油橄欖果渣多酚提取實(shí)驗(yàn)方案

1、油橄欖果渣多酚提取實(shí)驗(yàn)方案一、 油橄欖果渣預(yù)處理（一）油橄欖果渣的脫油1有機(jī)溶劑浸提法（油橄欖果渣油的提取工藝及其脂肪酸組成研究）1.1原料、儀器及試劑原料：油橄欖鮮果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：BS210S 型電子分析天平，DHZ -C 型大容量恒溫振蕩器，N -1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。試劑：正己烷為分析純?cè)噭? 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。1.2實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)確稱取10 g 粉碎后的油橄欖果渣，置于250mL具塞三角瓶中，按1:9的料液比加入溶劑; 將三角瓶置于55（50）的恒溫振蕩器中振蕩提取，轉(zhuǎn)速200 r /min（150 r /min），時(shí)間為3h; 用過濾法分離溶劑混合物與殘?jiān)靡欢?/p>

2、（5+5mL）溶劑洗滌殘?jiān)? 次，收集脫油油橄欖果渣，干燥至恒重（真空干燥：40，12h），計(jì)算脫油率。2.酶法（酶法輔助提取工藝對(duì)橄欖油品質(zhì)的影響）2.1原料、儀器及試劑原料：油橄欖鮮果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：BS210S 型電子分析天平，DHZ -C 型大容量恒溫振蕩器，N -1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、磁力攪拌器（可加熱）、高速離心機(jī)。試劑：纖維素酶; 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。2.2實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)確稱取10 g 粉碎后的油橄欖果渣，置于250 ml具塞三角瓶中，加入1.0%( W/W) 的纖維素酶水溶液10 ml，置于50的恒溫振蕩器中振蕩提取，轉(zhuǎn)速150 r /min，時(shí)間為45min，4

3、 000 r /min 離心20 min，去上層油脂，收集下層脫油的果渣，干燥至恒重（真空干燥：40，12h），計(jì)算脫油率。（二）油橄欖果渣的干燥1.油橄欖果渣的冷凍干燥1.1 原料、儀器及試劑原料：用上述油橄欖脫油果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：BS210S 型電子分析天平，冷凍干燥機(jī)。1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將原料果渣放入冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥預(yù)冷凍時(shí)間為24h，在干燥時(shí)間分別為12、24、36、48h的條件下對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，對(duì)所得樣品進(jìn)行粉碎，選過80目篩的樣品進(jìn)行多酚提取操作，以多酚得率為指標(biāo)確定最適宜干燥時(shí)間。2.油橄欖果渣的真空干燥2.1 原料、儀器及試劑原料：油橄欖脫油果渣，用

4、前在-20冰箱封存。儀器：BS210S 型電子分析天平，真空干燥機(jī)。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1 干燥溫度對(duì)油橄欖果渣得率的影響 將原料果渣放入真空干燥機(jī)，分別在溫度為30、40、50、60條件下對(duì)樣品進(jìn)行真空干燥處理12h，然后對(duì)所得樣品進(jìn)行粉碎，選過80目篩的樣品進(jìn)行多酚提取操作，以多酚得率為指標(biāo)確定最適宜真空干燥溫度。2.2.2 干燥時(shí)間對(duì)油橄欖果渣得率的影響 將原料果渣放入真空干燥機(jī)，在溫度為40，干燥時(shí)間分別為6、12、18、24h條件下對(duì)樣品進(jìn)行真空干燥處理，然后對(duì)所得樣品進(jìn)行粉碎，選過80目篩的樣品進(jìn)行多酚提取操作，以多酚得率為指標(biāo)確定最適宜真空干燥時(shí)間。3.油橄欖果渣干燥工藝的確

5、定根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳干燥方式和條件，作為油橄欖果渣干燥工藝。（三）油橄欖果渣的粉碎1.原料、儀器及試劑原料：用上述干燥后油橄欖果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：BS210S 型電子分析天平，超微粉碎儀，分樣篩（60、80、100、120目）。2實(shí)驗(yàn)步驟將原料果渣放入超微粉碎儀中粉碎一定時(shí)間后取出，分別用60、80、100、120目的分樣篩對(duì)樣品進(jìn)行篩分，制得不同粒度的果渣樣品，對(duì)這些果渣樣品進(jìn)行多酚提取操作（乙醇60%，料液比1：30，55，2h），以多酚得率為指標(biāo)確定最適宜的樣品粒度。二、 油橄欖多酚的提?。ㄒ唬?溶劑法提取油橄欖多酚1.實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑材料：經(jīng)上述預(yù)處理的油橄欖

