生物工程生物技術專業(yè)英語翻譯(五)

1、（雙重否定：not.until）第五章 酶和細胞固定化技術微生物尤其是酵母已經(jīng)應用了幾千年，用于生產(chǎn)啤酒、葡萄酒和其他發(fā)酵產(chǎn)品。然而，直到1878年，負責發(fā)酵的酵母細胞的真正組分才被命名為酶（來自古希臘語意思是酵母中）。不到二十年后，酶無生命的本質(zhì)通過酵母的自由細胞提取物清楚的證明，其可以催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。在1926年的時候，通過脲酶的純化和結(jié)晶才最終證明酶是蛋白質(zhì)。在隨后的幾年了，隨著生物化學新規(guī)則的發(fā)展，酶被證明存在于一切生命中并被生命細胞利用催化特定的化學反應。后來，酶在它們的作用中展現(xiàn)出高度的專一性，以高轉(zhuǎn)化速率發(fā)揮功能而且在低的壓力、低的溫度及水溶液中這樣溫和的生理條件下進行操作

2、。盡管酶作用的通常位置是在生命細胞的內(nèi)部，但有大量的例子是細胞將酶排出（胞外酶）到環(huán)境中以分解大的有機分子（蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉），這些分子不能進入到細胞中。對于某些微生物，胞外酶的生產(chǎn)對于正常生長是非常重要的，而且最初商業(yè)化利用的酶就是來源于此。5.1 分離的酶的商業(yè)角色所有商業(yè)化發(fā)酵過程的產(chǎn)物都是酶在生產(chǎn)微生物中進行活動的最終結(jié)果。在特定的發(fā)酵中分離的酶能不能代替生產(chǎn)微生物呢？這是經(jīng)常會問到的問題，但是在實際中很少能實現(xiàn)令人滿意的結(jié)果。利用整個微生物肯定會在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定的缺點：（a） 微生物生長和產(chǎn)物形成的最適條件不同；（b） 大比例的基質(zhì)將轉(zhuǎn)化為生物體；（c） 無用的副反應將會發(fā)生；

3、（d） 向所希望的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率低；（e） 從發(fā)酵中分離所想要的產(chǎn)物將會困難。這樣，通過利用分離純化的酶，如果不是全部，大部分這些限制會被減少或者克服。最為顯著的優(yōu)點是更易進行控制、對活動更強的預見性及催化作用專一性的提高。然而，對于多數(shù)發(fā)酵，對整個微生物的傳統(tǒng)應用好像很好的延續(xù)著。盡管從微生物、植物和動物中分離出了超過2000種的酶，但是只有不到20種在使用的酶認為是對商業(yè)生產(chǎn)商或者應用工業(yè)或服務業(yè)而言是重要的。目前，商業(yè)生產(chǎn)主要的產(chǎn)品是粗酶形式的相對簡單的酶，主要是用于食品和相關工業(yè)及detergent制造業(yè)（圖5.1工業(yè)酶的分布）。大部分的酶是水解酶，像淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等

4、等，主要的作用是作為添加劑或者烘烤、dairy、釀造和果汁工業(yè)的過程輔料。與粗酶不同的是，某些高度純化的酶具有迅速擴展的市場，像葡萄糖異構酶和葡萄糖氧化酶。這些酶和許多其他的酶正在藥業(yè)、治療、臨床和化學分析中尋找更多的應用。5.2 酶的來源商業(yè)用的酶來源于植物與動物組織及篩選出的微生物。通過傳統(tǒng)方法從植物中獲得的酶包括蛋白酶（木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶）、淀粉酶、脂氧合酶和某些專門化的酶。從動物組織中獲得的酶主要是胰蛋白酶、脂肪酶和生產(chǎn)奶酪的粗制凝乳酶。對于植物和動物來源都存在著許多供應的問題；這些包括對于植物酶來說的季節(jié)變化、低濃度和高過程成本，而對于來自肉類工業(yè)副產(chǎn)品的動物酶，其

