植物組織培養(yǎng)_考試復(fù)習(xí)題

1、植物組織培養(yǎng)緒論P(yáng)1第一章 植物組織培養(yǎng)的基本原理P3第二章 植物組織培養(yǎng)的基本原理P6第三章 植物器官和組織培養(yǎng)P11第四章 胚胎培養(yǎng)及離體授粉P16第五章 花藥和花粉培養(yǎng)P20第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng)P24第八章 原生質(zhì)體培養(yǎng)P27第九章 植物離體繁殖P30第十章 無病毒苗木培育P33植物組織培養(yǎng)基本操作P35緒論植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)是在無菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生成細(xì)胞或完整植株的技術(shù)。由于培養(yǎng)的植物材料已脫離母體，又稱為植物離體培養(yǎng)（Plant culture in vitro)。 廣義：對(duì)植物的器官、組織

2、、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行離體培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng) 狹義：對(duì)植物的組織（分生組織、表皮組織、薄壁組織等）及培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行離體培養(yǎng)。1. 無菌：使培養(yǎng)器皿、器械、培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料等處于無真菌、細(xì)菌、病毒等微生物的狀態(tài)，以保證培養(yǎng)材料在培養(yǎng)器皿中正常生長和發(fā)育。2. 人工控制的環(huán)境條件：對(duì)光照、溫度、濕度、氣體等條件進(jìn)行人工控制，以滿足植物培養(yǎng)材料在離體條件下的正常生長和發(fā)育。3. 外植體：由活體（in vivo)植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、器官等。（植物組織培養(yǎng)中，使用的各種器官、組織和細(xì)胞統(tǒng)稱為外植體。）4. 愈傷組織：外植體因受傷或在離體培養(yǎng)時(shí)，其未分化的細(xì)胞和已分

3、化的細(xì)胞進(jìn)行活躍的分裂增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的組織。（在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。）植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)植物組織培養(yǎng)的主要特點(diǎn)是采用微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段來操作植物離體的器官、組織和細(xì)胞。具體特點(diǎn)表現(xiàn)在： 1）組織培養(yǎng)的整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的，外植體、培養(yǎng)基、接種環(huán)境都須經(jīng)過無菌處理。 2）組織培養(yǎng)在多數(shù)情況下是利用成分完全確定的人工培養(yǎng)基進(jìn)行的，除少數(shù)特殊情況（進(jìn)行營養(yǎng)缺陷型突變細(xì)胞的篩選）外，培養(yǎng)基中包含了植物生長所需的水分和一切大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素，培養(yǎng)基的PH和滲透壓也是人為設(shè)定的。因此，在組織培養(yǎng)中的植物材料不需依靠自身的光合

4、作用制造養(yǎng)分，而是處于完全的異養(yǎng)狀態(tài)。3）組織培養(yǎng)的起始材料可以是植物的器官、組織，也可以是單個(gè)的細(xì)胞（如小孢子）和三倍體細(xì)胞（如胚乳）水平上，即使是去掉了細(xì)胞壁的細(xì)胞（原生質(zhì)體）在組織培養(yǎng)條件下也能再生完整植株。4）組織培養(yǎng)物通過連續(xù)繼代培養(yǎng)可以不斷增殖，形成克?。╟lone,也稱無性繁殖系），或通過改變培養(yǎng)基成分，特別是其中的植物激素的種類和配比，而達(dá)到不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，如莖芽增殖或生根。5）組織培養(yǎng)是在封閉的容器中進(jìn)行的，容器內(nèi)氣體和環(huán)境條件可通過瓶塞或其他封口材料進(jìn)行交換。容器內(nèi)的相對(duì)濕度在通常情況下幾乎是100%。因此，組培苗葉片表面一般都無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，且氣孔保衛(wèi)細(xì)胞功能缺乏，氣孔

5、始終都是張開的。 6）組織培養(yǎng)的環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和時(shí)間等都是人為設(shè)定的，找出這些物理因素的最適參數(shù)對(duì)組培成功也很重要。植物組織培養(yǎng)的類型廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為：1、器官培養(yǎng)（organ culture）：對(duì)植物體各部分器官及器官原基進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法。 常用的植物器官有：根、莖、葉、花、果實(shí)、種子2、組織培養(yǎng)（tissue culture）：對(duì)植物體的各部分組織進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法。常用的組織有：分生組織、形成層組織、薄壁組織、韌皮部組織等。莖尖分生組織培養(yǎng) 愈傷組織培養(yǎng)3、細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)對(duì)植物單個(gè)細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法。 常用的細(xì)胞有：性細(xì)胞、葉

6、肉細(xì)胞、根尖細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞等。4、胚胎培養(yǎng)：對(duì)植物成熟和未成熟胚以及具胚器官進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法。 常用的材料有：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。5、原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplast culture)：植物組織培養(yǎng)的研究任務(wù)植物組織培養(yǎng)的形成與發(fā)展植物組織培養(yǎng)的研究歷史可以追溯到19世紀(jì)中期，其開拓和發(fā)展的理論基礎(chǔ)是植物細(xì)胞的全能性，即植物的每個(gè)核細(xì)胞具有母體全部基因，在離體培養(yǎng)下，都有分化、發(fā)育成完整植株的潛在能力。該領(lǐng)域的發(fā)展歷史可分為開創(chuàng)、奠基和建立三個(gè)階段。植物組織培養(yǎng)的形成于發(fā)展開創(chuàng)1、 1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide 和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織

7、培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。 該學(xué)說的基本內(nèi)容是：一切生物都是由細(xì)胞構(gòu)成的，細(xì)胞是生物體的基本單位，細(xì)胞只能是由細(xì)胞分裂而來。2、1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。 他提出：高等植物的器官和組織，可以不斷分割，直至單個(gè)細(xì)胞，這種單個(gè)細(xì)胞是具有潛在全能性的功能單位，即植物細(xì)胞具有全能性。他在論文中寫道：雖然經(jīng)常觀察到細(xì)胞的明顯生長，但從未觀察到細(xì)胞分裂。這位先驅(qū)者失敗的原因是：實(shí)驗(yàn)材料高度分化；培養(yǎng)基過于簡單。3、1904年，Hanning 最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育成熟，并提早萌發(fā)形成小苗。

