生物工程生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)翻譯(五)

1、（雙重否定：not.until）第五章 酶和細(xì)胞固定化技術(shù)微生物尤其是酵母已經(jīng)應(yīng)用了幾千年，用于生產(chǎn)啤酒、葡萄酒和其他發(fā)酵產(chǎn)品。然而，直到1878年，負(fù)責(zé)發(fā)酵的酵母細(xì)胞的真正組分才被命名為酶（來(lái)自古希臘語(yǔ)意思是酵母中）。不到二十年后，酶無(wú)生命的本質(zhì)通過(guò)酵母的自由細(xì)胞提取物清楚的證明，其可以催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。在1926年的時(shí)候，通過(guò)脲酶的純化和結(jié)晶才最終證明酶是蛋白質(zhì)。在隨后的幾年了，隨著生物化學(xué)新規(guī)則的發(fā)展，酶被證明存在于一切生命中并被生命細(xì)胞利用催化特定的化學(xué)反應(yīng)。后來(lái)，酶在它們的作用中展現(xiàn)出高度的專(zhuān)一性，以高轉(zhuǎn)化速率發(fā)揮功能而且在低的壓力、低的溫度及水溶液中這樣溫和的生理?xiàng)l件下進(jìn)行操作

2、。盡管酶作用的通常位置是在生命細(xì)胞的內(nèi)部，但有大量的例子是細(xì)胞將酶排出（胞外酶）到環(huán)境中以分解大的有機(jī)分子（蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉），這些分子不能進(jìn)入到細(xì)胞中。對(duì)于某些微生物，胞外酶的生產(chǎn)對(duì)于正常生長(zhǎng)是非常重要的，而且最初商業(yè)化利用的酶就是來(lái)源于此。5.1 分離的酶的商業(yè)角色所有商業(yè)化發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物都是酶在生產(chǎn)微生物中進(jìn)行活動(dòng)的最終結(jié)果。在特定的發(fā)酵中分離的酶能不能代替生產(chǎn)微生物呢？這是經(jīng)常會(huì)問(wèn)到的問(wèn)題，但是在實(shí)際中很少能實(shí)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的結(jié)果。利用整個(gè)微生物肯定會(huì)在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生一定的缺點(diǎn)：（a） 微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的最適條件不同；（b） 大比例的基質(zhì)將轉(zhuǎn)化為生物體；（c） 無(wú)用的副反應(yīng)將會(huì)發(fā)生；

3、（d） 向所希望的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率低；（e） 從發(fā)酵中分離所想要的產(chǎn)物將會(huì)困難。這樣，通過(guò)利用分離純化的酶，如果不是全部，大部分這些限制會(huì)被減少或者克服。最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是更易進(jìn)行控制、對(duì)活動(dòng)更強(qiáng)的預(yù)見(jiàn)性及催化作用專(zhuān)一性的提高。然而，對(duì)于多數(shù)發(fā)酵，對(duì)整個(gè)微生物的傳統(tǒng)應(yīng)用好像很好的延續(xù)著。盡管從微生物、植物和動(dòng)物中分離出了超過(guò)2000種的酶，但是只有不到20種在使用的酶認(rèn)為是對(duì)商業(yè)生產(chǎn)商或者應(yīng)用工業(yè)或服務(wù)業(yè)而言是重要的。目前，商業(yè)生產(chǎn)主要的產(chǎn)品是粗酶形式的相對(duì)簡(jiǎn)單的酶，主要是用于食品和相關(guān)工業(yè)及detergent制造業(yè)（圖5.1工業(yè)酶的分布）。大部分的酶是水解酶，像淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等

4、等，主要的作用是作為添加劑或者烘烤、dairy、釀造和果汁工業(yè)的過(guò)程輔料。與粗酶不同的是，某些高度純化的酶具有迅速擴(kuò)展的市場(chǎng)，像葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖氧化酶。這些酶和許多其他的酶正在藥業(yè)、治療、臨床和化學(xué)分析中尋找更多的應(yīng)用。5.2 酶的來(lái)源商業(yè)用的酶來(lái)源于植物與動(dòng)物組織及篩選出的微生物。通過(guò)傳統(tǒng)方法從植物中獲得的酶包括蛋白酶（木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶）、淀粉酶、脂氧合酶和某些專(zhuān)門(mén)化的酶。從動(dòng)物組織中獲得的酶主要是胰蛋白酶、脂肪酶和生產(chǎn)奶酪的粗制凝乳酶。對(duì)于植物和動(dòng)物來(lái)源都存在著許多供應(yīng)的問(wèn)題；這些包括對(duì)于植物酶來(lái)說(shuō)的季節(jié)變化、低濃度和高過(guò)程成本，而對(duì)于來(lái)自肉類(lèi)工業(yè)副產(chǎn)品的動(dòng)物酶，其