5、供應是有限的而且受到其他利用者的競爭?，F(xiàn)在顯而易見的是，許多傳統(tǒng)資源對于世界范圍酶的需求是不足的，更多的求助于為現(xiàn)有酶和新酶尋找微生物資源。實際中，微生物酶來源于有限范圍的微生物，尤其是長期以來作為食品和飲料生產(chǎn)者的微生物。對一個廠家來說從法律部門獲得使用來自未經(jīng)證明的微生物的產(chǎn)物的許可是昂貴的，因為它們必須經(jīng)過毒性和安全性評價。由于這個原因，許多工業(yè)微生物酶來源于稍微多于11種的真菌、8種細菌和4種酵母，而且在實際過程中通常會從這些群體中尋求新的酶（表5.1）。除非發(fā)展更為便宜的安全性檢測方法，否則發(fā)展產(chǎn)物的新微生物活動會受到許多限制。酶生產(chǎn)的篩選程序是極為復雜的，尤其是所采用的培養(yǎng)類型決定

6、了菌株的選擇。已經(jīng)表明，某些菌株只在表面與固體培養(yǎng)下生產(chǎn)高的酶滴定度，而另一些菌株則回應淹沒培養(yǎng)技術。這樣，篩選技術就必須與最終商業(yè)生產(chǎn)過程相聯(lián)系。5.3 酶的生產(chǎn)選擇微生物后，生長就必須在最大化生產(chǎn)酶的條件下進行。胞外酶對于胞內(nèi)酶而言有著特殊的優(yōu)點，因為，它們的生產(chǎn)不需要昂貴的細胞破碎技術；而且，胞外酶在培養(yǎng)液中以相對較純的形式存在，而胞內(nèi)酶需要更為復雜的分離純化方法（見第六章）。胞外酶構成了工業(yè)微生物酶生產(chǎn)的bulk，但是胞內(nèi)酶正在尋找作為醫(yī)學和工業(yè)中診斷酶的越來越重要的角色。所選擇的微生物應該對于酶的生產(chǎn)來說是穩(wěn)定的，可以形成孢子，在廉價的基質(zhì)上能夠很好的生長，不生產(chǎn)有毒物質(zhì)而且沒有抗生

7、素活性。目前工業(yè)酶的生產(chǎn)主要依賴于deep tank 或者固體發(fā)酵技術。由于微生物酶通常是小體積產(chǎn)物，所以難于判定用于深層培養(yǎng)生產(chǎn)的特定發(fā)酵設備的發(fā)展。一般上，抗生素生產(chǎn)所采用的設備在設計與功能上是相類似的。一種典型的酶生產(chǎn)生物反應器是由不銹鋼制造的，有強大的機械攪拌器和空氣鼓泡器，且容積為10-50m3。這樣的生物反應器有固有的可變性，可以容易的轉(zhuǎn)向生產(chǎn)其他的產(chǎn)品。工業(yè)中采用的工業(yè)生物反應器的例子見表5.2。讀者要參考第四章以進一步的詳細了解。一般而言，分批過程中，胞外酶的生產(chǎn)需要30-50h。停止發(fā)酵的最佳時間是在最大生產(chǎn)點與最大酶活性點之間。最優(yōu)條件由原料成本、plant容積及便于回收而

8、決定。連續(xù)培養(yǎng)技術可以用于實驗室規(guī)模酶的生產(chǎn)，但是沒有表明有任何一個商家采用這種方法。分批方法常常被延伸，并且通過連續(xù)或者半連續(xù)的補給碳水化合物或者蛋白質(zhì)的方式改進酶的生產(chǎn)。酶合成沒有總體的動力學模型，但是已經(jīng)可以對某些酶的調(diào)控進行研究。只有少數(shù)工業(yè)重要的酶是在指數(shù)生長期生成的，絕大多數(shù)是在指數(shù)生長期后合成的。有用的酶蛋白的產(chǎn)量可以是培養(yǎng)基初始干物質(zhì)的1-5%，而在一個典型的酶發(fā)酵過程中，細胞的產(chǎn)量在相似的基礎上由2-10%變化。生物反應中酶的生產(chǎn)是怎樣進行調(diào)控的以發(fā)揮商品控制器的優(yōu)勢？有很多方法可以用來克服任意一種已建立的限制某一給定的酶生產(chǎn)的控制機制。原則上，有兩種主要的類型：操控微生物的