8、 1922年，美國學(xué)者Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。4、1922年，德國學(xué)者Kotte和美國學(xué)者Robbins進(jìn)行了豌豆、玉米、棉花的莖尖和根尖離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)只能進(jìn)行有限的生長，未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞有形態(tài)發(fā)生能力。 5、1925年，Laibach培養(yǎng)亞麻種間雜交幼胚獲得成功，證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交中的可能性。植物組織培養(yǎng)的形成與發(fā)展奠基20世紀(jì)30-50年代，影響立體培養(yǎng)材料生長和發(fā)育的一些重要物質(zhì)，如天然提取物、B族維生素、生長素(auxin)、細(xì)胞分裂素(cytokinin)的發(fā)現(xiàn)，促使植物組織培養(yǎng)的研究迅速發(fā)展，特別是分裂素與生長素的比例控制器官分化（ differ

9、entiation)的激素模式的建立，使植物組織培養(yǎng)技術(shù)與理論體系得以形成。Gautheret (1937,1938)在他培養(yǎng)的柳樹形成層的培養(yǎng)基中加入這些物質(zhì)，使生長大大加快，隨后，他用胡蘿卜的小外植體培養(yǎng)也獲得成功。1926年，植物生理學(xué)家Went首先發(fā)現(xiàn)了可以促進(jìn)子葉鞘生長的物質(zhì)，1930年證實(shí)了這種物質(zhì)是生長素吲哚乙酸。1937年，White又發(fā)現(xiàn)了B族維生素和IAA對(duì)植物根離體生長的作用，并用3種B族維生素VB6、VB1及VB5，取代椰汁獲得成功，建立了第一個(gè)由已知化合物組成的培養(yǎng)基。1933年，中國學(xué)者李繼侗和沈同首次報(bào)道了利用天然提取物進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究。他們利用加有銀杏胚乳提取

10、物的培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)了銀杏的胚。1934年，White 用番茄根尖經(jīng)繼代培養(yǎng)400余天(有的書上說，28年培養(yǎng)了1600代)，建立起第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。1941年，Van Overbeek等將椰乳加入到培養(yǎng)基中，使曼佗羅的心形期胚離體培養(yǎng)成熟，并推測椰乳中含有促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長的生理活性物質(zhì)。法國的Nobecoort(1937,1938)培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，細(xì)胞增殖獲得成功。不久，White(1939)報(bào)到了煙草中間雜種(Nicotianaglauca×N.longsdorffi)幼莖切段原形成層組織的培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)也獲得成功

11、。在White和Gautheret工作中所確立的植物組織培養(yǎng)的基本方法，成為以后進(jìn)行各種植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)技術(shù)，奠定了植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)。1943年White發(fā)表了植物組織培養(yǎng)手冊(cè)(A Hand Book of Plant Tissue Culture)的專著，使植物組織培養(yǎng)開始形成一門新興的學(xué)科。四十年代，Skoog和崔徵(1948)在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長素對(duì)芽形成的抑制作用，而誘導(dǎo)形成芽，從而確定了腺嘌呤 /生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。這一比例高時(shí)產(chǎn)生芽，比例低時(shí)產(chǎn)生根，相等時(shí)則不分化。1956年Miller等發(fā)現(xiàn)了激

12、動(dòng)素，知道激動(dòng)素可以代替腺嘌呤促進(jìn)成芽，并且效果約可增加3萬倍。確立了控制器官分化的激素模式為激動(dòng)素/生長素的比例關(guān)系。這種器官發(fā)生的激素調(diào)空模式的建立為植物組織培養(yǎng)中完整植株的再生奠定了理論基礎(chǔ)。1953年，Muir利用往復(fù)式搖床的振蕩，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行了萬壽菊和煙草愈傷組織的培養(yǎng)，獲得了單細(xì)胞或密集細(xì)胞的懸浮液，并可繼代增殖。這既是培養(yǎng)方法上的突破，也是Haberlandt培養(yǎng)單細(xì)胞設(shè)想的實(shí)現(xiàn)。1958年，英國學(xué)者Steward和Reinert幾乎同時(shí)在胡蘿卜根組織的韌皮部單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞在形態(tài)上可轉(zhuǎn)變?yōu)榕c合子胚相似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育過程也與合子胚類似。由于它是從體細(xì)胞分化而來，

13、因而稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。這一實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Haberlandt的細(xì)胞全能性理論。植物組織培養(yǎng)的形成于發(fā)展建立1958年，Wickson和Thimann發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用外源細(xì)胞分裂素可以打破頂端優(yōu)勢，促使休眠的側(cè)芽啟動(dòng)生長，從而形成微型的多枝多芽小灌木叢狀結(jié)構(gòu)。1960年，Morel提出了利用莖尖離體快速無性繁殖蘭花屬的方法，該方法繁殖系數(shù)極高，并能脫毒，國際上相繼形成了“蘭花工業(yè)”，并實(shí)現(xiàn)了試管苗產(chǎn)業(yè)化。1962年，Murashinge 和Skoog 在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。 1960年，英國學(xué)者Cocking用真菌纖維素酶酶解分離番茄根和煙草葉片，獲得了原生質(zhì)體，開創(chuàng)了原生質(zhì)

14、體的培養(yǎng)。1971年，日本學(xué)者Nagata和Takebe首次將煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura獲得了第一例禾谷類作物水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1986年，Spangenberg獲得了甘藍(lán)型油菜單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1972年，Carlson 通過兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株。1974年，Kao利用聚乙二醇進(jìn)行了大豆和煙草科間原生質(zhì)體的融合。1953年，Tulecke首先培養(yǎng)銀杏成熟花粉獲得了愈傷組織。1964-1966年，印度科學(xué)家Guha 和Maheswari 在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。1969年，

15、Kaul發(fā)現(xiàn)三角葉薯蕷懸浮培養(yǎng)物可以生產(chǎn)薯蕷皂苷配基，其量為干重的1.5%。 目前，利用組織培養(yǎng)途徑生產(chǎn)的次生產(chǎn)物有皂苷類、生物堿、甾醇類、醌類、氨基酸和蛋白質(zhì)等。植物組織培養(yǎng)的形成與發(fā)展應(yīng)用及展望1、植物離體快繁 運(yùn)用組織培養(yǎng)的途徑，一個(gè)單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個(gè)植株。例如一株葡萄一年繁殖到3萬多株，一株蘭花一年繁殖到400萬株。2、無病毒苗木培育 針對(duì)病毒對(duì)農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3、次生代謝物的產(chǎn)生 有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物-紫杉醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞來直接生產(chǎn)。 4、培育