6、果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：UV754紫外可見分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠)，ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機(jī)廠)，電子天平，高速離心機(jī)，100ml容量瓶（磨口）及配套的冷凝管，橡膠管，溫度計(jì)、水浴鍋、移液管（5ml、10ml、25ml）、洗耳球、容量瓶（100ml）、酒精比重計(jì)。 試劑：乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、蒸餾水。2.乙醇浸提法提取油橄欖多酚2.1 試驗(yàn)方法2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) (1)浸提溫度比較試驗(yàn)精確稱取1.0 g干燥橄欖粉末4份，分別加入70乙醇30 mL，分別在30、50、70、90（20、35、50、65）下浸提2 h，提取2次，離心，收集上清液，定容到10

7、0mL。(2)乙醇濃度比較試驗(yàn)精確稱取1.0 g干燥橄欖粉末4份，分別加入30、50、70、90乙醇30 mL，50下浸提2 h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(3)料液比比較試驗(yàn)精確稱取1.0 g干燥橄欖粉末4份，分別加入50乙醇10、20、30、40 mL，50下浸提2h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(4)浸提時(shí)間比較試驗(yàn)精確稱取1.0 g干燥橄欖粉末4份，加入50乙醇30 mL，50下分別浸提1、2、3、4h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(5)提取次數(shù)比較試驗(yàn)精確稱取1.0 g干燥橄欖粉末4份，加入50乙醇30 mL，50下浸提2 h，

8、分別提取1次、2次、3次、4次，離心，收集上清液，定容到100mL。以上各處理均重復(fù)3次。2.1.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)與分析結(jié)果，選擇有現(xiàn)實(shí)作業(yè)意義的因素水平構(gòu)建正交試驗(yàn)表進(jìn)行主因素優(yōu)化試驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出最佳實(shí)驗(yàn)組合。3.丙酮提取油橄欖多酚3.1 試驗(yàn)方法3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) (1)浸提溫度比較試驗(yàn) 精確稱取1.0g干燥橄欖粉末4份，分別加入70 丙酮30 mL，分別在20、3O、50、70（20、35、50、65）下浸提2 h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(2)丙酮濃度比較試驗(yàn)精確稱取1.0g干燥橄欖粉末4份，分別加入50、60、70、80丙酮30 mL，

9、50下浸提2 h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(3)料液比比較試驗(yàn)精確稱取1.0g干燥橄欖粉末4份，分別加入50丙酮10、20、30、40 mL，50下浸提2h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(4)浸提時(shí)間比較試驗(yàn)精確稱取1.0g干燥橄欖粉末4份，加入50丙酮30 mL，50 下分別浸提1、2、3、4h，提取2次，離心，收集上清液，定容到100mL。(5)提取次數(shù)比較試驗(yàn)精確稱取1.0g 干燥橄欖粉末4份，加入50丙酮30 mL，50下浸提2 h，分別提取1次、2次、3次、4次，離心，收集上清液，定容到100m L。以上各處理均重復(fù)3次。3.1.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

10、根據(jù)單因素試驗(yàn)與分析結(jié)果，選擇有現(xiàn)實(shí)作業(yè)意義的因素水平構(gòu)建正交試驗(yàn)表進(jìn)行主因素優(yōu)化試驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出最佳實(shí)驗(yàn)組合。4.最終提取方案確定 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳提取溶劑和提取工藝，作為超聲波和微波處理法提取油橄欖果渣多酚的輔助提取方法。（二） 超聲波法提取油橄欖多酚1實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑材料：經(jīng)上述預(yù)處理的油橄欖果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：UV754紫外可見分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠)， JY88超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)。 試劑：蒸餾水、乙醇或丙酮（分析純） 2. 單因素試驗(yàn)2.1 超聲波功率對(duì)油橄欖果渣多酚提取效果的影響 稱取1.0g經(jīng)上述果渣預(yù)處理后的油