9、基因元件和控制微生物的生長環(huán)境。常常是通過兩種方法的應用獲得理想的結(jié)果。微生物的基因操作在第三章已經(jīng)討論過了，而且如果不是全部也有許多所很好采納的程序發(fā)現(xiàn)對于酶的調(diào)控研究是有用的。突變體的形成仍是最為常用的工業(yè)方法但是重組dna技術將被更多的使用，尤其對于非食品的應用。過程控制器可以操控生長環(huán)境，通過選擇合適的培養(yǎng)基組成或者培養(yǎng)參數(shù)而克服由調(diào)節(jié)機制引起的酶生物合成的抑制。對于誘導酶，向培養(yǎng)集中加入誘導物是非常有效的。最為廣泛采用的誘導物是不能進行代謝的物質(zhì)。降解酶常常通過誘導和分解代謝物阻遏來進行控制，而生物合成酶主要由反饋調(diào)節(jié)進行控制。反饋調(diào)節(jié)包括反饋（或者終產(chǎn)物）抑制和反饋阻遏兩種形式。酶

10、生物合成的終產(chǎn)物阻遏可以通過下面方法中的任何一種方法或者所有方法來避免：（a） 通過向培養(yǎng)基中添加抑制劑來限制終產(chǎn)物的積累；（b） 保證在所供應的培養(yǎng)集中沒有終產(chǎn)物；（c） 篩選不被終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變體（組成突變體）。許多工業(yè)重要的酶受到分解代謝物阻遏的影響（表5.3）。實際中，分解代謝物阻遏是可以避免的，通過：（a） 誘變以抵制分解代謝物阻遏；（b） 在培養(yǎng)集中避免使用阻遏碳源；（c） 通過限制生長使酶的合成去阻遏，包括緩慢的補給阻遏物或者使用緩慢代謝的物質(zhì)（analogues）或者底物的衍生物。在許多重要的次級代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)中，產(chǎn)物的形成通常發(fā)生在繁殖期，如在最初的快速生長（生長期

11、）之后。這種現(xiàn)象最初報道于青霉素的生產(chǎn)，但是現(xiàn)在已知發(fā)生于許多其他生產(chǎn)中。還不知道引起次級代謝的因素，但是它確實導致細胞特定的酶的組成發(fā)生顯著變化。酶合成的去阻遏見于表5.4中的一些發(fā)酵過程。固體基質(zhì)培養(yǎng)方法在從真菌中生產(chǎn)商品酶的過程中占有重要的角色，尤其是在日本。來自aspergillus 的淀粉酶和來自aspergillus 及mucor的蛋白酶長期以來在商業(yè)上都是重要的。產(chǎn)生出的其他酶有果膠酶和纖維素酶。最開始，培養(yǎng)物通過人工處理在trays上生長，但是清洗、filling and emptying trays越來越機械化的系統(tǒng)得到了發(fā)展。轉(zhuǎn)動鼓系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)被越來越多的使用（見第四章）。固體

12、系統(tǒng)與淹沒培養(yǎng)過程相比的優(yōu)缺點已經(jīng)很好的進行了分析。固體培養(yǎng)方法進行酶生產(chǎn)的主要的積極方面是：（a） 培養(yǎng)箱中單位體積的酶產(chǎn)量高；（b） 能耗低；（c） 需要微控；（d） 提取出高度濃縮的酶溶液；（e） 設備大小通常??；（f） 不難進行放大。在培養(yǎng)過程中，通過補料的方式可以進行連續(xù)操作。淹沒培養(yǎng)方法在目前商品酶的生產(chǎn)中占有主導地位，因為過程中可以更為容易的控制操作成本和感染的危險。最終決定一種酶的生產(chǎn)是通過固體基質(zhì)發(fā)酵還是淹沒發(fā)酵基本上取決于這兩種過程的相對經(jīng)濟性。yet notwithstanding, 固體基質(zhì)發(fā)酵更接近于許多微生物的自然生長環(huán)境條件，尤其是真菌。它可能提供了更易被接受的酶

13、活動的混合。未來固體基質(zhì)發(fā)酵方法生產(chǎn)酶的成功進行大體上取決于several lines of研究成果，包括微粒間質(zhì)量傳遞、酶對不溶性物質(zhì)的降解及生物反應器設計和過程控制的改進（也見于第四章）。5.4 酶的法規(guī)出于對毒性和其他安全方面的考慮，微生物酶產(chǎn)品需要滿足嚴格的條例（specification）。在安全性評估中可能要考慮的方面主要有：（1） 由任何一種存在于產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)引起變態(tài)反應，包括酶蛋白和其他任何外來物質(zhì)；（2） 酶的催化活性；（3） 有毒化合物的出現(xiàn)像真菌毒素和抗生素?？乖杂梢环N酶到另一種酶而變化，盡管它是不能改變的。配制可以減小利用物對酶的暴露。粉塵形式的酶會出現(xiàn)許多問題，但