5、供應(yīng)是有限的而且受到其他利用者的競(jìng)爭(zhēng)?，F(xiàn)在顯而易見(jiàn)的是，許多傳統(tǒng)資源對(duì)于世界范圍酶的需求是不足的，更多的求助于為現(xiàn)有酶和新酶尋找微生物資源。實(shí)際中，微生物酶來(lái)源于有限范圍的微生物，尤其是長(zhǎng)期以來(lái)作為食品和飲料生產(chǎn)者的微生物。對(duì)一個(gè)廠(chǎng)家來(lái)說(shuō)從法律部門(mén)獲得使用來(lái)自未經(jīng)證明的微生物的產(chǎn)物的許可是昂貴的，因?yàn)樗鼈儽仨毥?jīng)過(guò)毒性和安全性評(píng)價(jià)。由于這個(gè)原因，許多工業(yè)微生物酶來(lái)源于稍微多于11種的真菌、8種細(xì)菌和4種酵母，而且在實(shí)際過(guò)程中通常會(huì)從這些群體中尋求新的酶（表5.1）。除非發(fā)展更為便宜的安全性檢測(cè)方法，否則發(fā)展產(chǎn)物的新微生物活動(dòng)會(huì)受到許多限制。酶生產(chǎn)的篩選程序是極為復(fù)雜的，尤其是所采用的培養(yǎng)類(lèi)型決定

6、了菌株的選擇。已經(jīng)表明，某些菌株只在表面與固體培養(yǎng)下生產(chǎn)高的酶滴定度，而另一些菌株則回應(yīng)淹沒(méi)培養(yǎng)技術(shù)。這樣，篩選技術(shù)就必須與最終商業(yè)生產(chǎn)過(guò)程相聯(lián)系。5.3 酶的生產(chǎn)選擇微生物后，生長(zhǎng)就必須在最大化生產(chǎn)酶的條件下進(jìn)行。胞外酶對(duì)于胞內(nèi)酶而言有著特殊的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)?，它們的生產(chǎn)不需要昂貴的細(xì)胞破碎技術(shù)；而且，胞外酶在培養(yǎng)液中以相對(duì)較純的形式存在，而胞內(nèi)酶需要更為復(fù)雜的分離純化方法（見(jiàn)第六章）。胞外酶構(gòu)成了工業(yè)微生物酶生產(chǎn)的bulk，但是胞內(nèi)酶正在尋找作為醫(yī)學(xué)和工業(yè)中診斷酶的越來(lái)越重要的角色。所選擇的微生物應(yīng)該對(duì)于酶的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是穩(wěn)定的，可以形成孢子，在廉價(jià)的基質(zhì)上能夠很好的生長(zhǎng)，不生產(chǎn)有毒物質(zhì)而且沒(méi)有抗生

7、素活性。目前工業(yè)酶的生產(chǎn)主要依賴(lài)于deep tank 或者固體發(fā)酵技術(shù)。由于微生物酶通常是小體積產(chǎn)物，所以難于判定用于深層培養(yǎng)生產(chǎn)的特定發(fā)酵設(shè)備的發(fā)展。一般上，抗生素生產(chǎn)所采用的設(shè)備在設(shè)計(jì)與功能上是相類(lèi)似的。一種典型的酶生產(chǎn)生物反應(yīng)器是由不銹鋼制造的，有強(qiáng)大的機(jī)械攪拌器和空氣鼓泡器，且容積為10-50m3。這樣的生物反應(yīng)器有固有的可變性，可以容易的轉(zhuǎn)向生產(chǎn)其他的產(chǎn)品。工業(yè)中采用的工業(yè)生物反應(yīng)器的例子見(jiàn)表5.2。讀者要參考第四章以進(jìn)一步的詳細(xì)了解。一般而言，分批過(guò)程中，胞外酶的生產(chǎn)需要30-50h。停止發(fā)酵的最佳時(shí)間是在最大生產(chǎn)點(diǎn)與最大酶活性點(diǎn)之間。最優(yōu)條件由原料成本、plant容積及便于回收而