16、新品種或創(chuàng)制新品種 1）培育遠(yuǎn)緣品種：利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。比如遼寧果樹研究所利用這種方法獲得蘋果與梨的雜交種。 2）離體選擇突變體：采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。中國林科院用逐步加大培養(yǎng)基中鹽的濃度，直接獲得耐鹽的楊樹株系。 3）單倍體育種5、植物種質(zhì)資源的離體保存6、人工種子 意義： 1）結(jié)構(gòu)完整、體積小、便于貯藏與運(yùn)輸，可直接播種和機(jī)械化操作。2）不受季節(jié)和環(huán)境限制，利于工廠化生產(chǎn)。3）利于繁殖周期長、自交不親和、珍貴稀有的植物，也可大量繁殖無病毒材料4）可在人工種子中加入抗生素、菌肥、農(nóng)

17、藥等成分，提高種子品質(zhì) 5）體細(xì)胞胚由無性繁殖體系產(chǎn)生，可固定雜種優(yōu)勢。7、 基因工程的應(yīng)用 （1）培育的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因大豆新品種，蛋白質(zhì)含量比標(biāo)準(zhǔn)品種提高45%48%，產(chǎn)量提高10%20%。（2）將魚的抗凍基因?qū)敕?，獲得了耐寒、高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因番茄。轉(zhuǎn)基因抗鹽馬鈴薯也獲得成功.第一章 植物組織培養(yǎng)的基本原理第一節(jié)：植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室一、實(shí)驗(yàn)室要求 環(huán)境要求：理想的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該建立在安靜、清潔、遠(yuǎn)離污染源的地方，最好在常年主風(fēng)向的上風(fēng)方向，盡量減少污染。規(guī)?；a(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室最好建在交通方便的地方，便于產(chǎn)品的運(yùn)送。 需考慮兩個(gè)方面：一、所從事實(shí)驗(yàn)的性質(zhì) 二、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的基本

18、原則：科學(xué)、高效、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用。二、實(shí)驗(yàn)室組成（一）基本實(shí)驗(yàn)室 基本實(shí)驗(yàn)室包括準(zhǔn)備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、緩沖間，是植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所必須具備的基本條件。如進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，年產(chǎn)4萬-20萬，需3-4間實(shí)驗(yàn)用房，總面積60平方米。 實(shí)驗(yàn)室必須滿足3個(gè)基本需要：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（培養(yǎng)基制備、器皿洗滌、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿滅菌）、無菌操作和控制培養(yǎng)。1、準(zhǔn)備室 功能：進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作：器皿洗滌、培養(yǎng)基配制與分裝、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌、培養(yǎng)材料的預(yù)處理等。 要求：20平方米左右。要求寬敞明亮、以便于放置多個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)和相關(guān)設(shè)備，方便多人同時(shí)工作；同時(shí)要求通風(fēng)條件好，便于氣體交換；實(shí)驗(yàn)室地面應(yīng)便于清潔，并應(yīng)

19、進(jìn)行防滑處理。 設(shè)備：準(zhǔn)備室應(yīng)具備工作臺(tái)、柜櫥、水池、儀器、藥品等。 分類：分體式-研究性質(zhì)實(shí)驗(yàn)室，可將準(zhǔn)備室分解為藥品貯藏室、培養(yǎng)基配制與洗滌室和滅菌室等，功能明確，便于管理，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。通間式-規(guī)模化實(shí)驗(yàn)室，設(shè)計(jì)成大的通間，試驗(yàn)操作的各個(gè)環(huán)節(jié)在同一房間內(nèi)按程序完成。便于程序化操作與管理，減少各環(huán)節(jié)間的銜接時(shí)間，提高工作效率。還便于培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌的自動(dòng)化操作程序設(shè)計(jì)，減少規(guī)?；a(chǎn)的人工勞動(dòng)，更便于無菌條件的控制和標(biāo)準(zhǔn)化操作體系的建立。2、無菌操作室 功能：也叫接種室，進(jìn)行材料的離體無菌操作，是植物離體培養(yǎng)研究或生產(chǎn)中最關(guān)鍵的一步。 要求：房間一般不宜過大，10-20平方米即可

20、。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時(shí)間保持無菌，因此不宜設(shè)在容易受潮的地方；為便于消毒處理，地面及內(nèi)墻壁都應(yīng)采用防水和耐腐蝕材料；地面要求平坦無縫，便于清潔；為了保持清潔，無菌室應(yīng)防止空氣對(duì)流。 一般新建實(shí)驗(yàn)室的無菌室在使用之前應(yīng)進(jìn)行滅菌處理，處理方法是甲醛和高錳酸鉀熏蒸，并需定期滅菌處理，還可用紫外線照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。 設(shè)備：無菌操作室安裝有紫外燈和空調(diào)，工作臺(tái)和擱架，還有超凈工作臺(tái)和整套滅菌接種儀器、藥品等。3、培養(yǎng)室 功能：對(duì)接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體材料進(jìn)行控制條件下的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。 要求：10-20平方米左右。要求能夠控制光照和溫度

21、，并保持相對(duì)的無菌環(huán)境。因此，培養(yǎng)室應(yīng)保持清潔和適度干燥；為滿足植物培養(yǎng)材料生長對(duì)氣體的需要，還應(yīng)安裝排風(fēng)窗和換氣扇等換氣裝置；為節(jié)省能源和空間，應(yīng)配置適宜的培養(yǎng)架，并應(yīng)安裝日光燈照明。 研究用實(shí)驗(yàn)室，通?？筛鶕?jù)光照時(shí)間設(shè)置成長日照、中日照、短日照培養(yǎng)室，也可以根據(jù)溫度設(shè)置成高溫和低溫培養(yǎng)室，每一個(gè)培養(yǎng)室的空間不宜過大，便于對(duì)條件的均勻控制。進(jìn)行精細(xì)培養(yǎng)類型如細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)，可采用光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱代替培養(yǎng)室。 設(shè)備：培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱、邊臺(tái)用于拍攝培養(yǎng)物生長狀況，除濕機(jī)、顯微鏡、溫濕度計(jì)、空調(diào)等。 4、緩沖間 功能：進(jìn)入無菌室前的緩沖場地，減少人體從外界帶入的塵埃等污

22、染物。人員在此換上工作服、拖鞋、口罩，才能進(jìn)入無菌室和培養(yǎng)室。 要求：3-5平方米，在準(zhǔn)備室外或無菌操作室外，應(yīng)保持清潔無菌；備有鞋架和衣帽掛鉤。 設(shè)備：1-2盞紫外燈對(duì)衣物進(jìn)行滅菌、滅菌工作服、拖鞋、口罩。（二）輔助實(shí)驗(yàn)室 根據(jù)研究或生產(chǎn)的需要而配套設(shè)置的專門實(shí)驗(yàn)室，主要用于細(xì)胞學(xué)觀察和生理生化分析等。1、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 功能：對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究， 分為制片室和顯微觀察室。 制片是獲取顯微觀察數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，制片室配備有切片機(jī)、磨刀機(jī)、溫箱及樣品處理和切片染色設(shè)備，通風(fēng)櫥和廢液處理設(shè)施。 顯微觀察室主要有顯微鏡和圖像拍攝、處理設(shè)備。 要求：明亮、清潔、干燥、防止潮濕和灰塵污染。 2、生