11、橄欖果渣粉，按上述溶劑提取法中最佳溶劑和提取方法加入最佳溶劑，分別在功率為60、70、80、90W，提取時(shí)間25min的條件下進(jìn)行油橄欖果渣的提取，根據(jù)多酚得率選出最佳的超聲波提取功率。2.2 超聲波時(shí)間對(duì)油橄欖果渣多酚提取效果的影響稱取1.0g經(jīng)上述果渣預(yù)處理后的油橄欖果渣粉，按上述溶劑提取法中最佳溶劑和提取方法加入最佳溶劑，在功率為80W，提取時(shí)間分別為15、25、35、45min的條件下進(jìn)行油橄欖果渣的提取，根據(jù)多酚得率選出最佳的超聲波提取時(shí)間。（三） 微波處理法提取橄欖多酚1實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑材料：經(jīng)上述預(yù)處理的油橄欖果渣，用前在-20冰箱封存。儀器：UV754紫外可見分光光度計(jì)(上

12、海分析儀器總廠)， Galanz中型機(jī)械微波爐(順德格蘭仕電器有限公司)。 試劑：蒸餾水、乙醇或丙酮（分析純） 2. 單因素試驗(yàn)2.1 微波功率對(duì)油橄欖果渣多酚提取效果的影響 稱取1.0g經(jīng)上述果渣預(yù)處理后的油橄欖果渣粉，按上述溶劑提取法中最佳溶劑和提取方法加入最佳溶劑，分別在功率為260、270、280、290W（改為200、400、600、800W），提取時(shí)間5s的條件下進(jìn)行油橄欖果渣的提取，根據(jù)多酚得率選出最佳的微波提取功率。2.2 微波時(shí)間對(duì)油橄欖果渣多酚提取效果的影響（橄欖中黃酮微波提取工藝研究）稱取1.0g經(jīng)上述果渣預(yù)處理后的油橄欖果渣粉，按上述溶劑提取法中最佳溶劑和提取方法加入最

13、佳溶劑，在功率為280W，提取時(shí)間分別為4、5、6、7s（改為1、5、10、15min）的條件下進(jìn)行油橄欖果渣的提取，根據(jù)多酚得率選出最佳的微波提取時(shí)間。（四）油橄欖果渣多酚提取最優(yōu)工藝的確定 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以油橄欖果渣多酚得率為指標(biāo)，確定油橄欖多酚提取的最佳方法以及工藝條件。三、 油橄欖多酚的分離純化（油橄欖葉中多酚和黃酮的含量分析）（一）大孔樹脂法1樹脂的篩選通過測定以下型號(hào)樹脂LX-1、XAD-7、XAD-16、AB-8、HPD-200、LS-100的吸附和解析能力確定樹脂。2樹脂的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)（橡實(shí)殼多酚分離純化、抗氧化劑抑菌的研究（中南林業(yè)科技大學(xué) 鄭菲 碩士論文）2.1 吸附動(dòng)態(tài)試

14、驗(yàn)（1）pH值對(duì)吸附的影響（3、4、5、6、7、8）（2）上樣量對(duì)吸附的影響（1、2、3、4、5BV/h）（3）動(dòng)態(tài)吸附曲線的繪制2.2 解析動(dòng)態(tài)試驗(yàn)（1）乙醇濃度對(duì)洗脫效果的影響（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）（2）洗脫劑的體積對(duì)洗脫效果的影響（1、2、3、4、5BV/h）（3）動(dòng)態(tài)解吸曲線的繪制取干燥好的油橄欖果渣30g，采用最佳提取工藝進(jìn)行提取，將提取液在30下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，回收溶劑，濃縮后樣品加水稀釋至100 mL，用石油醚等體積萃取3次，石油醚層濃縮，回收石油醚，水層上大孔樹脂柱( 20 am×50 cm)進(jìn)行柱層析。柱層析方法如下：取處理好的