8、決定。連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)可以用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模酶的生產(chǎn)，但是沒(méi)有表明有任何一個(gè)商家采用這種方法。分批方法常常被延伸，并且通過(guò)連續(xù)或者半連續(xù)的補(bǔ)給碳水化合物或者蛋白質(zhì)的方式改進(jìn)酶的生產(chǎn)。酶合成沒(méi)有總體的動(dòng)力學(xué)模型，但是已經(jīng)可以對(duì)某些酶的調(diào)控進(jìn)行研究。只有少數(shù)工業(yè)重要的酶是在指數(shù)生長(zhǎng)期生成的，絕大多數(shù)是在指數(shù)生長(zhǎng)期后合成的。有用的酶蛋白的產(chǎn)量可以是培養(yǎng)基初始干物質(zhì)的1-5%，而在一個(gè)典型的酶發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞的產(chǎn)量在相似的基礎(chǔ)上由2-10%變化。生物反應(yīng)中酶的生產(chǎn)是怎樣進(jìn)行調(diào)控的以發(fā)揮商品控制器的優(yōu)勢(shì)？有很多方法可以用來(lái)克服任意一種已建立的限制某一給定的酶生產(chǎn)的控制機(jī)制。原則上，有兩種主要的類(lèi)型：操控微生物的

9、基因元件和控制微生物的生長(zhǎng)環(huán)境。常常是通過(guò)兩種方法的應(yīng)用獲得理想的結(jié)果。微生物的基因操作在第三章已經(jīng)討論過(guò)了，而且如果不是全部也有許多所很好采納的程序發(fā)現(xiàn)對(duì)于酶的調(diào)控研究是有用的。突變體的形成仍是最為常用的工業(yè)方法但是重組dna技術(shù)將被更多的使用，尤其對(duì)于非食品的應(yīng)用。過(guò)程控制器可以操控生長(zhǎng)環(huán)境，通過(guò)選擇合適的培養(yǎng)基組成或者培養(yǎng)參數(shù)而克服由調(diào)節(jié)機(jī)制引起的酶生物合成的抑制。對(duì)于誘導(dǎo)酶，向培養(yǎng)集中加入誘導(dǎo)物是非常有效的。最為廣泛采用的誘導(dǎo)物是不能進(jìn)行代謝的物質(zhì)。降解酶常常通過(guò)誘導(dǎo)和分解代謝物阻遏來(lái)進(jìn)行控制，而生物合成酶主要由反饋調(diào)節(jié)進(jìn)行控制。反饋調(diào)節(jié)包括反饋（或者終產(chǎn)物）抑制和反饋?zhàn)瓒魞煞N形式。酶

10、生物合成的終產(chǎn)物阻遏可以通過(guò)下面方法中的任何一種方法或者所有方法來(lái)避免：（a） 通過(guò)向培養(yǎng)基中添加抑制劑來(lái)限制終產(chǎn)物的積累；（b） 保證在所供應(yīng)的培養(yǎng)集中沒(méi)有終產(chǎn)物；（c） 篩選不被終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變體（組成突變體）。許多工業(yè)重要的酶受到分解代謝物阻遏的影響（表5.3）。實(shí)際中，分解代謝物阻遏是可以避免的，通過(guò)：（a） 誘變以抵制分解代謝物阻遏；（b） 在培養(yǎng)集中避免使用阻遏碳源；（c） 通過(guò)限制生長(zhǎng)使酶的合成去阻遏，包括緩慢的補(bǔ)給阻遏物或者使用緩慢代謝的物質(zhì)（analogues）或者底物的衍生物。在許多重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)中，產(chǎn)物的形成通常發(fā)生在繁殖期，如在最初的快速生長(zhǎng)（生長(zhǎng)期

11、）之后。這種現(xiàn)象最初報(bào)道于青霉素的生產(chǎn)，但是現(xiàn)在已知發(fā)生于許多其他生產(chǎn)中。還不知道引起次級(jí)代謝的因素，但是它確實(shí)導(dǎo)致細(xì)胞特定的酶的組成發(fā)生顯著變化。酶合成的去阻遏見(jiàn)于表5.4中的一些發(fā)酵過(guò)程。固體基質(zhì)培養(yǎng)方法在從真菌中生產(chǎn)商品酶的過(guò)程中占有重要的角色，尤其是在日本。來(lái)自aspergillus 的淀粉酶和來(lái)自aspergillus 及mucor的蛋白酶長(zhǎng)期以來(lái)在商業(yè)上都是重要的。產(chǎn)生出的其他酶有果膠酶和纖維素酶。最開(kāi)始，培養(yǎng)物通過(guò)人工處理在trays上生長(zhǎng)，但是清洗、filling and emptying trays越來(lái)越機(jī)械化的系統(tǒng)得到了發(fā)展。轉(zhuǎn)動(dòng)鼓系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)被越來(lái)越多的使用（見(jiàn)第四章）。固體

