基因簇處于不同細(xì)胞而發(fā)生基因排列變化基因組中同一基因簇處于不同細(xì)胞而發(fā)生基因排列變化二、目的基因的制備二、目的基因的制備1、直接分離法、直接分離法(1)限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法)限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法已定序已定序(一次或多次酶切、純化)(一次或多次酶切、純化) 已定位已定位(兩側(cè)的識(shí)別位點(diǎn)酶切)(兩側(cè)的識(shí)別位點(diǎn)酶切) 未定序或無定位未定序或無定位(酶切、構(gòu)建簡(jiǎn)單文庫釣出)(酶切、構(gòu)建
6、簡(jiǎn)單文庫釣出)(2)基因分離的物理化學(xué)法)基因分離的物理化學(xué)法密度梯度離心法(富含密度梯度離心法(富含gcgc的片段浮力密度大)的片段浮力密度大) 單鏈酶解法(富含單鏈酶解法(富含gcgc的的片段片段tmtm高)高) 分子雜交法分子雜交法 待分離的基因序列待分離的基因序列: 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)+編碼區(qū)編碼區(qū)+終止區(qū)、終止區(qū)、完整操縱子或基因簇、只具編碼序列的基因區(qū)、完整操縱子或基因簇、只具編碼序列的基因區(qū)、 只含啟動(dòng)子或終止子的只含啟動(dòng)子或終止子的dna片段片段2、構(gòu)建基因組文庫分離法、構(gòu)建基因組文庫分離法(1)基因組文庫的定義)基因組文庫的定義 用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲(chǔ)存
7、于一個(gè)受體菌的用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲(chǔ)存于一個(gè)受體菌的群體,即構(gòu)成了這種生物的基因組文庫。若只儲(chǔ)存某生物基因組的部分群體,即構(gòu)成了這種生物的基因組文庫。若只儲(chǔ)存某生物基因組的部分遺傳信息,即構(gòu)成部分基因組文庫。遺傳信息,即構(gòu)成部分基因組文庫。(2)基因組文庫的大小)基因組文庫的大小 n=ln( 1-p )/ln( 1-f )n:文庫必需的克隆數(shù)文庫必需的克隆數(shù) p:文庫中目的文庫中目的dna片段的出現(xiàn)概率片段的出現(xiàn)概率 f:插入片段大小插入片段大小/全基因組大小的比值全基因組大小的比值(3)構(gòu)建)構(gòu)建噬菌體基因組文庫的步驟噬菌體基因組文庫的步驟獲得含基因的獲得含基因的dna片
8、段片段 與與噬菌體克隆載體重組噬菌體克隆載體重組轉(zhuǎn)化受體菌并篩選重組子(見導(dǎo)入受體細(xì)胞第五章)轉(zhuǎn)化受體菌并篩選重組子(見導(dǎo)入受體細(xì)胞第五章)3、cdna基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離(1)c dna文庫的概念文庫的概念 直接從生物體分離目的基因很困難,但在某一特定發(fā)育期和特定組直接從生物體分離目的基因很困難,但在某一特定發(fā)育期和特定組織僅表達(dá)總基因數(shù)的織僅表達(dá)總基因數(shù)的15%15%,據(jù)次從分離大大降低難度。,據(jù)次從分離大大降低難度。 某生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部或部分某生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部或部分m rnam rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種種c dnac dna
9、片段,分別與載體重組而存在于一種受體的群體,片段,分別與載體重組而存在于一種受體的群體, 即即c dnac dna基因基因( (部分部分) )文庫文庫。分表達(dá)型分表達(dá)型( (如如gt11)gt11):插入片段可表達(dá)融合蛋白,有活性、抗原性。:插入片段可表達(dá)融合蛋白,有活性、抗原性。非表達(dá)型:適于分離可用核苷酸探針雜交篩選的目的基因非表達(dá)型:適于分離可用核苷酸探針雜交篩選的目的基因 探針探針( (從已知部分蛋白序列推測(cè)的人工合成從已知部分蛋白序列推測(cè)的人工合成, ,同種或?qū)俚囊阎蛄型N或?qū)俚囊阎蛄? )按所用載體分按所用載體分: :質(zhì)粒質(zhì)粒( (含克隆數(shù)少,適于高豐度含克隆數(shù)少,適于高豐度m