15、250 mL D101大孔樹脂，裝入層析柱內(nèi)。樣品溶液慢慢滴人層析柱，漏出液的速度為4 mL/min。用23倍柱體積的水淋洗樹脂至流出液呈無色，以洗去其中的多糖等水溶性雜質(zhì)，再用70 的乙醇溶液600 mL緩緩?fù)ㄟ^樹脂柱，控制其流速，收集洗脫液。30下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，水相冷凍干燥，得油橄欖葉提取物精制產(chǎn)品，于-20下保存?zhèn)溆?，測定多酚的含量。（稱取1/4、1/5精制產(chǎn)品分別定容至25mL） 四、 油橄欖多酚的分析鑒定：紫外吸收光譜、紅外光譜、高效液相色譜1.初步定性分析：香草醛-鹽酸法、明膠試驗(yàn)法（橡實(shí)殼多酚分離純化、抗氧化劑抑菌的研究（中南林業(yè)科技大學(xué) 鄭菲 碩士論文） 2、UV分析：以甲

16、醇溶劑為參比，在190900 nm范圍內(nèi)測定提取物質(zhì)的紫外吸收光譜。3HPLC色譜分析條件：色譜柱Zorbax SBC，8(946 mm × 250 mm，孔徑5 m)，柱溫30 ，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10L，檢測波長280 nm；流動(dòng)相：甲醇水醋酸(體積比10：90：0580：20：05)，洗脫梯度030 min。（橄欖多酚的提取研究）五、 油橄欖多酚含量的測定（一）分光光度法（橄欖總多酚提取工藝優(yōu)化研究）1.各種溶液的配制：(1)沒食子酸母液：精確稱取沒食子酸500 mg，溶于蒸餾水中，定容至100 mL作為母液，分別吸取2.5、5.0、7.5、l0.0、l2.5、15.

17、0 mL于25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，制備成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。（精確稱取沒食子酸125 mg，溶于蒸餾水中，定容至25 mL作為母液，分別吸取1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，制備成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。）(2)pH 7.5磷酸緩沖液1/15 mol/L的磷酸氫二鈉溶液(A液)：稱取磷酸氫二鈉(GB1263)23.877 g，加水溶解并定容至1 L。1/15 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(B液)：稱取經(jīng)110烘干2 h的磷酸二氫鉀(GB1274)9.073 g，加水溶解

18、并定容至1 L。取A液85 mL和B液15 mL混勻，即得pH 75的緩沖液。(3)酒石酸鐵溶液：稱取硫酸亞鐵(GB664)0.1 g，酒石酸鉀鈉(GB1288)0.5 g，加水溶解定容至100 mL，此液可穩(wěn)定l0天。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和對(duì)照品160uL于5 mL離心管中，加入酒石酸鐵溶液800uL，加磷酸緩沖液至4 mL，用水代替沒食子酸作為對(duì)照，用1 cm的比色皿，在540nm處測定吸光度(A)，用吸光度與對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。3.多酚含量測定準(zhǔn)確吸取待測液160uL，加入酒石酸鐵溶液800uL，加磷酸緩沖液至4 mL，用水代替沒食子酸作為對(duì)照，測定

19、樣品的吸光度，代入線性回歸方程，得到樣品多酚含量，計(jì)算提取得率。計(jì)算公式如下：多酚提取得率=C*VW*Vt*1000×100其中：C提取液中多酚含量(mgmL)；V定容體積(mL)； W樣品質(zhì)量(g)；Vt提取液體積(mL)。（二）FolinCiocalteu反應(yīng)比色法1FolinCiocalteu試劑配制：將100g鎢酸鈉(Na2WO4 ·2H2O), 25g鉬酸鈉( Na2MoO4·2H2O) ,700 mL蒸餾水，50 mL 85%磷酸及100 mL濃鹽酸裝入帶回流裝置的2000mL圓底燒瓶中，充分混合，文火緩慢回流10h,在加入150g硫酸鋰(Li2SO4

20、),50 mL蒸餾水及數(shù)滴液溴，然后將燒瓶內(nèi)溶液開口煮15min，以驅(qū)除過量的溴，冷至室溫后用容量瓶定容至1000mL，過濾。濾液呈微綠色。 吸取10 mL 1 moL/ mL的NaOH溶液，放入100 mL錐形瓶內(nèi)，加入2滴酚酞指示劑，用上述濾液滴定。當(dāng)溶液的顏色由綠經(jīng)紫紅到紫灰，到突然轉(zhuǎn)變成墨綠色即為滴定終點(diǎn)。根據(jù)滴定所用的濾液量計(jì)算其酸度(相當(dāng)于2 moL/ L HCL溶液)。將濾液稀釋到H+濃度為1 moL/ L，此液即為FoLin酚試劑。將其置于棕色試劑瓶內(nèi)，保存在冰箱中。用前稀釋2倍。（SngiloetnV.L;Rossi,J.A.Colorimetry of totatl Phe