12、系統(tǒng)與淹沒(méi)培養(yǎng)過(guò)程相比的優(yōu)缺點(diǎn)已經(jīng)很好的進(jìn)行了分析。固體培養(yǎng)方法進(jìn)行酶生產(chǎn)的主要的積極方面是：（a） 培養(yǎng)箱中單位體積的酶產(chǎn)量高；（b） 能耗低；（c） 需要微控；（d） 提取出高度濃縮的酶溶液；（e） 設(shè)備大小通常小；（f） 不難進(jìn)行放大。在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)補(bǔ)料的方式可以進(jìn)行連續(xù)操作。淹沒(méi)培養(yǎng)方法在目前商品酶的生產(chǎn)中占有主導(dǎo)地位，因?yàn)檫^(guò)程中可以更為容易的控制操作成本和感染的危險(xiǎn)。最終決定一種酶的生產(chǎn)是通過(guò)固體基質(zhì)發(fā)酵還是淹沒(méi)發(fā)酵基本上取決于這兩種過(guò)程的相對(duì)經(jīng)濟(jì)性。yet notwithstanding, 固體基質(zhì)發(fā)酵更接近于許多微生物的自然生長(zhǎng)環(huán)境條件，尤其是真菌。它可能提供了更易被接受的酶

13、活動(dòng)的混合。未來(lái)固體基質(zhì)發(fā)酵方法生產(chǎn)酶的成功進(jìn)行大體上取決于several lines of研究成果，包括微粒間質(zhì)量傳遞、酶對(duì)不溶性物質(zhì)的降解及生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和過(guò)程控制的改進(jìn)（也見(jiàn)于第四章）。5.4 酶的法規(guī)出于對(duì)毒性和其他安全方面的考慮，微生物酶產(chǎn)品需要滿(mǎn)足嚴(yán)格的條例（specification）。在安全性評(píng)估中可能要考慮的方面主要有：（1） 由任何一種存在于產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)引起變態(tài)反應(yīng)，包括酶蛋白和其他任何外來(lái)物質(zhì)；（2） 酶的催化活性；（3） 有毒化合物的出現(xiàn)像真菌毒素和抗生素?？乖杂梢环N酶到另一種酶而變化，盡管它是不能改變的。配制可以減小利用物對(duì)酶的暴露。粉塵形式的酶會(huì)出現(xiàn)許多問(wèn)題，但

14、是可以通過(guò)在任何插入的載體中把酶用囊狀物包裹的方法來(lái)消除出現(xiàn)的問(wèn)題。液體酶產(chǎn)品使用更廣。現(xiàn)在認(rèn)為酶催化活性的的直接影響are of low health concern，總體上，純酶是無(wú)毒的。在酶的制備過(guò)程中，通過(guò)兩種途徑會(huì)產(chǎn)生毒素。有毒物質(zhì)可能存在于培養(yǎng)基中，由于多數(shù)酶產(chǎn)品只經(jīng)過(guò)了粗純化，這種物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)在最終的產(chǎn)品中。這樣為了確保不帶有有毒物質(zhì)，食品或飼料級(jí)的原料應(yīng)該專(zhuān)門(mén)化，而且應(yīng)該對(duì)整個(gè)系統(tǒng)微生物的污染情況進(jìn)行規(guī)律性檢測(cè)。真菌酶毒理學(xué)上主要關(guān)心的是生產(chǎn)菌株中存在的真菌毒素。在過(guò)去的25年里，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到許多真菌都會(huì)生產(chǎn)有毒代謝物和真菌毒素，而且it is obligatory to 對(duì)

15、所有真菌酶樣品進(jìn)行特定真菌毒素的檢測(cè)。許多這樣的真菌毒素在檢測(cè)的微生物中會(huì)表現(xiàn)出致癌的、雌激素的、致突變的及致畸形的活性。對(duì)于危險(xiǎn)的數(shù)量估計(jì)是極其困難的，因?yàn)殛P(guān)于低濃度的真菌毒素在人體中的毒性應(yīng)答的信息是很少的。然而，如果能夠檢測(cè)到真菌毒素，那么這個(gè)產(chǎn)品就不能使用了。用來(lái)生產(chǎn)酶的微生物可以分為三組。根據(jù)這個(gè)分類(lèi)，就需要進(jìn)行不同水平的毒性檢測(cè)（表5.5）。a組微生物傳統(tǒng)上用于食品或者食品生產(chǎn)中。這些情況下不需要進(jìn)行毒理學(xué)研究。b組微生物是那些存在于食品中的無(wú)害污染物，只需要進(jìn)行短期毒性檢測(cè)。 c組是所有未列在a組和b組中的微生物。這種微生物需要更嚴(yán)密的毒理學(xué)研究，包括對(duì)某些特殊動(dòng)物喂養(yǎng)的長(zhǎng)期研究

