第十二講DNA文庫的構建

1、 基因組文庫和基因組文庫和cDNAcDNA文庫的構文庫的構建建 第一節(jié) 基因組文庫的構建1 基因組文庫(genomielibrary): 將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。 作用：獲得特定基因。2 基因組文庫的類型 根據(jù)所選用的載體可以分為： 質粒文庫 噬菌體文庫 黏粒文庫 人工染色體文庫 3 構建基因組文庫應滿足的條件3.1 文庫的完整性 要包含基因組的完整序列信息，通過產(chǎn)生一系列一定大小、覆蓋全基因組的DNA片段的重組克隆來實現(xiàn)。 限制性限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定基因組基因組DNA基因組文庫基因組文庫3.2 基因組信息的可

2、重建性 通過建立疊連群(contig)重建完整序列信息。3.3 文庫的大小 即文庫中應包含的獨立重組子數(shù)。 一般來說，DNA片段長，完整基因組文庫所含的克隆數(shù)越少。反之，越多。 基因組越大，文庫應包含的克隆數(shù)越多，反之，越少。 4 基因組文庫的質量標準一個理想的基因組DNA文庫應具備下列條件： 重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力 載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆； 克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序； 克隆片段易于從載體分子上完整卸下； 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。5 基因組DNA文庫構建的程序 (噬菌體基因組文庫的構建) 基因組DNA的分離

3、制備 不同來源的DNA制備方法不同。 一般來說，有液相法和固相法兩種。 液相法提取的DNA長度一般在100kb左右，基本可以滿足構建各種小插入片段基因組文庫的要求。大相對分子質量(high molecular weight,HMW)基因組DNA的提取方法 基因組DNA的片段化 酶切 部分酶切的主要目的是產(chǎn)生隨機性的DNA片段用于構建基因組文庫。 DNA分子的物理剪切 DNA溶液的小孔噴射 超聲波處理 高速攪拌 載體的制備 要求： 載體的去磷酸化處理 載體的純度 重組連接 按照連接酶催化反應的最適條件設置反應體系，同時還應通過預備性實驗確立反應體系具體的參數(shù)。噬菌體離體包裝重組噬菌體感染大腸桿菌

4、 6 基因組文庫的擴增篩選 文庫的擴增 基于噬菌體載體的基因組文庫通過感染大腸桿菌，重組噬菌體在受體細胞中復制增殖并形成噬菌斑以實現(xiàn)增殖。 風險：在進行文庫擴增時，很難保證重組分子均等增殖。所以造成有些克隆丟失，有的增加，有的減少。 文庫的篩選 噬菌斑原位雜交 PCR文庫篩選基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝第二節(jié) cDNA文庫構建 高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時間階段的單個細胞或個體中，有15%左右的基因得以表達，產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子。可見，由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。1

5、概念 cDNA文庫： 將生物特定的組織器官或特定時期的全部mRNA反轉錄成cDNA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達基因的轉錄本。2 cDNA文庫優(yōu)點優(yōu)點 cDNA克隆以mRNA為材料，特別適合某些病毒基因組結構研究及有關基因的克隆分離。 cDNA文庫的篩選比較簡單易行。 每一個cDNA克隆對應一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會比較低，因此陽性的雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因序列?？梢栽谠酥斜磉_。3 對cDNA文庫質量評價 3.1文庫的代表性 文庫中包含的重組cDNA分子反映來源細胞中表達信息的完整性。3.2 重

6、組cDNA片段的序列完整性。4 cDNA文庫構建的步驟 分離mRNA； 富集mRNA； cDNA的合成； 黏性末端片段與載體的連接； 離體包裝獲得重組噬菌體； 檢測重組噬菌體效價。cDNA文庫的構建：基因重組反轉錄酶反轉錄酶mRNAmRNAcDNAcDNA4.1 細胞總RNA的提取和mRNA的分離RNA： tRNA、rRNA、mRNA(1%5%） 真核生物的mRNA具有一個polyA的3末端，可以被用于mRNA的分離； oligo(dT):polyA 雜交鏈在高鹽離子濃度下可以保持，在低鹽離子濃度下或較高溫度下就會分開，利用這一性質從RNA中分離純化mRNA。 4.2 cDNA第一鏈的合成 o

7、ligo(dT)引導的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉錄酶合成cDNA的第一鏈。 隨機引物引導的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) 根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。 在應用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從3-末端的oligo(dT)引物一處開始。4.3 第二鏈cDNA的合成 cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA:c

8、DNA雜合雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。 cDNA第二鏈的合成的方法大致4種：自身引導合成法 置換合成法 引導合成法 引物銜接頭合成法 自身引導合成法 獲得的單鏈cDNA3端會形成發(fā)夾結構的能力，以此作為第二鏈合成的引物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。 置換合成法 以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二鏈。RNase H ：特異水解與：特異水解與DNA 雜交的雜交的RNA上的磷酸上的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生帶有二酯

9、鍵，產(chǎn)生帶有3OH和和5P的產(chǎn)物的產(chǎn)物引導合成法引導合成法 引物-銜接頭法5 全長cDNA文庫 ( full length cDNA library )導致cDNA不完整的原因： cDNA第二鏈合成中聚合酶的外切核酸酶活性 mRNA的降解，它容易從5端降解。起始生物材料、抽提和純化過程中RNase的污染、機械斷裂. 反轉錄酶的合成特性 與mRNA的分子結構有關 與反轉錄酶從轉錄復合體上脫離有關oligo(dG)引導合成全長引導合成全長dscDNA 載體引導合成全長載體引導合成全長dscDNA 置換法合成全長置換法合成全長dscDNA 6 基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較 cDNA文庫只包含某種生物體特定組織、特定發(fā)育階段表達的基因(具有時空特異性具有時空特異性)。 基因組文庫的出發(fā)材料是完整的生物基因組DNA，每一個基因都存在于完全的基因組文庫中，并不受生物組織或發(fā)育時期的影響。 cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結構，沒有包括基因組的間隔序列， cDNA文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)，即：高豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較低，分離基因困難； 從cDNA克