23、化分析實(shí)驗(yàn)室 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，隨時(shí)對(duì)培養(yǎng)物成分進(jìn)行取樣檢查。大型次生代謝物生產(chǎn)，還需有效分離實(shí)驗(yàn)室。 第二節(jié) 儀器設(shè)備和器皿用具 一、基本設(shè)備配置（一）常規(guī)設(shè)備1、天平 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室需要不同精度的天平。 感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（電子天平）用于稱量微量元素和一些較高精確度的實(shí)驗(yàn)用品。 感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量較大的藥品的稱量。 2、冰箱 各種維生素和激素類藥品以及培養(yǎng)基母液均需低溫報(bào)存，某些試驗(yàn)還需植物材料進(jìn)行低溫處理，普通冰箱即可。3、酸度計(jì) 用于測定培養(yǎng)基及其它溶液的p

24、H，一般要求可測定pH范圍1-14之間，精度0.01即可。4、離心機(jī) 用于細(xì)胞、原生質(zhì)體等活細(xì)胞分離，亦用于培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞器、核酸以及蛋白質(zhì)的分離提取。根據(jù)分離物質(zhì)不同配置不同類型的離心機(jī)。 細(xì)胞、原生質(zhì)體等活細(xì)胞的分離用低速離心機(jī)；核酸、蛋白質(zhì)分離用高速冷凍離心機(jī)；規(guī)模化生產(chǎn)次生產(chǎn)物，還需選擇大型離心分離系統(tǒng)。5、加熱器 用于培養(yǎng)基的配制。研究性實(shí)驗(yàn)室一般選用帶磁力攪拌功能的加熱器，規(guī)模化大型實(shí)驗(yàn)室用大功率加熱和電動(dòng)攪拌系統(tǒng)。6、其它 純水器、分裝設(shè)備 （二）滅菌設(shè)備 維持相對(duì)的無菌環(huán)境是植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本要求。1、高壓滅菌鍋 用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌，根據(jù)規(guī)模

25、大小有手提式、立式、臥式等不同規(guī)格。2、干熱消毒柜 用于金屬工具如鑷子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的滅菌。一般選用200左右的普通或遠(yuǎn)紅外消毒柜。3、過濾滅菌器 用于一些酶制劑、激素以及某些維生素等不能高壓滅菌試劑的滅菌，主要有真空抽濾式和注射器式。4、紫外燈 方便經(jīng)濟(jì)的控制無菌環(huán)境的裝置，緩沖間、接種室和培養(yǎng)室必備。 （三）無菌操作設(shè)備1、接種箱 使用較早的最簡單的無菌裝置，主體為玻璃箱罩、入口有袖罩，內(nèi)裝紫外燈和日光燈，使用時(shí)對(duì)無菌室要求較高。2、凈化工作臺(tái) 其操作臺(tái)面是半開放區(qū)，具方便、操作舒適優(yōu)點(diǎn)，通過過濾的空氣連續(xù)不斷吹出，大于0.03um直徑的微生物很難在工作臺(tái)的操作空間停留，保持

26、了較好的無菌環(huán)境。由于過濾器吸附微生物，使用一段時(shí)間后過濾網(wǎng)易堵塞，因此應(yīng)定期更換。（四）培養(yǎng)設(shè)備 指根據(jù)需要所選用的不同規(guī)格和控制精度的用于植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)的設(shè)施和設(shè)備。1、培養(yǎng)架 目前植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室植株繁殖培養(yǎng)的通用設(shè)施。成本低、設(shè)計(jì)靈活、充分利用培養(yǎng)空間。一般有4-5層，層間間隔40-50cm，光照強(qiáng)度可根據(jù)培養(yǎng)植物特性來確定，一般每架上配備2-4盞日光燈。 2、培養(yǎng)箱 細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等要求精確培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，可用光照培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、濕度控制培養(yǎng)箱等培養(yǎng)。3、搖床：進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)，為改善通氣狀況，可用振蕩培養(yǎng)箱或搖床。4、生物反應(yīng)器：進(jìn)行植物細(xì)胞生產(chǎn)次生產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室

27、，還需生物反應(yīng)器。 （五）其他設(shè)備 時(shí)間程序控制器、溫度控制系統(tǒng)或空調(diào)、實(shí)體顯微鏡、倒置式生物顯微鏡及配套的攝影、錄像和圖像處理設(shè)備、電泳儀、萃取和層析設(shè)備、紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀、氣相色譜儀、酶聯(lián)免疫測定系統(tǒng)。二、培養(yǎng)容器與用具（一）培養(yǎng)容器：包括各種規(guī)格的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶。一般分為： 玻璃容器一般用無色并不產(chǎn)生顏色折射的硼硅酸鹽玻璃材質(zhì)。塑料容器材質(zhì)輕、不易破碎、制作方便，廣泛使用。一般為聚丙烯、聚碳酸酯材料的培養(yǎng)容器（二）金屬用具1、鑷子：植物組織解剖用小的尖頭鑷子，分株轉(zhuǎn)移繁殖轉(zhuǎn)接用槍型鑷子，16-22cm長。2、剪刀：不銹鋼醫(yī)用彎頭剪，做取材和切段轉(zhuǎn)移繁殖，14-

28、22cm長。 3、解剖刀：進(jìn)行組織切段，多用短柄可換刀片的醫(yī)用不銹鋼解剖刀。4、其他用具：接種鏟、接種針在花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)中有用。 三）塑料用具：各種封口膜、蓋、塑料盤及其它實(shí)驗(yàn)用具。 第三節(jié)：基本操作一、洗滌（一）重鉻酸鉀洗滌法飽和重鉻酸鉀洗液的配制方法是：將43g重鉻酸鉀溶與1000ml蒸餾水（20可以達(dá)到飽和狀態(tài)），制成重鉻酸鉀飽和水溶液。然后緩慢加入濃硫酸，最后使重鉻酸鉀飽和水溶液以濃硫酸比例達(dá)到1：1。在配制過程中，只能把濃硫酸緩慢加入進(jìn)去，決不可把重鉻酸鉀水溶液加入濃硫酸中，因會(huì)產(chǎn)生大量熱量而來不及擴(kuò)散，從而引起濃硫酸濺出。洗滌方法：一般用具：用水洗凈玻璃器皿，晾干后放入重鉻酸鉀