16、。酶產(chǎn)品安全性由生產(chǎn)商負(fù)責(zé)，而新產(chǎn)品需要獲得相應(yīng)權(quán)威部門(mén)的同意。國(guó)內(nèi)和國(guó)際機(jī)構(gòu)對(duì)某些酶made specification and recommendation。總結(jié)一下，酶產(chǎn)品應(yīng)該是一致的（uniform）、安全可靠的，而且滿(mǎn)足specification是生產(chǎn)商的職責(zé)所在。5.5 固定化酶使用分離的酶的最重要的缺點(diǎn)是在操作條件下它們不足以穩(wěn)定，作為可溶于水的自由分子，它們難于從底物和產(chǎn)物中分離和反復(fù)利用。近年來(lái)，多次嘗試通過(guò)酶固定化的過(guò)程以克服這些缺點(diǎn)。固定化通常被認(rèn)為是酶從一種可溶于水的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為不溶于水的、不可運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)。固定化阻止了酶在反應(yīng)混合物中的分散而且便于通過(guò)簡(jiǎn)單的固/液分離技

17、術(shù)就能從產(chǎn)物流中將其回收。這樣，反應(yīng)產(chǎn)物中沒(méi)有酶，就能夠?qū)γ高M(jìn)行再利用。固定化酶advantageously用于連續(xù)操作生物反應(yīng)器中。發(fā)展了超過(guò)100種的固定化技術(shù)。這些技術(shù)可以分為不同的類(lèi)型。實(shí)際中，酶的固定化的實(shí)現(xiàn)可以通過(guò)將酶共價(jià)連接到一種不溶于水的物質(zhì)的表面上；通過(guò)與適宜試劑的交聯(lián)產(chǎn)生不溶性的微粒；通過(guò)包埋在可透過(guò)酶、底物和產(chǎn)物的一種載體（matrix）或者凝膠中；通過(guò)膠囊封裝；以及通過(guò)固體支持物吸附酶。固定方法的圖列由圖5.2所示，固定化方法見(jiàn)表5.6。酶共價(jià)連結(jié)到固體支持物上 許多類(lèi)型的支持物都可以利用包括porous glass and ceramics（淀粉葡萄糖苷酶）、合成的多

18、聚物（trypsin）、纖維素（天冬酰氨酶、淀粉酶）、尼龍（脲酶）和氧化鋁（葡萄糖氧化酶）。利用肽和蛋白質(zhì)化學(xué)的方法進(jìn)行連接。共價(jià)鍵的形成具有的優(yōu)點(diǎn)是形成一種不能通過(guò)ph、離子強(qiáng)度或者底物而逆轉(zhuǎn)的連接。然而，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生共價(jià)鍵有可能導(dǎo)致酶的部分或者整體失活。共價(jià)連接的方法有許多，固定化的過(guò)程至少由兩步組成，支持物的活化和酶本身的連接。實(shí)際中，參與化學(xué)鍵形成的基團(tuán)是氨基、亞胺基、酰胺、羥基、羧基、巰基、甲基硫、胍基, 咪唑和 酚基。酶包埋于凝膠 原則上，所采用的方法是很溫和的而且不會(huì)破壞酶的活性。可以在凝膠形成之前將酶添加到單體溶液中。通過(guò)改變溫度或者添加凝膠誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)以使凝膠形成。酶維持

19、在它的原始狀態(tài)不會(huì)有封鎖活性位點(diǎn)、基團(tuán)的風(fēng)險(xiǎn)或者化學(xué)鍵封鎖酶分子的風(fēng)險(xiǎn)。然而，這個(gè)固定化形式的主要的缺點(diǎn)就是酶經(jīng)過(guò)pores的不斷流失，及與高分子量化合物尤其相關(guān)的底物和產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)姆稚⒖刂贫姑阜磻?yīng)停滯造成的流失。包埋物質(zhì)包括硅膠、硅橡膠、淀粉和多糖。多糖是最被廣泛采用的包埋載體，已經(jīng)用于天冬酰氨酶、葡萄糖異構(gòu)酶、過(guò)氧化物酶和許多其他的酶。酶的膠囊封裝 這個(gè)方法是對(duì)包含方法的改變，涉及到用半透膜進(jìn)行膠囊封裝。這些膜不能透過(guò)酶和其他巨型分子但是卻可以透過(guò)低分子量的底物和產(chǎn)物。采用的物質(zhì)類(lèi)型包括火棉膠（過(guò)氧化氫酶、l-天冬酰胺酶）、纖維素衍生物（脂肪酶）、聚苯乙烯（過(guò)氧化氫酶）和最經(jīng)常用的尼龍（t

