化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

1、 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測(cè)定（發(fā)光酶免疫測(cè)定（c cleialeia）（chemiluminescence enzyme immunoasssaychemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三節(jié)第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(clia)(clia)（chemiluminescence immunoassaychemiluminescence immunoassay） 第四章第四章 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)( (ecli)ecli)(elect

2、rochemiluminescence immunoassay)(electrochemiluminescence immunoassay) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學(xué)集靈敏的化學(xué) 發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè) 定于一體的檢測(cè)技術(shù)。定于一體的檢測(cè)技術(shù)。概概 念念 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 特異性高、敏感性高、分離簡(jiǎn)便、特異性高、敏感性高、分離簡(jiǎn)便、 快速、試劑無(wú)毒、安全穩(wěn)定、快速、試劑無(wú)毒、安全穩(wěn)定、 可自動(dòng)化。可自動(dòng)化。化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型 按發(fā)光劑不同分為按發(fā)光劑不同分為 1.1.發(fā)光酶免疫測(cè)定（發(fā)光酶免疫測(cè)定（c clei

3、aleia） chemiluminescence enzymeimmunoasssaychemiluminescence enzymeimmunoasssay 2. 2.化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(clia)(clia) chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay 3. 3.電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)( (ecli)ecli) electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay 按分離方法不同

4、分按分離方法不同分 1.1.微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 2.2.磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一、發(fā)光 一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)， 釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.1.光照發(fā)光光照發(fā)光: :發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激 發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。2.2.生物發(fā)光生物發(fā)光: :反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用 atpatp

5、產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回 復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。3.3.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光: :在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。 化學(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程。化學(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程。 熒光素酶熒光素酶atp；o2；mg2+氧化螢火蟲(chóng)熒光素氧化螢火蟲(chóng)熒光素螢火蟲(chóng)熒光素螢火蟲(chóng)熒光素光光 + amp+ o2 + co2 +化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光 機(jī)制：機(jī)制：某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能 量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子量使其產(chǎn)物分子或反

6、應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子 激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基 態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。 化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物：化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參 與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量 的化合物。的化合物。 發(fā)光劑分為發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑熒光素、生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑 能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)； 與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑； 偶聯(lián)后仍保留高的

7、量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力；偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力； 應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性， 特別是免疫活性。特別是免疫活性?；瘜W(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件1.1.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物 是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。發(fā)光底物。 cleiacleia中常用的酶有中常用的酶有hrphrp和和apap hrp hrp的發(fā)光底物有魯米諾、對(duì)的發(fā)光底物有魯米諾、對(duì)- -羥基苯乙酸羥基苯乙酸 apap的發(fā)光底物有的發(fā)光底物有amppdamppd、4-mup4-mup（熒光底物）（

8、熒光底物） 特點(diǎn)：可作標(biāo)記物、也可作過(guò)氧化物酶的底物特點(diǎn)：可作標(biāo)記物、也可作過(guò)氧化物酶的底物 1.1 1.1 魯米諾魯米諾h2o2 /oh hrp+n2 + h2o +光光對(duì)對(duì)- -羥基苯乙酸（羥基苯乙酸（hpahpa） hpa hpa在在h h2 2o o2 2存在下被存在下被hrphrp氧化成氧化二聚體（熒光氧化成氧化二聚體（熒光 物質(zhì)），在物質(zhì)），在350nm350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm450nm波長(zhǎng)波長(zhǎng) 的熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。的熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。 1.2 hpa 1.2 hpah2o2hrp+熒熒 光光coohhochcoohhoch22氧化二

9、聚體氧化二聚體amppdamppd amppd amppd在堿性條件下，被在堿性條件下，被apap酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的 amp-damp-d陰離子，其有陰離子，其有2 230min30min的分解半衰期，發(fā)的分解半衰期，發(fā) 出波長(zhǎng)為出波長(zhǎng)為470nm470nm的持續(xù)性光，在的持續(xù)性光，在15min15min時(shí)其強(qiáng)度時(shí)其強(qiáng)度 達(dá)到高峰，達(dá)到高峰，151560min60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。 光光ap /oh hpo4 2o ooch3o- 1.3 amppd 1.3 amppd4-mup4-mup 發(fā)出發(fā)出448nm448nm的熒光的熒光4-mup被被

10、ap催化生成催化生成4-甲基傘形酮，在甲基傘形酮，在360nm的的 激發(fā)光的作用下，激發(fā)光的作用下，可用熒，可用熒 光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。熒熒光光ap 1.4 4-mup 1.4 4-mup4-mu4-mu360nm360nm激發(fā)光激發(fā)光h h3 3popo4 4 + +2.2.直接化學(xué)發(fā)光劑直接化學(xué)發(fā)光劑特點(diǎn)：特點(diǎn)：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱牟恍璐呋瘎?，只需改變?nèi)芤旱膒hph等條件等條件 就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、 信比高，發(fā)光量與信比高，發(fā)光量與aeae濃度呈線性關(guān)系。濃度呈線性關(guān)系。 常用試劑：常用試劑：吖啶酯（吖啶酯（acridi