29、洗滌液中，浸泡1夜，第二天取出，用自來水沖洗，然后用蒸餾水洗兩次。干燥后備用。小的玻璃制品法：吸管：先用自來水沖洗，放在特制的防腐不銹鋼網(wǎng)筒內(nèi)，用重鉻酸鉀浸泡一夜，再將網(wǎng)筒放入虹吸式自動(dòng)沖洗裝置中，用自來水沖洗數(shù)十次，最后用蒸餾水沖洗，干燥后備用。（二）洗滌劑洗凈法重鉻酸鉀洗液的最大缺點(diǎn)是鉻離子會(huì)造成環(huán)境污染，因此，應(yīng)盡量避免使用。普通無磷中性洗滌劑，是理想的選擇。（三）超聲波洗凈法這是一種物理的洗凈法，對(duì)環(huán)境無任何污染，而且對(duì)比較頑固的污垢也十分有效，但超聲波發(fā)生器容量有限，因此，常用來清洗較小的玻璃儀器和器械。方法：將玻璃制品放入超聲波洗凈器中，注入自來水，設(shè)定時(shí)間，然后進(jìn)行處理，拿出用自

30、來水沖凈，蒸餾水沖洗。（四）玻璃器皿的清洗新購置的玻璃器皿：帶有游離的堿性物質(zhì)，先用1%的稀鹽酸浸泡1夜，再用肥皂水洗凈，清水沖洗，蒸餾水沖淋，烘干。已用過的培養(yǎng)器皿：去掉培養(yǎng)基，洗滌劑溶液浸泡，刷子刷洗，自來水沖洗，蒸餾水沖洗。較臟的玻璃器皿：洗衣粉或洗潔精刷洗，沖凈，浸入洗滌液中，按 上面方法洗滌，浸泡時(shí)間根據(jù)臟的程度定。被污染的玻璃器皿：121高壓蒸汽滅菌后，用洗滌劑刷掉污染物，沖洗，重鉻酸鉀洗滌液浸泡，2h后取出，自來水沖洗，蒸餾水沖淋。用過的吸管或滴管：在洗滌液中浸泡2h以上，取出沖洗干凈。洗凈后的玻璃器皿應(yīng)透明發(fā)亮，內(nèi)外壁水膜均勻，不掛水珠。第二章 植物組織培養(yǎng)的基本原理植物細(xì)胞全

31、能性理論是植物組織培養(yǎng)的核心理論。離體細(xì)胞具有生命的特征屬性，在全能性的基礎(chǔ)上，提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，離體細(xì)胞經(jīng)歷脫分化和再分化過程第一節(jié)：植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化植物細(xì)胞的全能性（totipotent)：植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。原理：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。差異：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性 科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植

32、物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。 分化：植物體各個(gè)部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，可以在細(xì)胞水平、組織水平或器官水平上表現(xiàn)出來。細(xì)胞分化：導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。第二節(jié)：離體條件下植物器官的發(fā)生脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。再分化（redifferentiation):離體培養(yǎng)的植

33、物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株，這個(gè)過程稱為再分化。一、脫分化和再分化類型：（1）細(xì)胞水平的再分化 （2）組織水平的再分化（3）器官水平的再分化：器官型和器官發(fā)生型（4）植株再生：先芽后根、先根后芽、芽根同時(shí)二、影響細(xì)胞脫分化和再分化的因素（一）影響細(xì)胞脫分化的因素 1、損傷2、生長調(diào)節(jié)劑3、光照 4、細(xì)胞位置5、外植體的生理狀態(tài)6、植物種類差異（二）影響細(xì)胞再分化的因素 因素：（同上） 原因：1、不同植物種類再分化能力差異很大2、對(duì)某些植物的植物再生條件還沒有完全掌握三 愈傷組織培養(yǎng)（一）愈傷組織形成、生長和保持1、愈傷組織

34、的形成 在脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的結(jié)構(gòu)往往是異質(zhì)的，無明顯極性，其形成過程可分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。1）誘導(dǎo)期（啟動(dòng)期）：是愈傷組織形成的起點(diǎn)。 是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。2）分裂期：外植體的外層細(xì)胞出現(xiàn)了分裂，中間細(xì)胞常不分裂，故形成一個(gè)小芯。由于外層細(xì)胞迅速分裂使得這些細(xì)胞的體積縮小并逐漸恢復(fù)到分生組織狀態(tài)，細(xì)胞進(jìn)行脫分化。 特征：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。3）分化期：停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化而形成由不同形態(tài)和功能的細(xì)胞組成的愈傷組織，在細(xì)胞分裂末期，細(xì)胞內(nèi)開始發(fā)生一系列形態(tài)和生理變化，導(dǎo)致細(xì)胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)

35、形態(tài)和功能各異的細(xì)胞。2、愈傷組織的生長誘導(dǎo)期后，外植體外層細(xì)胞開始出現(xiàn)分裂，在組織受傷表面形成一種創(chuàng)傷形成層，愈傷組織的細(xì)胞數(shù)目迅速增多。愈傷組織在生長過程中的生理生化變化：1）在誘導(dǎo)期和分裂始期，每個(gè)分裂細(xì)胞中的RNA含量迅速增加，并達(dá)到一個(gè)高峰，但在繼續(xù)分裂的過程中，RNA的含量減少。2）同工酶譜發(fā)生變化。3）連續(xù)繼代培養(yǎng)可能改變次生物質(zhì)的積累水平或能力。4）延長培養(yǎng)期可能使愈傷組織對(duì)生長素的需求發(fā)生變化，導(dǎo)致生長素的自給和自養(yǎng)，出現(xiàn)馴化現(xiàn)象.愈傷組織的質(zhì)地明顯不同，有松脆和致密兩種類型，但它們之間是可以相互轉(zhuǎn)變的。 一般加入較高濃度生長素，可使致密的愈傷組織變的松脆；而降低或去除生長素

36、或加入高濃度的細(xì)胞分裂素，往往使愈傷組織變的致密。3、愈傷組織的保持大多數(shù)情況下，隨繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織表現(xiàn)出生長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力逐漸降低甚至死亡或形態(tài)發(fā)生能力完全喪失。這種情況的發(fā)生主要是遺傳和生理因素所致。前者包括染色體畸變、基因突變等；后者是細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變或細(xì)胞對(duì)外源生長物質(zhì)的敏感性的改變。因生理因素導(dǎo)致的形態(tài)發(fā)生能力下降可通過改變培養(yǎng)條件而得以改善。由愈傷組織再分化的形態(tài)發(fā)生方式也有體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生兩種，后者具體包括:先芽后根；先根后芽；在愈傷組織不同部位形成芽和根，然后芽、根的維管束接通形成完整植株；僅形成芽或根。第三節(jié) 植