20、rypsin、脲酶）。這些物質(zhì)用來(lái)形成薄的、球狀的半透膜以形成包含有酶的微膠囊。酶吸附于固體基質(zhì)上 吸附最吸引人的特征就是它的簡(jiǎn)便性。吸附的條件不包括反應(yīng)，不對(duì)酶進(jìn)行修飾。最為常用的吸附劑包括許多有機(jī)物和無(wú)機(jī)物像氧化鋁（氨基?；?、淀粉酶）、纖維素（纖維素酶）、clays（過(guò)氧化氫酶）、玻璃（脲酶）、羥基磷灰石（nad焦磷酸化酶）、碳和各種硅材料（淀粉酶）。離子交換易吸附多數(shù)蛋白質(zhì)，出于這個(gè)原因，被廣泛用于酶的固定化。酶的連接是可逆的，因此在有底物和增大離子強(qiáng)度的條件下吸附的酶也能解吸附。與多功能試劑交聯(lián) 如果在有固體支持物的條件下反應(yīng)，那么就會(huì)形成一個(gè)三位網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的酶分子。實(shí)際上，在吸附到合

21、適的載體上之后，酶more usually更經(jīng)常進(jìn)行交聯(lián)。最普遍采用的交聯(lián)劑有aliphatic diamines, 二甲基己二亞氨脂、二甲基辛二亞氨脂、特別是戊二醛。分子間（生成不溶于水的聚集體）與分子內(nèi)都可以發(fā)生交聯(lián)。酶通過(guò)共聚集作用而被固定，例如，合并到多聚物上，常常是與馬來(lái)酐和ethylene發(fā)生共聚作用。一種廣泛采用的方法是先吸附到賽璐玢膜上，然后再和戊二醛交聯(lián)（淀粉酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖氧化酶）。由于經(jīng)過(guò)包埋和微膠囊化，這些衍生物對(duì)巨型分子底物顯示出很少的活性或者無(wú)活性。商業(yè)化固定化酶 合適的固定化方法的選擇主要取決于這個(gè)方法對(duì)酶的活性有怎樣的影響。共價(jià)連接和交聯(lián)在酶和支持物之間產(chǎn)

22、生強(qiáng)的化學(xué)鍵。這些方法相對(duì)而言勞動(dòng)量大并且成本高。它們會(huì)引起嚴(yán)重的酶的失活，而且活性中心會(huì)發(fā)生連接（表5.7固定化酶的限制性）。相對(duì)的，吸附和凝膠包埋的固定化方法簡(jiǎn)單有效，它們?cè)诿负洼d體之間不產(chǎn)生強(qiáng)的鍵。結(jié)果，酶常常從支持物上脫離。這個(gè)問(wèn)題大體上可以通過(guò)將吸附的或者包埋的酶與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)而獲得解決。 許多酶的固定化在實(shí)驗(yàn)室水平都得以實(shí)現(xiàn)了，但是只有很少的情況可以放大到工業(yè)生產(chǎn)。兩個(gè)杰出的商業(yè)化成功是葡萄糖異構(gòu)酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用和青霉素?；冈诳股毓I(yè)的應(yīng)用。 葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖向果糖的部分轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)一種低成本的甜味劑，將會(huì)最終改變?nèi)蚶胹ugar cane and sugar be

23、et ，sucrose 甜味劑傳統(tǒng)原料的方式。至少有四家公司現(xiàn)在供應(yīng)噸量級(jí)的果糖甜味劑，利用不同的微生物資源（streptomyces spp, bacillus coagulans, actinoplanes missouriensis）。實(shí)際中，這些酶需要高的葡萄糖底物濃度以獲得最佳活性。來(lái)源于廉價(jià)淀粉的原料漿以40-50%葡萄糖濃度供應(yīng)到生物反應(yīng)中。連續(xù)進(jìn)行泵操作會(huì)出現(xiàn)黏度的問(wèn)題，但是通過(guò)在高溫（60）下或者高ph（7.5-8.5）下操作可以解決這個(gè)問(wèn)題。發(fā)展的工業(yè)規(guī)模的色譜技術(shù)可以分離果糖和葡萄糖以生產(chǎn)含有55%或者更高果糖量的富集果糖漿。每年有上千噸的這種酶用來(lái)生產(chǎn)成百萬(wàn)噸的果糖漿。