10、rna)mrna) 噬菌體噬菌體 ( (含克隆數(shù)多,適于低或極低豐度含克隆數(shù)多,適于低或極低豐度mrna)mrna)4 4、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)套式)套式pcr(2)反向)反向pcr(3)不對(duì)稱)不對(duì)稱pcr(4)錨定)錨定pcr(5)長(zhǎng)程)長(zhǎng)程pcr(6)反轉(zhuǎn)錄)反轉(zhuǎn)錄pcr(7)鍋柄)鍋柄pcr(8)alu pcr5 5、基因的化學(xué)合成、基因的化學(xué)合成(1 1)基因化學(xué)合成的概況)基因化學(xué)合成的概況 19791979年首次化學(xué)合成有活性的大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸基因年首次化學(xué)合成有活性的大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸基因. .現(xiàn)現(xiàn)用用d
11、nadna合成儀快速合成寡核苷酸片段合成儀快速合成寡核苷酸片段, ,再用酶化學(xué)法獲得目的基因再用酶化學(xué)法獲得目的基因dnadna片段片段. .(2 2)基因的組裝方式)基因的組裝方式 150150200bp200bp以內(nèi)可化學(xué)合成以內(nèi)可化學(xué)合成. .要獲得較大的高等真核基因必須設(shè)計(jì)一要獲得較大的高等真核基因必須設(shè)計(jì)一種特殊方法種特殊方法, ,能把合成的能把合成的dnadna片段構(gòu)建成完整的基因的過程片段構(gòu)建成完整的基因的過程. .稱為基因組稱為基因組裝裝.20.20世紀(jì)世紀(jì)7070年代提出年代提出, ,常用的有兩種常用的有兩種: : 全片段酶促連接法全片段酶促連接法: : 酶促填充法酶促填充法
12、: :三、目的基因的分離三、目的基因的分離(一)(一) 篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)1 1、差別雜交、差別雜交定義定義:分別制備兩種細(xì)胞群體的分別制備兩種細(xì)胞群體的mrna提取物,其中一個(gè)提取物,其中一個(gè)群體含有目的基因群體含有目的基因mrna,另一個(gè)群體不含。以這兩種總,另一個(gè)群體不含。以這兩種總mrna(或其(或其c dna)為探針,分別篩選由表達(dá)目的基因的為探針,分別篩選由表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建的細(xì)胞群體構(gòu)建的c dna文庫。文庫。 缺點(diǎn):缺點(diǎn):2 2、減法雜交技術(shù)、減法雜交技術(shù)定義:通過定義:通過dnadna復(fù)性動(dòng)力學(xué)富集目的基因序列,并
13、構(gòu)建減數(shù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)富集目的基因序列,并構(gòu)建減數(shù)文庫來克隆目的基因。其本質(zhì)是盡量消除兩種樣品共同存文庫來克隆目的基因。其本質(zhì)是盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列,從而有效富集目的基因序列。在的基因序列,從而有效富集目的基因序列。(1 1)mrnamrna減法雜交減法雜交 從表達(dá)目的基因的組織提取從表達(dá)目的基因的組織提取mrnamrna并反轉(zhuǎn)錄為并反轉(zhuǎn)錄為c dnac dna,再,再與無目的基因表達(dá)的組織提取的與無目的基因表達(dá)的組織提取的mrnamrna做過量雜交,兩者均做過量雜交,兩者均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成c dna/mrnac dna/mrna雜交分子,而特異雜交分子,而特
14、異mrnamrna反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄的c dnac dna仍單鏈,將其分離即為差異表達(dá)序列。仍單鏈,將其分離即為差異表達(dá)序列。(二)利用差示分析法分離目的基因克?。ǘ├貌钍痉治龇ǚ蛛x目的基因克隆1 1、 mrnamrna差別顯示技術(shù)(差別顯示反轉(zhuǎn)錄差別顯示技術(shù)(差別顯示反轉(zhuǎn)錄pcrpcr)原理:圖原理:圖優(yōu)點(diǎn):可檢測(cè)表達(dá)的所有基因;同時(shí)檢測(cè)基因的上、下調(diào)表優(yōu)點(diǎn):可檢測(cè)表達(dá)的所有基因;同時(shí)檢測(cè)基因的上、下調(diào)表達(dá)、展現(xiàn)所有差異、比較多種細(xì)胞類型;達(dá)、展現(xiàn)所有差異、比較多種細(xì)胞類型;缺點(diǎn):檢測(cè)全部缺點(diǎn):檢測(cè)全部mrnamrna的的pcrpcr工作量很大;工作量很大;pagepage分離的分離的c d