37、物體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生：植物離體培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體的過程。 一、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程（一）體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程 不同種類的植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的主要發(fā)育階段的劃分是不一致的，但一般可分為胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎早期分化發(fā)育、體細(xì)胞胚胎成熟、體細(xì)胞胚胎萌發(fā)和成苗五個(gè)階段。 在雙子葉植物上，體細(xì)胞胚胎發(fā)生經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚和成熟胚階段。 在禾本科植物的成熟體細(xì)胞胚上，可以清楚看到胚特有的結(jié)構(gòu)，即盾片、胚芽鞘和胚根等。（二）胚性和非胚性細(xì)胞或愈傷組織生理狀態(tài)的差異 胚性細(xì)胞與分生組織類似，通常較小，近圓形，具有較大的核和核仁并能高度染色，胞質(zhì)濃厚。 典型的胚

38、性愈傷組織外表呈松脆顆粒狀。與非胚性細(xì)胞或愈傷組織組織相比，DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更為活躍，表現(xiàn)為含量和種類的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、內(nèi)源多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶譜和內(nèi)源激素合成有明顯變化等。（三）體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因表達(dá)機(jī)理（略）二、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑（一）體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式 由外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的途徑有兩種：直接途徑和間接途徑。 直接途徑：從外植體某些部位的胚性細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚胎。這種“胚性細(xì)胞”是在胚胎發(fā)生之前就已決定了的。間接途徑：外植體先脫分化形成愈傷組織，在從愈傷組織的某些細(xì)胞，即重新決定為胚性細(xì)胞的細(xì)胞分化出體細(xì)胞胚胎，多數(shù)體細(xì)胞胚

39、胎的形成是通過間接途徑產(chǎn)生的。分兩個(gè)階段完成：1）胚胎發(fā)生叢（EC）的形成:愈傷組織中常含有兩種類型的細(xì)胞，一種具有大液泡的細(xì)胞，通常失去胚胎發(fā)生潛能，在培養(yǎng)基中易散開；另一種液泡小、細(xì)胞質(zhì)濃的小細(xì)胞，這種小細(xì)胞聚集為叢狀。被稱為EC。EC表面是高度分生組織化的細(xì)胞，一個(gè)EC表面可產(chǎn)生大量的胚狀體。2）胚狀體的發(fā)育：EC通常在原培養(yǎng)基上不能使其表面的胚狀體發(fā)育，但EC可以增殖、崩潰而不衰。EC崩潰是由于EC 中心的細(xì)胞增加，并膨脹使EC崩潰，崩潰后分生性的表面細(xì)胞結(jié)合成群，又形成新的EC。EC在轉(zhuǎn)入降低或去除生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基后，才能完成胚狀體發(fā)育。（二）體細(xì)胞胚胎的起源（略）三、植物

40、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的極性和生理隔離體細(xì)胞胚胎具有兩個(gè)明顯特點(diǎn)：1、雙極性2、與母體組織或外植體的維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，處于較為孤立的狀態(tài)，即存在生理隔離。（一）體細(xì)胞胚胎發(fā)生的極性 單個(gè)胚性細(xì)胞與合子胚一樣，具有明顯的極性，第一次分裂多為不均等分裂，頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。（二）體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生理隔離 被子植物的胚囊減數(shù)分裂后，形成的大孢子與周圍細(xì)胞處于分開的狀態(tài)。在小孢子發(fā)生時(shí)，小孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂前期也與絨氈層的細(xì)胞間沒有聯(lián)系。 在多數(shù)植物中都觀察到，早期的胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞還存在胞間連絲，但隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育，細(xì)胞壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞。胚性細(xì)

41、胞開始分裂，從二細(xì)胞原胚到多細(xì)胞原胚始終被厚壁包圍，與周圍細(xì)胞形成明顯的界限。第四節(jié)、影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素植物離體培養(yǎng)中，外植體的基因型和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等是影響離體形態(tài)發(fā)生的主要因素。一、 植物種類和基因型 不同物種和同一物種不同基因型，其形態(tài)發(fā)生能力往往有巨大差異。二、培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)1、植物的發(fā)育年齡2、培養(yǎng)器官或組織類型： 1）種子、幼胚和下胚軸易形成胚狀體，莖段、葉片比較困難；雙子葉植物形態(tài)發(fā)生常用的外植體依次為葉、莖、胚軸、子葉等；單子葉植物特別是禾本科植物，細(xì)胞分裂旺盛的分生組織或器官，如葉基部、莖尖、幼胚、胚珠、幼花序軸等是極好的外植體。 2）同一器官不同部位

42、的組織，其再生器官能力也不同。3）外 植體的大小對(duì)器官再生有影響。4）不同季節(jié)來源的外植體，其形態(tài)發(fā)生的能力也有差異。 5）供體植物的生長環(huán)境也影響外植體的生理狀態(tài)。3、培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性： 愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間過長或繼代培養(yǎng)次數(shù)太多，往往會(huì)推遲或降低形態(tài)發(fā)生的能力，所以一般均取處于旺盛生長期的愈傷組織材料來誘導(dǎo)器官的形成。但是對(duì)于某些植物的胚狀體發(fā)生，往往需要愈傷組織培養(yǎng)較長時(shí)間或多次繼代培養(yǎng)。 細(xì)胞倍性也影響形態(tài)發(fā)生能力。高滲透壓條件下，容易啟動(dòng)花粉粒單倍性細(xì)胞生長和分化，容易得到花粉胚狀體，而花藥壁來源的二倍體細(xì)胞的生長和分化都受到明顯抑制。三、培養(yǎng)基1、植物營養(yǎng)1）一般認(rèn)為，培養(yǎng)基中的銨態(tài)

43、氮和K+有利于胚狀體形成，提高無機(jī)磷的含量可促進(jìn)器官發(fā)生，不加還原氮有利于根的形成等。 用于莖尖培養(yǎng)和芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基主要是MS及其修改的配方和B5培養(yǎng)基。2）碳水化合物種類及濃度對(duì)體胚發(fā)育有重要作用，缺糖或低糖常無法形成胚狀體。3）其他物質(zhì)如氨基酸、天然復(fù)合物常不同程度地促進(jìn)器官和胚狀體發(fā)生。2、物理性質(zhì)：固態(tài)或液態(tài)、滲透壓以及PH等，對(duì)器官或胚狀體的形成及發(fā)育也有明顯影響。3、植物生長調(diào)節(jié)劑 植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物離體形態(tài)發(fā)生的最關(guān)鍵因素。1）生長素：植物離體形態(tài)發(fā)生過程中，生長素促進(jìn)外植體生長、生根，并與細(xì)胞分裂素共同作用誘導(dǎo)不定芽分化及側(cè)芽的萌發(fā)與生長。 由于植物外植體中原來有的內(nèi)源激