14、是可以通過在任何插入的載體中把酶用囊狀物包裹的方法來消除出現(xiàn)的問題。液體酶產(chǎn)品使用更廣?，F(xiàn)在認為酶催化活性的的直接影響are of low health concern，總體上，純酶是無毒的。在酶的制備過程中，通過兩種途徑會產(chǎn)生毒素。有毒物質(zhì)可能存在于培養(yǎng)基中，由于多數(shù)酶產(chǎn)品只經(jīng)過了粗純化，這種物質(zhì)會出現(xiàn)在最終的產(chǎn)品中。這樣為了確保不帶有有毒物質(zhì)，食品或飼料級的原料應該專門化，而且應該對整個系統(tǒng)微生物的污染情況進行規(guī)律性檢測。真菌酶毒理學上主要關心的是生產(chǎn)菌株中存在的真菌毒素。在過去的25年里，人們越來越認識到許多真菌都會生產(chǎn)有毒代謝物和真菌毒素，而且it is obligatory to 對

15、所有真菌酶樣品進行特定真菌毒素的檢測。許多這樣的真菌毒素在檢測的微生物中會表現(xiàn)出致癌的、雌激素的、致突變的及致畸形的活性。對于危險的數(shù)量估計是極其困難的，因為關于低濃度的真菌毒素在人體中的毒性應答的信息是很少的。然而，如果能夠檢測到真菌毒素，那么這個產(chǎn)品就不能使用了。用來生產(chǎn)酶的微生物可以分為三組。根據(jù)這個分類，就需要進行不同水平的毒性檢測（表5.5）。a組微生物傳統(tǒng)上用于食品或者食品生產(chǎn)中。這些情況下不需要進行毒理學研究。b組微生物是那些存在于食品中的無害污染物，只需要進行短期毒性檢測。 c組是所有未列在a組和b組中的微生物。這種微生物需要更嚴密的毒理學研究，包括對某些特殊動物喂養(yǎng)的長期研究

16、。酶產(chǎn)品安全性由生產(chǎn)商負責，而新產(chǎn)品需要獲得相應權威部門的同意。國內(nèi)和國際機構對某些酶made specification and recommendation。總結(jié)一下，酶產(chǎn)品應該是一致的（uniform）、安全可靠的，而且滿足specification是生產(chǎn)商的職責所在。5.5 固定化酶使用分離的酶的最重要的缺點是在操作條件下它們不足以穩(wěn)定，作為可溶于水的自由分子，它們難于從底物和產(chǎn)物中分離和反復利用。近年來，多次嘗試通過酶固定化的過程以克服這些缺點。固定化通常被認為是酶從一種可溶于水的運動狀態(tài)轉(zhuǎn)為不溶于水的、不可運動的狀態(tài)。固定化阻止了酶在反應混合物中的分散而且便于通過簡單的固/液分離技

17、術就能從產(chǎn)物流中將其回收。這樣，反應產(chǎn)物中沒有酶，就能夠?qū)γ高M行再利用。固定化酶advantageously用于連續(xù)操作生物反應器中。發(fā)展了超過100種的固定化技術。這些技術可以分為不同的類型。實際中，酶的固定化的實現(xiàn)可以通過將酶共價連接到一種不溶于水的物質(zhì)的表面上；通過與適宜試劑的交聯(lián)產(chǎn)生不溶性的微粒；通過包埋在可透過酶、底物和產(chǎn)物的一種載體（matrix）或者凝膠中；通過膠囊封裝；以及通過固體支持物吸附酶。固定方法的圖列由圖5.2所示，固定化方法見表5.6。酶共價連結(jié)到固體支持物上 許多類型的支持物都可以利用包括porous glass and ceramics（淀粉葡萄糖苷酶）、合成的多

18、聚物（trypsin）、纖維素（天冬酰氨酶、淀粉酶）、尼龍（脲酶）和氧化鋁（葡萄糖氧化酶）。利用肽和蛋白質(zhì)化學的方法進行連接。共價鍵的形成具有的優(yōu)點是形成一種不能通過ph、離子強度或者底物而逆轉(zhuǎn)的連接。然而，通過化學反應產(chǎn)生共價鍵有可能導致酶的部分或者整體失活。共價連接的方法有許多，固定化的過程至少由兩步組成，支持物的活化和酶本身的連接。實際中，參與化學鍵形成的基團是氨基、亞胺基、酰胺、羥基、羧基、巰基、甲基硫、胍基, 咪唑和 酚基。酶包埋于凝膠 原則上，所采用的方法是很溫和的而且不會破壞酶的活性?？梢栽谀z形成之前將酶添加到單體溶液中。通過改變溫度或者添加凝膠誘導化學物質(zhì)以使凝膠形成。酶維持