15、nac dna大大于于500bp500bp時(shí)會(huì)漏檢,凝膠分析最多為時(shí)會(huì)漏檢,凝膠分析最多為5050100100條;差別條帶成條;差別條帶成簇時(shí)造成假陽性;簇時(shí)造成假陽性;northernnorthern印記繁雜費(fèi)時(shí);本底較高。印記繁雜費(fèi)時(shí);本底較高。 2 2、代表性差別分析技術(shù)(、代表性差別分析技術(shù)(rdarda):): 比較突變型(比較突變型(driver driver dnadna)與野生型()與野生型(tester dna tester dna )基因組之間的差異來分離和)基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。如鑒定突變基因的方法。如c dna-radc dna-rad:(三)應(yīng)用
16、基因定位克隆技術(shù)分離篩選目的基因(三)應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離篩選目的基因又叫作圖克隆又叫作圖克隆( (或候選基因克隆或候選基因克隆) ,) ,是根據(jù)目的基因的位置是根據(jù)目的基因的位置特性而非其編碼產(chǎn)物來克隆。成功分離目的基因須具備三特性而非其編碼產(chǎn)物來克隆。成功分離目的基因須具備三個(gè)必要條件:個(gè)必要條件:rflprflp:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,用特定的限制性核酸內(nèi)切:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,用特定的限制性核酸內(nèi)切酶切割有關(guān)酶切割有關(guān)dnadna分子,產(chǎn)生的分子,產(chǎn)生的dnadna分子長(zhǎng)度上的變化分子長(zhǎng)度上的變化rapdrapd:用:用1010個(gè)堿基的隨機(jī)引物個(gè)堿基的隨機(jī)引物pcrpcr擴(kuò)增特定
17、擴(kuò)增特定dnadna分子,獲得分子,獲得的一系列不同長(zhǎng)度的的一系列不同長(zhǎng)度的dnadna片段。片段。染色體步查法分離目的基因染色體步查法分離目的基因 (四)根據(jù)生物大分子間的相互(四)根據(jù)生物大分子間的相互 作用分離目的作用分離目的cdnacdna克隆克隆酵母雙雜合系統(tǒng)酵母雙雜合系統(tǒng)真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子:真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子:bd adbd ad圖圖終止終止轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)啟動(dòng)區(qū)核糖體核糖體識(shí)別區(qū)識(shí)別區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)atgatgtaataatagtagtgatgaatgatgtaataatagtagtgatga間隔序列間隔序列轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)啟動(dòng)區(qū)基因區(qū)基因區(qū)斷裂基因
18、斷裂基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄終止區(qū)終止區(qū)mrna mrna 為模板合為模板合成方法常用的成方法常用的有兩種:一種有兩種:一種如左圖;另一如左圖;另一種隨機(jī)引物引種隨機(jī)引物引導(dǎo)合成法。導(dǎo)合成法。隨機(jī)引物引導(dǎo)的隨機(jī)引物引導(dǎo)的c dna合成法:合成法: 根據(jù)可能序列合成出所有根據(jù)可能序列合成出所有610個(gè)核苷酸組成個(gè)核苷酸組成的寡片段,這種混合物可與的寡片段,這種混合物可與mrna模板在多位點(diǎn)同模板在多位點(diǎn)同時(shí)雜交,且可作為合成第一鏈的引物。時(shí)雜交,且可作為合成第一鏈的引物。 這種方法可從這種方法可從mrna模板的多位點(diǎn)同時(shí)合成模板的多位點(diǎn)同時(shí)合成c dna,能包含模板的完整信息,故適于較長(zhǎng)的,能包含模板的完整