44、素種類和濃度不同，需添加的激素種類及濃度也就不同。有些外植體誘導(dǎo)芽或無根苗形成時(shí)，需補(bǔ)加一定量的生長素，或與分裂素一起補(bǔ)加才顯出作用。3、植物生長調(diào)節(jié)劑2）細(xì)胞分裂素：促進(jìn)分化和芽形成，抑制根發(fā)育與衰老。分裂素可促進(jìn)也可抑制體胚發(fā)生，這主要取決于植物的種類及基因型。3）赤霉素：促進(jìn)莖的伸長，打破休眠，對(duì)芽的誘導(dǎo)和形成有促進(jìn)作用。4）乙烯：對(duì)芽的誘導(dǎo)和形成有促進(jìn)或抑制作用，這與植物種類及處理時(shí)間有關(guān)。5）脫落酸：增強(qiáng)胚性愈傷組織的形成和體胚發(fā)生，防止畸形胚形成，抑制體胚過早萌發(fā)，促進(jìn)胚中貯藏成分。四、培養(yǎng)條件1、光1）光照強(qiáng)度：不同植物及不同材料對(duì)光照強(qiáng)度要求不同。一般情況下，植物所需的光照強(qiáng)度

45、為1000-5000lx。光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)物的增殖、器官分化、胚狀體形成都有重大影響。2）光照長度：一般情況下，植物每日所需的光照時(shí)間為10-16小時(shí)。3）光質(zhì)：不同波長的光對(duì)細(xì)胞分裂和器官分化有影響。對(duì)苗再生最有利的光譜是藍(lán)光區(qū)，根的發(fā)生則是紅光區(qū)較有利。2、溫度 不同植物要求的最適溫度不同。一般園藝植物的生長適溫為：文竹17，百合20，杜鵑25，石刁柏26，月季25-27，葡萄28，番茄28。植物愈傷組織的培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)是指將母體植株上的各個(gè)部分切下，形成外植體，接種到無菌的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和發(fā)育的一門技術(shù)。一般情況下，植物組織均能誘發(fā)形成愈傷組織，由外植體形成愈傷組織，標(biāo)

46、志著植物離體培養(yǎng)的開始。 一 愈傷組織的誘導(dǎo)（一）誘導(dǎo)原理1、細(xì)胞全能性 植物每一細(xì)胞具有全套遺傳信息，在特定環(huán)境下能進(jìn)行表達(dá)，而產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)立完整的個(gè)體。只要有一個(gè)完整的膜系統(tǒng)和一個(gè)有生命力的核，即使已經(jīng)是高度分化的植物細(xì)胞，也還保持恢復(fù)到分生狀態(tài)的能力。其恢復(fù)能力取決于該細(xì)胞原來所處的部位和生理狀態(tài)。2、脫分化現(xiàn)象 一個(gè)已經(jīng)停止分裂的成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象。 植物離體培養(yǎng)中的脫分化過程:植物離體培養(yǎng)利用特定的條件，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，使原已分化并具有一定功能的細(xì)胞脫離原軌道，失去其原有狀態(tài)和功能，而恢復(fù)到未分化的愈傷組織狀態(tài)。 3、誘導(dǎo)程度雙子葉植物比單子葉植物容易

47、 幼年細(xì)胞組織比成年細(xì)胞組織容易 二倍體細(xì)胞比單倍體細(xì)胞容易 （二）誘導(dǎo)方法1、根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，獲取不同的外植體。 植株莖的切段、葉、根、花和種子，或某些組織切成片或塊狀，均可接種到培養(yǎng)基上。 接種時(shí)需考慮材料的一致性，來源、產(chǎn)地、大小、形狀、生理部位。常選組織塊較大的材料。 2、操作程序獲取外植體材料消毒處理修整除去壞死組織切成5mm的圓柱形或方形小塊直放或倒放到培養(yǎng)基上每9cm培養(yǎng)基接種56塊外植體培養(yǎng)。采用圓形的原因： 能得到外形簡單結(jié)構(gòu)相同的材料 圓形的表面積大 圓柱形的外植體有利于組織塊與外界進(jìn)行物質(zhì)和氣體交換；也使外植體表面促進(jìn)愈傷組織形成的分泌物較多，誘導(dǎo)率增高。培養(yǎng)基 MS

48、培養(yǎng)基；激素 IAA、NAA、2,4-D、BA；椰子汁、番茄汁、酵母提取物。 二、愈傷組織細(xì)胞的分化（一）誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期是細(xì)胞正在準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。1、誘導(dǎo)期特征 細(xì)胞質(zhì)增加，出現(xiàn)活躍的原生質(zhì)流動(dòng)，貯藏物質(zhì)淀粉等消失；隨著組織的活化，細(xì)胞內(nèi)核糖體增加并形成大量多聚核糖體；RNA迅速合成和累積；但細(xì)胞大小無多大變化。 2、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素 （1）植物種類、生理狀況、外部因素不同，誘導(dǎo)期不同。（2）弱光下植株比強(qiáng)光下的植株外植體易于誘導(dǎo)分裂（3）二氧化碳抑制誘導(dǎo)分化（4）生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂（5）損傷剌激能加速脫分化進(jìn)行，有時(shí)還是某些材料能否脫分化的決定條件。（6）離體培養(yǎng)后細(xì)胞變化：（7

49、）氣體交換迅速增加；RNA出現(xiàn)；（8）蛋白質(zhì)發(fā)生周期性變化；（9）酶水平變化。（二）分裂期分裂期是指細(xì)胞脫分化，細(xì)胞通過分裂不斷增生子細(xì)胞而形成愈傷組織的過程。植物分裂期脫分化規(guī)律： 胡蘿卜等脫分化較禾谷類容易 莖葉較花器脫分化 幼嫩莖組織比老組織較容易2、分裂期愈傷組織特征： 細(xì)胞數(shù)目增加、體積變小、核和核仁變大、RNA含量持續(xù)上升。從培養(yǎng)外植體的形態(tài)變化來看，表現(xiàn)為外層細(xì)胞迅速分裂。當(dāng)細(xì)胞體積最小，細(xì)胞核和核仁最大，RNA含量最高時(shí)，標(biāo)志著細(xì)胞處于分裂高峰時(shí)期。分化期主要變化為 1、細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變2、分生組織瘤狀結(jié)構(gòu)和維管組織形成3、細(xì)胞體積不再減小4、出現(xiàn)各種類型細(xì)胞5、顏色