19、在它的原始狀態(tài)不會有封鎖活性位點、基團的風險或者化學鍵封鎖酶分子的風險。然而，這個固定化形式的主要的缺點就是酶經(jīng)過pores的不斷流失，及與高分子量化合物尤其相關的底物和產(chǎn)物運輸?shù)姆稚⒖刂贫姑阜磻斐傻牧魇?。包埋物質(zhì)包括硅膠、硅橡膠、淀粉和多糖。多糖是最被廣泛采用的包埋載體，已經(jīng)用于天冬酰氨酶、葡萄糖異構酶、過氧化物酶和許多其他的酶。酶的膠囊封裝 這個方法是對包含方法的改變，涉及到用半透膜進行膠囊封裝。這些膜不能透過酶和其他巨型分子但是卻可以透過低分子量的底物和產(chǎn)物。采用的物質(zhì)類型包括火棉膠（過氧化氫酶、l-天冬酰胺酶）、纖維素衍生物（脂肪酶）、聚苯乙烯（過氧化氫酶）和最經(jīng)常用的尼龍（t

20、rypsin、脲酶）。這些物質(zhì)用來形成薄的、球狀的半透膜以形成包含有酶的微膠囊。酶吸附于固體基質(zhì)上 吸附最吸引人的特征就是它的簡便性。吸附的條件不包括反應，不對酶進行修飾。最為常用的吸附劑包括許多有機物和無機物像氧化鋁（氨基?；浮⒌矸勖福?、纖維素（纖維素酶）、clays（過氧化氫酶）、玻璃（脲酶）、羥基磷灰石（nad焦磷酸化酶）、碳和各種硅材料（淀粉酶）。離子交換易吸附多數(shù)蛋白質(zhì)，出于這個原因，被廣泛用于酶的固定化。酶的連接是可逆的，因此在有底物和增大離子強度的條件下吸附的酶也能解吸附。與多功能試劑交聯(lián) 如果在有固體支持物的條件下反應，那么就會形成一個三位網(wǎng)狀結(jié)構的酶分子。實際上，在吸附到合

21、適的載體上之后，酶more usually更經(jīng)常進行交聯(lián)。最普遍采用的交聯(lián)劑有aliphatic diamines, 二甲基己二亞氨脂、二甲基辛二亞氨脂、特別是戊二醛。分子間（生成不溶于水的聚集體）與分子內(nèi)都可以發(fā)生交聯(lián)。酶通過共聚集作用而被固定，例如，合并到多聚物上，常常是與馬來酐和ethylene發(fā)生共聚作用。一種廣泛采用的方法是先吸附到賽璐玢膜上，然后再和戊二醛交聯(lián)（淀粉酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶）。由于經(jīng)過包埋和微膠囊化，這些衍生物對巨型分子底物顯示出很少的活性或者無活性。商業(yè)化固定化酶 合適的固定化方法的選擇主要取決于這個方法對酶的活性有怎樣的影響。共價連接和交聯(lián)在酶和支持物之間產(chǎn)

22、生強的化學鍵。這些方法相對而言勞動量大并且成本高。它們會引起嚴重的酶的失活，而且活性中心會發(fā)生連接（表5.7固定化酶的限制性）。相對的，吸附和凝膠包埋的固定化方法簡單有效，它們在酶和載體之間不產(chǎn)生強的鍵。結(jié)果，酶常常從支持物上脫離。這個問題大體上可以通過將吸附的或者包埋的酶與戊二醛進行交聯(lián)而獲得解決。 許多酶的固定化在實驗室水平都得以實現(xiàn)了，但是只有很少的情況可以放大到工業(yè)生產(chǎn)。兩個杰出的商業(yè)化成功是葡萄糖異構酶在食品工業(yè)中的應用和青霉素?；冈诳股毓I(yè)的應用。 葡萄糖異構酶催化葡萄糖向果糖的部分轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)一種低成本的甜味劑，將會最終改變?nèi)蚶胹ugar cane and sugar be