24、過(guò)程數(shù)據(jù)見(jiàn)表5.8。工業(yè)上葡萄糖異構(gòu)酶以固定化酶和固定化細(xì)胞的形式應(yīng)用。第二種重要的工業(yè)用固定化酶是青霉素?；福▉?lái)源于大腸桿菌），它催化天然青霉素的側(cè)鏈去乙?；a(chǎn)6-氨基青霉烷酸（6-apa）。6-apa可以用來(lái)合成有著重要醫(yī)學(xué)應(yīng)用的抗生素半成品。通過(guò)這樣的方法，重要的抗生素氨芐青霉素就可以由苯基甘氨酸和6-apa合成。每年至少生產(chǎn)3500噸6-apa，但是這只需要30噸制備的酶。酶以granular 的形式使用在固定床柱式生物反應(yīng)器中。5.6 固定化細(xì)胞的特性酶的固定化會(huì)引起它的性質(zhì)發(fā)生改變。這些變化歸結(jié)為：（1）酶結(jié)構(gòu)的化學(xué)和/或構(gòu)型發(fā)生變化，（2）固定化酶的異種催化本質(zhì)，和（3）所

25、采用的載體的物理化學(xué)性質(zhì)。生物工程中最具挑戰(zhàn)性的問(wèn)題之一是提高酶的穩(wěn)定性。當(dāng)酶用于生物反應(yīng)器系統(tǒng)時(shí)，其所處環(huán)境通常要比在生物體中惡劣得多。尤其是它們受到高溫、無(wú)活性的雜質(zhì)與沒(méi)有生命細(xì)胞保護(hù)性平衡環(huán)境的影響。甚至在酶化學(xué)發(fā)展許多年后，對(duì)于酶失活的機(jī)制的了解還是很少。虛擬語(yǔ)氣盡管有例子表明酶經(jīng)過(guò)固定化提高了穩(wěn)定性，但是，一般而言，固定化不是穩(wěn)定酶的方法。固定化像其他隨機(jī)處理一樣，有可能提高、降低或者不影響酶的穩(wěn)定性。 be as likely as.生物反應(yīng)中，熱量代表了酶失活的一個(gè)主要原因。酶熱失活肯定是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子的構(gòu)型發(fā)生了改變。 當(dāng)酶共價(jià)連接到一個(gè)固體支持物上的時(shí)候，蛋白質(zhì)分子就變得更緊

26、密而不太能展開(kāi)，這樣就更不容易失活了。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)是不同失活酶模型的共有特征，原因有有機(jī)溶劑、變性劑和ph的改變。因此，與固體支持物多點(diǎn)連接的固定化就為穩(wěn)定酶提供了一個(gè)總體的方法。酶的固定化常常會(huì)導(dǎo)致它們的某些作用特點(diǎn)發(fā)生變化。當(dāng)酶在自由狀態(tài)作用的時(shí)候，對(duì)于過(guò)程中底物、產(chǎn)物、激活劑、抑制劑和輔因子這些所有的組分，系統(tǒng)是同源的。然而，當(dāng)它們固定后，新系統(tǒng)的物化性質(zhì)就在酶分子與水相間產(chǎn)生分隔create partitioning。這樣，希望酶的某些特點(diǎn)與自由溶液中的酶相比能夠發(fā)生重大的變化。相似的，輸送底物到催化劑受到分散抗性的影響。當(dāng)?shù)孜镄枰?jīng)過(guò)水的邊界層從液體bulk輸送到固定化酶再到固定

27、化酶粒子的內(nèi)部的時(shí)候，分散限制就會(huì)產(chǎn)生， 固定化酶粒子可以是凝膠、微膠囊或者中空纖維。固定化酶用于改進(jìn)一個(gè)現(xiàn)有的過(guò)程或者創(chuàng)造出一個(gè)新過(guò)程。它們對(duì)商業(yè)實(shí)踐的滲透還小。早在1983年，固定化系統(tǒng)的商業(yè)工業(yè)化操作只限于7種葡萄糖異構(gòu)酶、4種青霉素?；?、3種氨基?；负腿樗崦福?種葡萄糖?；浮⒁环N天冬氨酸酶和一種延胡羧酸酶。固定化系統(tǒng)的進(jìn)一步應(yīng)用是參與分析與醫(yī)療應(yīng)用，并且將源于新的想法而不是改進(jìn)。目前為止它們有限的成功應(yīng)用的原因是什么？原則上，這些原因可以歸結(jié)為下列因素：（a） 許多工業(yè)過(guò)程所使用的可溶性酶相對(duì)便宜；（b） 向現(xiàn)有過(guò)程引入新的設(shè)備資本capital高；（c） 在總體操作econom