50、變化三、愈傷組織的繼代培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件1、培養(yǎng)基 1）常用于愈傷組織繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基有MS、N6。 2）細(xì)胞分裂素/生長素比例控制器官發(fā)生的模式：IAA/KT高，利于根形成；IAA/KT低，利于芽的分化；IAA/KT適中，則產(chǎn)生愈傷組織 天然提取物： 椰乳，濃度10%；番茄汁，濃度5-10%；香蕉汁5，濃度-10%注意： -植物離體培養(yǎng)中，及時(shí)更換植物生長物質(zhì)的種類和濃度，才能有效控制器官的分化。 -生長物質(zhì)用量影響器官分化。IAA、IBA處理根比較壯，2,4-D對(duì)生根不利。BA比KT誘導(dǎo)芽效果強(qiáng)，ZT作用窄。3）有機(jī)成分 酪氨酸明顯增強(qiáng)煙草組織的器官形成 酰胺類促進(jìn)器官形成 水解酪

51、蛋白、水解乳蛋白為多種氨基酸混合物 腺嘌呤促進(jìn)莖切段培養(yǎng)中芽的形成 糖提供外植體能量，維持一定水勢 4）物理性質(zhì)培養(yǎng)基形式、水勢，對(duì)形態(tài)發(fā)生有明顯影響 誘導(dǎo)愈傷組織-固態(tài)培養(yǎng)基；細(xì)胞和體細(xì)胞胚增值-液態(tài)培養(yǎng)基，胚狀體發(fā)育成苗-固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)基PH值對(duì)芽分化有影響 ：5.5-6.02、培養(yǎng)條件1）光照 愈傷組織培養(yǎng)中，某些植物誘導(dǎo)要求在黑暗中生長，大多數(shù)都需要光。 有的葡萄品種對(duì)短日照敏感，煙草愈傷組織需要藍(lán)光。2）溫度：一般2428，有些植物需要一定晝夜溫差。 （二）繼代培養(yǎng)物的分化潛力1、生理因素 多次繼代后不加IAA也可達(dá)到同樣生長量。 不同培養(yǎng)物保持分化潛力不同。 喪失分化能力的組織，加

52、入腺嘌呤、酪蛋白、酵母汁后，可恢復(fù)一定分化能力。2、遺傳因素 繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)染色體紊亂，分化能力喪失與倍性不穩(wěn)定有關(guān)。(三)繼代培養(yǎng)物的體細(xì)胞變異后生遺傳變異： 即離體培養(yǎng)組織在培養(yǎng)中獲得激素的自主性（有外源激素才能生長的組織，后期自身產(chǎn)生激素）。 影響后生遺傳變異產(chǎn)生的因素主要有：1、組織自然傾向2、培養(yǎng)基化學(xué)成分和物理狀態(tài) 四、 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生 概念：極性植物細(xì)胞分化中的一個(gè)基本現(xiàn)象，指植物的器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。細(xì)胞無性系植物離體培養(yǎng)中，任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株，即稱細(xì)胞無性系。植物愈傷組織離體培養(yǎng)中，脫分化形成無極性

53、或無明顯形態(tài)的愈傷組織塊。當(dāng)條件適合時(shí)，愈傷組織發(fā)生再分化而產(chǎn)生芽或根的分生組織，甚至體細(xì)胞胚，進(jìn)而發(fā)育成苗或完整植株。 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生有以下兩種情況：一、不定芽和根的發(fā)生（器官發(fā)生） 是愈傷組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。（一）愈傷組織通過不定芽和根形成器官的階段1、外植體脫分化-愈傷組織 2、愈傷組織-瘤狀結(jié)構(gòu)3、瘤狀結(jié)構(gòu)-器官原基（二）愈傷組織的器官發(fā)生順序1、無芽的根或無根的芽：愈傷組織僅有芽或根器官的分別形成，不能形成完整植株。2、先芽后根 愈傷組織先形成芽，芽生長后，其基部發(fā)出根，進(jìn)而形成小植株，是大多數(shù)植物的器官發(fā)生方式。如蘋果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麥、水稻3

54、、先根后芽：先形成根，再從根的基部分化出芽形成小植株，雙子葉植物中普遍。如顛茄、枸杞、苜蓿4、分別形成芽和根 愈傷組織鄰近不同部位分別形成芽和根，兩者結(jié)合起來形成一株小植株，類似根芽的天然嫁接。如胡蘿卜、石刁柏二、體細(xì)胞胚的發(fā)生（一）胚狀體的概念 胚狀體-離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)歷了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物，統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。 胚狀體可以從花藥或花粉培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、離體器官培養(yǎng)、單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中產(chǎn)生。（二）胚狀體的發(fā)育過程 細(xì)胞分化持續(xù)細(xì)胞分裂增殖原胚期球形胚心形胚魚雷形胚子葉期（三）胚狀體的類別1、體細(xì)胞胚 來源于根、莖、葉和它們的組織和細(xì)胞，經(jīng)離體培養(yǎng)而發(fā)生的類胚結(jié)

55、構(gòu)，染色體組為兩套，可發(fā)育成為正常植物體。2、生殖細(xì)胞胚 來源于大小孢子細(xì)胞，經(jīng)離體培養(yǎng)而形成的類胚結(jié)構(gòu)，染色體為單套，可發(fā)育成單倍體植物體，經(jīng)染色體加倍成為可育植物。3、三倍體胚 來源于胚乳細(xì)胞的胚狀體，具三套染色體組。三倍體植物具不育性。（四）胚狀體形成植株的特征1、具有兩極性 細(xì)胞發(fā)育早期階段，從其相反的兩端分化出芽端與根端，而不定芽和不定根都是單向極性。2、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽和不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系3、胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“”形，而不定芽和不定根的維管組織無此現(xiàn)象。 （五）胚狀體發(fā)生影響因素： 銨態(tài)氮對(duì)胚狀體的發(fā)生有利，也可同時(shí)使用銨態(tài)氮和硝態(tài)氮 赤霉素、細(xì)胞分裂素抑制胚狀體發(fā)生 生長素類對(duì)胚狀體的發(fā)生有重要作用 （六）胚狀體形成植株的優(yōu)點(diǎn)1、胚狀體的數(shù)量比不定芽多2、胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和貯藏3、胚狀體的有性