19、信息,故適于較長(zhǎng)的mrna分子克隆。分子克隆。4-22 4-22 減數(shù)雜交減數(shù)雜交分離分離t t細(xì)胞受體基因細(xì)胞受體基因圖圖4-24 差別顯差別顯示分析基本流程示分析基本流程二、目的基因的制備二、目的基因的制備(3)雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因)雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因適于真核蛋白已分離純化適于真核蛋白已分離純化 。核糖體。核糖體+ mrna 多核糖體多核糖體+核蛋白核蛋白抗體抗體 孵育,形成復(fù)合體孵育,形成復(fù)合體 +二抗二抗 不連續(xù)蔗糖梯度離心不連續(xù)蔗糖梯度離心分離出含待定分離出含待定mrna的多核糖體的多核糖體 酚、氯仿抽提,柱層析分離酚、氯仿抽提,柱層析分離出含特定編碼蛋白的出含
20、特定編碼蛋白的mrna 反轉(zhuǎn)錄目的反轉(zhuǎn)錄目的c dna改進(jìn):改進(jìn):spa替代二抗發(fā)展出替代二抗發(fā)展出spa-sepharose 4b親和柱介質(zhì)分離更有效親和柱介質(zhì)分離更有效 (4)利用酶促反轉(zhuǎn)錄法直接從特定)利用酶促反轉(zhuǎn)錄法直接從特定mrna分離基因分離基因 mrna cdna dscdna反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶聚合酶2、構(gòu)建基因組文庫分離法、構(gòu)建基因組文庫分離法(4 4)構(gòu)建考斯質(zhì)?;蚪M文庫)構(gòu)建考斯質(zhì)粒基因組文庫 優(yōu)優(yōu): : 比比噬菌體容納的外源噬菌體容納的外源dnadna大大(30(3045kb),45kb),構(gòu)建完整文庫所需克隆數(shù)構(gòu)建完整文庫所需克隆數(shù)少少; ; 載體僅約載體僅約5k
21、b,5kb,可直接分析插入片段的限制性圖譜可直接分析插入片段的限制性圖譜, ,而而噬菌體則否噬菌體則否. . 缺點(diǎn)缺點(diǎn) : : 難篩選難篩選; ;重組效率低重組效率低(10(105 56 610104 45 5clongs/gdna);clongs/gdna);不易儲(chǔ)存不易儲(chǔ)存. . 基因組文庫的構(gòu)建過程基因組文庫的構(gòu)建過程: :酶解制備外源酶解制備外源dna;dna;酶切載體酶切載體; ;連接重組并包裝連接重組并包裝進(jìn)噬菌體進(jìn)噬菌體; ;重組體轉(zhuǎn)染宿主菌。重組體轉(zhuǎn)染宿主菌。(5 5)構(gòu)建)構(gòu)建yacyac基因組文庫基因組文庫 以質(zhì)粒以質(zhì)粒pbr322pbr322為骨架為骨架, ,保留復(fù)制位點(diǎn)
22、保留復(fù)制位點(diǎn)oriori和篩選標(biāo)記和篩選標(biāo)記ampampr r, ,并加入酵母并加入酵母染色體必需的五個(gè)組件而構(gòu)建染色體必需的五個(gè)組件而構(gòu)建yacyac載體載體. .常用常用p yac4p yac4構(gòu)建文庫構(gòu)建文庫. . ecori+bamhi ecori+bamhi 雙酶切雙酶切 p yac4; p yac4; 制備生物體完整基因組并片段化制備生物體完整基因組并片段化; ; 連接轉(zhuǎn)化。連接轉(zhuǎn)化。3、cdna基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離(2)cdna文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建分離細(xì)胞總分離細(xì)胞總rna以以mrna 為模板,合成為模板,合成cdna 第一鏈第一鏈雙鏈雙鏈
23、cdna 的合成的合成常用方法常用方法:第一第一 第二第二 第三第三 第四、五第四、五將合成的雙鏈將合成的雙鏈dna重組入載體,導(dǎo)入宿主重組入載體,導(dǎo)入宿主(大腸桿菌大腸桿菌)增殖增殖(3)mrna的豐度與的豐度與cdna基因文庫大小的關(guān)系基因文庫大小的關(guān)系 要獲得高豐度的某要獲得高豐度的某mrna, 必須選好適當(dāng)?shù)牟牧媳仨氝x好適當(dāng)?shù)牟牧?文庫中文庫中c dna的克隆數(shù)的克隆數(shù)=細(xì)胞總細(xì)胞總mrna數(shù)數(shù)/ /細(xì)胞中某種細(xì)胞中某種mrna的拷貝數(shù)的拷貝數(shù) 實(shí)際需構(gòu)建的最小值遠(yuǎn)超過公式理論值實(shí)際需構(gòu)建的最小值遠(yuǎn)超過公式理論值, 可按可按n=ln( 1-p ) / ln( 1-f )估算估算n: c