23、et ，sucrose 甜味劑傳統(tǒng)原料的方式。至少有四家公司現(xiàn)在供應噸量級的果糖甜味劑，利用不同的微生物資源（streptomyces spp, bacillus coagulans, actinoplanes missouriensis）。實際中，這些酶需要高的葡萄糖底物濃度以獲得最佳活性。來源于廉價淀粉的原料漿以40-50%葡萄糖濃度供應到生物反應中。連續(xù)進行泵操作會出現(xiàn)黏度的問題，但是通過在高溫（60）下或者高ph（7.5-8.5）下操作可以解決這個問題。發(fā)展的工業(yè)規(guī)模的色譜技術可以分離果糖和葡萄糖以生產(chǎn)含有55%或者更高果糖量的富集果糖漿。每年有上千噸的這種酶用來生產(chǎn)成百萬噸的果糖漿。

24、過程數(shù)據(jù)見表5.8。工業(yè)上葡萄糖異構酶以固定化酶和固定化細胞的形式應用。第二種重要的工業(yè)用固定化酶是青霉素?；福▉碓从诖竽c桿菌），它催化天然青霉素的側(cè)鏈去乙酰化而生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸（6-apa）。6-apa可以用來合成有著重要醫(yī)學應用的抗生素半成品。通過這樣的方法，重要的抗生素氨芐青霉素就可以由苯基甘氨酸和6-apa合成。每年至少生產(chǎn)3500噸6-apa，但是這只需要30噸制備的酶。酶以granular 的形式使用在固定床柱式生物反應器中。5.6 固定化細胞的特性酶的固定化會引起它的性質(zhì)發(fā)生改變。這些變化歸結(jié)為：（1）酶結(jié)構的化學和/或構型發(fā)生變化，（2）固定化酶的異種催化本質(zhì)，和（3）所

25、采用的載體的物理化學性質(zhì)。生物工程中最具挑戰(zhàn)性的問題之一是提高酶的穩(wěn)定性。當酶用于生物反應器系統(tǒng)時，其所處環(huán)境通常要比在生物體中惡劣得多。尤其是它們受到高溫、無活性的雜質(zhì)與沒有生命細胞保護性平衡環(huán)境的影響。甚至在酶化學發(fā)展許多年后，對于酶失活的機制的了解還是很少。虛擬語氣盡管有例子表明酶經(jīng)過固定化提高了穩(wěn)定性，但是，一般而言，固定化不是穩(wěn)定酶的方法。固定化像其他隨機處理一樣，有可能提高、降低或者不影響酶的穩(wěn)定性。 be as likely as.生物反應中，熱量代表了酶失活的一個主要原因。酶熱失活肯定是因為蛋白質(zhì)分子的構型發(fā)生了改變。 當酶共價連接到一個固體支持物上的時候，蛋白質(zhì)分子就變得更緊

26、密而不太能展開，這樣就更不容易失活了。蛋白質(zhì)結(jié)構的展開是不同失活酶模型的共有特征，原因有有機溶劑、變性劑和ph的改變。因此，與固體支持物多點連接的固定化就為穩(wěn)定酶提供了一個總體的方法。酶的固定化常常會導致它們的某些作用特點發(fā)生變化。當酶在自由狀態(tài)作用的時候，對于過程中底物、產(chǎn)物、激活劑、抑制劑和輔因子這些所有的組分，系統(tǒng)是同源的。然而，當它們固定后，新系統(tǒng)的物化性質(zhì)就在酶分子與水相間產(chǎn)生分隔create partitioning。這樣，希望酶的某些特點與自由溶液中的酶相比能夠發(fā)生重大的變化。相似的，輸送底物到催化劑受到分散抗性的影響。當?shù)孜镄枰?jīng)過水的邊界層從液體bulk輸送到固定化酶再到固定

27、化酶粒子的內(nèi)部的時候，分散限制就會產(chǎn)生， 固定化酶粒子可以是凝膠、微膠囊或者中空纖維。固定化酶用于改進一個現(xiàn)有的過程或者創(chuàng)造出一個新過程。它們對商業(yè)實踐的滲透還小。早在1983年，固定化系統(tǒng)的商業(yè)工業(yè)化操作只限于7種葡萄糖異構酶、4種青霉素?；浮?種氨基?；负腿樗崦?，2種葡萄糖?；?、一種天冬氨酸酶和一種延胡羧酸酶。固定化系統(tǒng)的進一步應用是參與分析與醫(yī)療應用，并且將源于新的想法而不是改進。目前為止它們有限的成功應用的原因是什么？原則上，這些原因可以歸結(jié)為下列因素：（a） 許多工業(yè)過程所使用的可溶性酶相對便宜；（b） 向現(xiàn)有過程引入新的設備資本capital高；（c） 在總體操作econom