21、nolics with PhosPhomolybdic一PhosPhotungstic acid reagentsJ.Am.Enol.Vitic.1965，16:144一158）2.測定波長的選擇（FolinCiocalteu試劑比色法測定橄欖中多酚含量的研究） 取油橄欖果渣提取液和沒食子酸溶液各1ml，分別與各比色試劑混合均勻并定容至25ml，室溫避光放置2h,以空白作為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在400900nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最強(qiáng)烈的吸收峰，以選擇測定波長。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取0.0140g的干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，定容于100mL的容量瓶中，配成濃度為140mgL的沒食

22、子酸溶液。然后分別精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定容于10mL容量瓶內(nèi)，配成濃度為084mgL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。再從各標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取1mL加人25mL容量瓶內(nèi)，加10mL蒸餾水，搖勻，再加15mLFolinCiocalteu試劑，充分搖勻30s后，8min前加入6mL 10Na CO 溶液，混勻，加水定容，再混勻，然后在30下避光放置反應(yīng)2h，以0樣為空白，在由前面確定的波長處測定吸光值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4測定方法（均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化橄欖葉多酚提取工藝）取1mL橄欖果渣多酚提取稀釋液于25mL容量瓶內(nèi)，加

23、10mL蒸餾水，搖勻，再加15mLFolinCiocaheu試劑，搖勻，在放置30s后加入6mL 10Na2CO3溶液，450s內(nèi)加完，混勻，加水定容，再混勻，然后在30下避光反應(yīng)2h，在相關(guān)波長處測定吸光值，根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線方程計(jì)算橄欖葉提取液中多酚含量(以沒食子酸計(jì))，經(jīng)進(jìn)一步計(jì)算即得多酚提取得率。提取得率y= CV/N×100式中：y：提取得率()；C：提取原液中多酚的濃度(mg/L)；V：提取多酚液總體積(mL)；M：橄欖果渣質(zhì)量(g)。六、體外抗氧化活性測定（橄欖中多酚類物質(zhì)體外抗氧化活性研究）6.1還原力的測定在25mLpH=66的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的試樣溶液

24、25mL，1 的鐵氰化鉀溶液25mL，混合物在50o【=恒溫20min后，再加入25mL 10 的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10rain，取上清液5mL加蒸餾水5mL和01FeC1 溶液1mL，在700nm處測定吸光度AToo。用蒸餾水作無還原能力對(duì)照(調(diào)儀器零點(diǎn))，抗壞血酸、BHT作為還原能力對(duì)照。每個(gè)試樣作三次平行試樣，取其平均值。6.2 橄欖多酚提取物對(duì)羥基自由基·OH的清除作用參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型，在6支試管中分別加人濃度均為6.0mmol/LFe2+ 、水楊酸一乙醇溶液各1.0mL，分別加入1.0mL濃度分別為0.28mg/mL、0

25、.42mg/mL、0.56mg/mL、0.70mg/mL、0.84mg/mL、0.98mg/mL的樣品溶液，加蒸餾水至5.0mL，再分別加入6.0mmol/LH2O2 1.0mL，10min后以蒸餾水為參比，于510nm處測吸光度值，代入公式計(jì)算清除率。P = (A0-Ai)/A0×100。式中：A0一試劑空白液的吸光度；Ai一加提取液后的吸光度6.3 橄欖多酚提取物對(duì)超氧陰離子自由基(O ·)的清除作用取4.5mLTrisHC1緩沖溶液，于25水浴中放置20min，分別加入lmL不同濃度的試驗(yàn)溶液和0.4mL 25mmolL的鄰苯三酚溶液，混勻后，于25水浴中反應(yīng)5rain，然后加入8mmol/L的HC1溶液lmL終止反應(yīng)，然后在420nm處測定吸光度A1 ，空白以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度A0。每個(gè)試樣作三次平行試樣，取其平均值。按下式計(jì)算清除率：O2-清除率() =(A0-A1)/A0×1006.4 橄欖多酚提取物清除亞硝酸鹽(NO2-；)的實(shí)驗(yàn)取不同濃度的樣品