24、 dna基因文庫必需的克隆數(shù)基因文庫必需的克隆數(shù) p:文庫中含目的基因文庫中含目的基因c dna片段的片段的出現(xiàn)概率出現(xiàn)概率 f:某某mrna 的豐度的豐度 / 總總mrna數(shù)數(shù)的比值的比值3、c dna基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離(4)c dna克隆的優(yōu)越性克隆的優(yōu)越性 根據(jù)前估算公式根據(jù)前估算公式, 提高目的基因提高目的基因mrna在總數(shù)的比例可減少在總數(shù)的比例可減少c dna文庫的克隆子數(shù)文庫的克隆子數(shù),構(gòu)建前用各種方法富集和提高目的構(gòu)建前用各種方法富集和提高目的mrna豐度豐度,可降低可降低文庫的復(fù)雜性和分離難度文庫的復(fù)雜性和分離難度. 與基因組文庫相比
25、與基因組文庫相比,在構(gòu)建和基因分離方法上有在構(gòu)建和基因分離方法上有:某些某些rna病毒分離的唯一方法病毒分離的唯一方法; 假陽性率降低假陽性率降低; 直接用于基因操直接用于基因操作作; 研究真核細(xì)胞研究真核細(xì)胞mrna的結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)構(gòu)和功能. 局限性局限性:所含遺傳信息遠(yuǎn)小于基因組文庫所含遺傳信息遠(yuǎn)小于基因組文庫,受細(xì)胞來源或發(fā)育時(shí)受細(xì)胞來源或發(fā)育時(shí)期的影響期的影響;不能直接獲取基因內(nèi)含子和編碼區(qū)外的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與不能直接獲取基因內(nèi)含子和編碼區(qū)外的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能信息功能信息;高豐度高豐度mrna的的c dna比例較高比例較高,分離較易分離較易,而低豐度的比例而低豐度的比例較低較低,較
26、難較難.人工合成完整基人工合成完整基因的所有寡核片因的所有寡核片段段, ,相鄰的有相鄰的有4 46bp6bp重疊互補(bǔ)重疊互補(bǔ), ,適適當(dāng)條件復(fù)性形成當(dāng)條件復(fù)性形成帶粘末段的雙鏈帶粘末段的雙鏈. .t4 dnat4 dna連接連接酶酶促形成酶酶促形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵. .只合成完整基只合成完整基因的一些片段因的一些片段, ,相鄰相鄰33的短的短序列互補(bǔ)序列互補(bǔ), ,適適當(dāng)條件復(fù)性形當(dāng)條件復(fù)性形成模板成模板( (引物引物復(fù)合復(fù)合體體).klenow).klenow片片段將四種段將四種dntpdntp填補(bǔ)互補(bǔ)鏈之填補(bǔ)互補(bǔ)鏈之間的單鏈區(qū)間的單鏈區(qū), , t4 dnat4 dna連接酶連接酶連接連接, ,限制性限制
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2025年住房公積金購(gòu)房交易操作指引協(xié)議
- 2025年專利發(fā)展戰(zhàn)略聯(lián)盟協(xié)議
- 2025年修理廠噴漆施工承包協(xié)議綜合
- 2025年太陽能發(fā)電合同模板
- 2025年中外合作醫(yī)療機(jī)構(gòu)員工合同模板
- 2025年企業(yè)業(yè)務(wù)策劃合作標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議
- 2025年倉儲(chǔ)與搬運(yùn)服務(wù)協(xié)議
- 2025年二手車交易平臺(tái)合同
- 2025年官方策劃贈(zèng)房協(xié)議書標(biāo)準(zhǔn)版
- 2025年二手房含車位買賣合同范本
- 源代碼審計(jì)報(bào)告模板
- 施工組織設(shè)計(jì)模板
- 含碘對(duì)比劑靜脈外滲護(hù)理管理實(shí)踐指南
- 萃取技術(shù) 多級(jí)逆流萃取
- 部編版小學(xué)五年級(jí)語文教材培訓(xùn)課件【部編】
- 盆景造型經(jīng)驗(yàn)
- 能力不足方面存在的問題及整改措施【9篇】
- 悟真篇-薛道光注
- 重大危險(xiǎn)源公示牌(完整)-2
- 物理學(xué)史中國(guó)古代物理學(xué)
- 初一英語英語閱讀理解專項(xiàng)訓(xùn)練15篇
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論