28、y和plant 設計規(guī)模上固定化酶所表現(xiàn)出的令人失望的結(jié)果。酶工程的進一步工業(yè)化應用可見于兩個方面：那些已經(jīng)在使用或者將要應用的和那些在真實的成為技術與商業(yè)化可用之前需要進行重要研究的。第二代酶工程is undoubtedly one of the most exciting and intellectual demanding of many facets of biotechnology.（表5.10）5.7 細胞固定化細胞和器官是進行生化合成可利用的（feasible）最小單位，由于它們含有輔酶生產(chǎn)系統(tǒng)，ordered muti-enzyme sequence,etc。因此，令人吃驚的是

29、微生物細胞的固定化技術在酶固定化之后才得到發(fā)展。然而，實際中，酶的固定化技術主要關心的是單酶系統(tǒng)，催化單一的反應如氧化還原、異構、水解等等。利用固定酶進行除了簡單的one-stage 反應之外的其他反應的嘗試遇到了嚴格的限制，首先就是發(fā)展一種生產(chǎn)（regenaration）輔酶的實用的( practical,feasible)技術，其次是缺乏安排酶分子以有序的群體進行多步酶催化反應的方法。固定化細胞能不能克服固定化酶的這些缺點并且在細胞固定化之后還有可能操控整體細胞代謝嗎？ 在過去的十年里，用于固定化細胞和器官的方法得到了迅速發(fā)展，而且制備范圍包括細胞碎片、器官、細胞勻漿液、死細胞、通透性細胞

30、、休息細胞、饑餓細胞和細胞混合培養(yǎng)液。在多數(shù)情況下，制備物被用作生物催化，一些最近的研究以它們作為親和（affinity）吸附劑?，F(xiàn)在，能夠?qū)缀跛械募毎Y(jié)構進行固定并且保持細胞的viable.這個過程不是沒有缺點，例如向dense細胞制備物輸送良好的氧氣供給、支持物結(jié)構中細胞的生長、甚至改變的細胞代謝方式都更加困難了。細胞固定化技術的承諾是大量的（considerable）而且肯定比固定化酶范圍更大。某些工業(yè)應用現(xiàn)在正在操作中。bacillus coagulans的固定化細胞生產(chǎn)很大份額的高果糖漿，且每年都能產(chǎn)生大量的aspartic and malic acids.在微載體球上生長的貼壁

31、依賴型哺乳動物細胞代表了一種出色的細胞固定化技術，正用于疫苗、酶、激素、抗體和干擾素的生產(chǎn)。人工固定化 前面所說的固定化酶的方法可以用于整個細胞。然而，實際中，用于微生物、動物和植物細胞的主要方法是將細胞包埋于凝膠或者吸附，但必須注意防止必要的代謝活動的失活。這種系統(tǒng)可以容易得從產(chǎn)物中分離生物催化劑并且使其更為穩(wěn)定。在某些情況下，所采用的細胞是死細胞，但是仍保留有必需的酶活性。細胞經(jīng)過處理使某些分子通過膜容易進入并且存在。這個過程，透過，涉及細胞膜上小pores的形成但保留全酶完整?？梢栽诠潭ɑ盎蛘咧筮M行細胞處理。然而，固定化的活細胞可以在休息狀態(tài)進行不同的反應，也可以在凝膠載體上活躍生

32、長的時候進行。固定化的生長細胞可以看作更新的或者壽命延長的生物催化劑，存在于特殊限定的空間區(qū)域并且受到保護以抵御功能區(qū)以外不利環(huán)境參數(shù)的作用。固定化細胞過程最主要的優(yōu)點之一就是能夠再利用。這就為分批過程連續(xù)地進行提供了一種手段并且進一步使得維持有高數(shù)量的細胞獲得快速的反應速率。支持物將微生物保留在生物反應器中，允許超過微生物最大比生長速率的稀釋速率（這樣克服了連續(xù)系統(tǒng)中的洗出問題）。微生物細胞可以生產(chǎn)許多生物合成反應必要的輔因子，這就比分離酶具有優(yōu)越性，分離酶需要供應輔因子：輔因子的成本是很高的（prohibitively high）。多酶反應的spatial組織更好的在整個細胞中實現(xiàn)，與分離