11、nium，aeae）+ co+ co2 2+ + 光光nch3coorho+2-nch3c ooronch3c ooo3.3.電化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑 是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出 光的物質(zhì)。光的物質(zhì)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：反應(yīng)在電極進(jìn)行；反應(yīng)在電極進(jìn)行； 電子供體為：三丙胺（電子供體為：三丙胺（tpatpa） 化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕三聯(lián)毗啶釕三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖分子結(jié)構(gòu)圖nnnnnnruoonoo第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測(cè)定發(fā)光酶免疫測(cè)定（cleia）一、原理一、原理 屬于酶免疫測(cè)定的一種。只是最后一屬于酶免疫測(cè)定的一種。只是最后一

12、 步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過(guò)發(fā)光反應(yīng)步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過(guò)發(fā)光反應(yīng) 發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。二、技術(shù)類型二、技術(shù)類型 根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為：根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為： 1.1.熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)熒光酶免疫測(cè)定技術(shù) 2.2.化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù) 根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分 1.1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法雙抗體夾心法和雙抗原夾心法 3.3.固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法：固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法： 熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖eeeee 洗滌洗滌棄上清棄上清e(cuò)e堿 性 磷 酸 酶 標(biāo) 記 抗 體

13、e抗 體 包 被塑 料 微 珠樣 本抗 原 4mu激發(fā)熒光e 是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有 強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖eeeee 洗滌洗滌棄上清棄上清e(cuò)e堿 性 磷 酸 酶 標(biāo) 記 抗 體e抗 體 包 被塑 料 微 珠樣 本抗 原amppdea m p p d 發(fā) 光 是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光， 通過(guò)光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。通過(guò)光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。電化學(xué)發(fā)光原理

14、圖電化學(xué)發(fā)光原理圖 這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行 產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定不穩(wěn)定t p a+t p ar u (b p y )3 +r u ( b p y )r u ( b p y )2 +光 子 ( 6 2 0 n m )333*基態(tài)基態(tài)電極電極1.1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 將已包被了抗體的乳膠微將已包被了抗體的乳膠微 粒和待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時(shí)間粒和待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時(shí)間 后后, ,再加入再加入apap標(biāo)記抗體，溫育標(biāo)記抗體，溫育, ,形成固相包被抗形成固相包被抗

15、體體- -抗原抗原- -酶標(biāo)抗體復(fù)合物酶標(biāo)抗體復(fù)合物 技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) 2.2.分離技術(shù)分離技術(shù) 將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩 沖液洗滌，沒(méi)結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體沖液洗滌，沒(méi)結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體- -抗抗 原原- -膠乳微粒抗體復(fù)合物則被保留在纖維膜上。膠乳微粒抗體復(fù)合物則被保留在纖維膜上。3.3.酶促發(fā)光反應(yīng)酶促發(fā)光反應(yīng) 加入加入4-mup4-mup，酶標(biāo)抗體上，酶標(biāo)抗體上apap將將 4-mup4-mup分解，形成分解，形成4-mu4-mu，它在，它在360nm360nm激發(fā)光的照激發(fā)光的照 射下，發(fā)出射下，發(fā)出448nm448nm的熒光，經(jīng)熒光儀

16、記錄，放大，的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量1.1.磁顆粒分離法：磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒用抗原或抗體包被磁顆粒, ,與標(biāo)與標(biāo) 本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過(guò)本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過(guò) 一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后, ,最終通過(guò)磁場(chǎng)將結(jié)合最終通過(guò)磁場(chǎng)將結(jié)合 酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物icic和游離酶標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。和游離酶標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。 分離技術(shù)分離技術(shù)2.2.微粒子捕獲法：微粒子捕獲法：所用顆粒是無(wú)磁性微粒子作為所用顆粒是無(wú)磁性微粒子作為 抗體或抗原的包被載體抗體

17、或抗原的包被載體, , 然后用纖維膜柱子進(jìn)然后用纖維膜柱子進(jìn) 行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.3.包被珠分離法：包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠用聚苯乙稀等材料制成小珠, ,在在 小珠上包被抗原或抗體小珠上包被抗原或抗體, ,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后, ,將將 結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離. . 第三節(jié)第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（clia）一、原理一、原理 用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體, ,與與 待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)abab或或