33、和/或固定化酶相反。但是，利用固定化的整個細胞也有一些缺點。細胞中含有大量的有催化活性的酶，在某些過程中，酶就會催化不需要的支鏈反應（side reaction）?？梢院唵蔚耐ㄟ^加熱或者用堿或膽汁鹽處理來破壞某些不需要的酶反應。固定化也會造成所想要的催化活性的丟失，但是這個問題可以通過合適的選擇固定化方法來減少。催化活性的丟失是由于分散障礙阻止（impeding）了底物的通過或產(chǎn)物的移除固定化休眠或生長的細胞，為了維持細胞生長而消耗底物作為碳源和能量的來源，產(chǎn)物的產(chǎn)量將會減少；隨著固定化細胞生長，產(chǎn)物就會被從凝膠載體上漏出的細胞所污染。固定化酶或細胞生物反應器 已經(jīng)在前面的第四章講述了針對發(fā)酵

34、過程使用的生物反應器設計和操作。這些生物反應器，某些類型可以用于固定化酶和細胞，但是總體上，用于發(fā)酵的反應類型與那些用于固定化酶和細胞的是極其不同的。當設計一個固定化過程的時候，首先要考慮是采用分批還是連續(xù)操作。多數(shù)情況下會選擇連續(xù)過程。kinetic consideration是選擇生物反應器時一個重要方面?？傮w上，對多數(shù)反應類型，packed bed 反應器比連續(xù)攪拌釜式反應器具有kinetic 優(yōu)越性。在一個連續(xù)攪拌生物反應器中，平均反應速率比packed bed 反應器中的低，這是因為不同的操作底物濃度。然而，攪拌生物反應器更適于需要高的氧傳遞速率的反應或者添加堿或酸控制ph。必須考慮

35、處理的液體的體積。對于一種所想要的化合物單位生產(chǎn)，當采用連續(xù)方法的時候，發(fā)酵broth的體積就要非常小。固定化酶和細胞所采用的生物反應器類型見于圖5.3。對（packed bed）固定床與流動床生物反應器有特殊的興趣。連續(xù)的固定床生物反應器被廣泛使用而且關于底物流動表現(xiàn)出三種可能性，向下流動、向上流動或者循環(huán)流動。當反應速率受底物利用速率的影響時，循環(huán)就是所選擇的方法。由于底物的向下流動會引起床的壓迫（compression），所以工業(yè)實踐中常常選擇向上流動的方法。相似的，當反應過程中釋放氣體，向上流動是所喜歡的（be prefered）。固定化生長細胞系統(tǒng)會是有問題的，由于解放的細胞封阻有效

36、空間（粒子間的空間）導致channelling of 底物。在流動床中，當跨越床下降的壓力等于床的重量的時候，微粒處于懸浮狀態(tài)。壓力的減少產(chǎn)生a paked bed，而壓力的上升引起淘析或者系統(tǒng)中微粒的移除。當?shù)孜锶芤菏歉唣ざ然蛘邭怏w底物或產(chǎn)物參與連續(xù)生物反應器系統(tǒng)的時候，流動床生物反應器有著特殊的價值。固定化系統(tǒng)中微粒的大小對形成平整的流動床來說是重要的。天然黏附固定化 在這種類型的固定化中，細胞通過天然黏附機制和subsequent film growth連接到表面上。一些這種類型的生物反應器包括：（a）microbial film在固定床生物反應器的生長，例如污水處理過程中的滲濾和滴流f

37、ilters；（b）film在轉(zhuǎn)動表面的生物反應器或者轉(zhuǎn)動的生物連接器（contactors）進行生長，在這里，微生物或者動物細胞can develop on patially submerged disc which rotate through a reservior of nutrient exposing the film growth to liquid and air in sequence;和（c）film在小支持物上的生長，存在于攪拌釜式或者流動床生物反應器中，為微生物克隆創(chuàng)造密集的表面積。微粒間的物理接觸和磨損移走了過量的表面生長并維持相對恒定的film厚度。這種微粒有不同的形狀、大小、porosity和密度而且可以被不同類型的細胞克隆。film growth的現(xiàn)象在不需要的時候也會出現(xiàn)，例如在傳統(tǒng)的生物反應器中細胞生長只在攪拌的液體中進行。許多微生物在液體生物反應器中生長困難，因為它們?nèi)菀赘街椒磻鞯谋谏?、i