18、agag、磁顆粒性的、磁顆粒性的agag或或abab反反 應(yīng)，通過(guò)磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離應(yīng)，通過(guò)磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離 狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開(kāi)來(lái)，然后加入狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開(kāi)來(lái)，然后加入 發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的 檢測(cè)進(jìn)行定量或定性檢測(cè)檢測(cè)進(jìn)行定量或定性檢測(cè) 。二、技術(shù)類型二、技術(shù)類型 1.1.分離方法分離方法 常用磁顆粒分離技術(shù)常用磁顆粒分離技術(shù) 2.2.免疫學(xué)反應(yīng)模式免疫學(xué)反應(yīng)模式 同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) 3.3.不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶

19、1.1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 將包被將包被mcabmcab的磁顆粒和待的磁顆粒和待 測(cè)標(biāo)本加入到反應(yīng)管中，標(biāo)本中待測(cè)測(cè)標(biāo)本加入到反應(yīng)管中，標(biāo)本中待測(cè)agag與磁珠與磁珠 上上abab結(jié)合，再加上結(jié)合，再加上aeae標(biāo)記標(biāo)記abab，經(jīng)過(guò)溫育，形成，經(jīng)過(guò)溫育，形成 磁珠磁珠abab- -agag-ae-ae標(biāo)記標(biāo)記abab復(fù)合物。復(fù)合物。 技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) 2.2.分離技術(shù)分離技術(shù) 在電磁場(chǎng)中進(jìn)行在電磁場(chǎng)中進(jìn)行2-32-3次洗滌后，很快次洗滌后，很快 地將未結(jié)合的多余地將未結(jié)合的多余agag和標(biāo)記和標(biāo)記abab洗去。洗去。3.3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 經(jīng)洗滌的磁經(jīng)洗滌的磁珠珠中，

20、加入中，加入h h2 2o o2 2和和 phph糾正液糾正液naohnaoh，這時(shí)，這時(shí)aeae不需要催化劑即分解并不需要催化劑即分解并 發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記 錄錄1 1s s內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測(cè)物含量?jī)?nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測(cè)物含量 成正比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器可計(jì)算出被測(cè)物含量。成正比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器可計(jì)算出被測(cè)物含量。 1.ae 1.ae其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速而無(wú)催其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速而無(wú)催 化劑?；瘎?。方法評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià) 2.ae2.ae與大分子的結(jié)合并無(wú)減少所產(chǎn)生的光量，與大分子的結(jié)合并無(wú)減

21、少所產(chǎn)生的光量， 從而增加靈敏度，靈敏度可達(dá)從而增加靈敏度，靈敏度可達(dá)10-15g/ml10-15g/ml。3.ae3.ae標(biāo)記試劑有效期長(zhǎng)，可達(dá)一年。標(biāo)記試劑有效期長(zhǎng)，可達(dá)一年。4.4.固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉，除增大包被固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉，除增大包被 面積，加快反應(yīng)外，亦同時(shí)使清洗及分離更面積，加快反應(yīng)外，亦同時(shí)使清洗及分離更 簡(jiǎn)易、快捷。簡(jiǎn)易、快捷。第四節(jié)第四節(jié) 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（ecli）一、原理一、原理 是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特 異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和

22、化 學(xué)發(fā)光二個(gè)過(guò)程。學(xué)發(fā)光二個(gè)過(guò)程。eclecl是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而clcl 是通過(guò)化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光是通過(guò)化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光 劑三聯(lián)吡啶釕劑三聯(lián)吡啶釕ru(bpy)3ru(bpy)32+2+標(biāo)記標(biāo)記abab，通過(guò)，通過(guò)ag-abag-ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極 上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的agag或或abab進(jìn)行定量進(jìn)行定量/ /定性。定性。二、技術(shù)類型二、技術(shù)類型 1.1.分離方法分離方法 常用磁顆粒分離技術(shù)常用磁顆粒分離技術(shù) 2.2.免疫學(xué)反應(yīng)模式免疫學(xué)反應(yīng)模式

23、 同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) 3.3.相應(yīng)標(biāo)記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶相應(yīng)標(biāo)記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶 1. 1.三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測(cè)標(biāo)本三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測(cè)標(biāo)本 同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育反應(yīng)同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育反應(yīng) 技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) 2. 2.將鏈霉親和素（將鏈霉親和素（sasa）包被磁珠加入反應(yīng)杯中，再次）包被磁珠加入反應(yīng)杯中，再次 孵育，使生物素（孵育，使生物素（b b）通過(guò)與親和素（）通過(guò)與親和素（a a）的結(jié)合，）的結(jié)合， 將磁珠、將磁珠、abab連接為一體，形成雙連接為一體，形成雙abab夾心法。夾心法。 3. 3.蠕動(dòng)泵將形成的蠕動(dòng)泵將形成的 ru(bpy)ru(bpy)3 3 2+2+-ab