28、y和plant 設(shè)計(jì)規(guī)模上固定化酶所表現(xiàn)出的令人失望的結(jié)果。酶工程的進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用可見(jiàn)于兩個(gè)方面：那些已經(jīng)在使用或者將要應(yīng)用的和那些在真實(shí)的成為技術(shù)與商業(yè)化可用之前需要進(jìn)行重要研究的。第二代酶工程is undoubtedly one of the most exciting and intellectual demanding of many facets of biotechnology.（表5.10）5.7 細(xì)胞固定化細(xì)胞和器官是進(jìn)行生化合成可利用的（feasible）最小單位，由于它們含有輔酶生產(chǎn)系統(tǒng)，ordered muti-enzyme sequence,etc。因此，令人吃驚的是

29、微生物細(xì)胞的固定化技術(shù)在酶固定化之后才得到發(fā)展。然而，實(shí)際中，酶的固定化技術(shù)主要關(guān)心的是單酶系統(tǒng)，催化單一的反應(yīng)如氧化還原、異構(gòu)、水解等等。利用固定酶進(jìn)行除了簡(jiǎn)單的one-stage 反應(yīng)之外的其他反應(yīng)的嘗試遇到了嚴(yán)格的限制，首先就是發(fā)展一種生產(chǎn)（regenaration）輔酶的實(shí)用的( practical,feasible)技術(shù)，其次是缺乏安排酶分子以有序的群體進(jìn)行多步酶催化反應(yīng)的方法。固定化細(xì)胞能不能克服固定化酶的這些缺點(diǎn)并且在細(xì)胞固定化之后還有可能操控整體細(xì)胞代謝嗎？ 在過(guò)去的十年里，用于固定化細(xì)胞和器官的方法得到了迅速發(fā)展，而且制備范圍包括細(xì)胞碎片、器官、細(xì)胞勻漿液、死細(xì)胞、通透性細(xì)胞

30、、休息細(xì)胞、饑餓細(xì)胞和細(xì)胞混合培養(yǎng)液。在多數(shù)情況下，制備物被用作生物催化，一些最近的研究以它們作為親和（affinity）吸附劑。現(xiàn)在，能夠?qū)缀跛械募?xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定并且保持細(xì)胞的viable.這個(gè)過(guò)程不是沒(méi)有缺點(diǎn)，例如向dense細(xì)胞制備物輸送良好的氧氣供給、支持物結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的生長(zhǎng)、甚至改變的細(xì)胞代謝方式都更加困難了。細(xì)胞固定化技術(shù)的承諾是大量的（considerable）而且肯定比固定化酶范圍更大。某些工業(yè)應(yīng)用現(xiàn)在正在操作中。bacillus coagulans的固定化細(xì)胞生產(chǎn)很大份額的高果糖漿，且每年都能產(chǎn)生大量的aspartic and malic acids.在微載體球上生長(zhǎng)的貼壁

31、依賴(lài)型哺乳動(dòng)物細(xì)胞代表了一種出色的細(xì)胞固定化技術(shù)，正用于疫苗、酶、激素、抗體和干擾素的生產(chǎn)。人工固定化 前面所說(shuō)的固定化酶的方法可以用于整個(gè)細(xì)胞。然而，實(shí)際中，用于微生物、動(dòng)物和植物細(xì)胞的主要方法是將細(xì)胞包埋于凝膠或者吸附，但必須注意防止必要的代謝活動(dòng)的失活。這種系統(tǒng)可以容易得從產(chǎn)物中分離生物催化劑并且使其更為穩(wěn)定。在某些情況下，所采用的細(xì)胞是死細(xì)胞，但是仍保留有必需的酶活性。細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理使某些分子通過(guò)膜容易進(jìn)入并且存在。這個(gè)過(guò)程，透過(guò)，涉及細(xì)胞膜上小pores的形成但保留全酶完整?？梢栽诠潭ɑ盎蛘咧筮M(jìn)行細(xì)胞處理。然而，固定化的活細(xì)胞可以在休息狀態(tài)進(jìn)行不同的反應(yīng)，也可以在凝膠載體上活躍生

32、長(zhǎng)的時(shí)候進(jìn)行。固定化的生長(zhǎng)細(xì)胞可以看作更新的或者壽命延長(zhǎng)的生物催化劑，存在于特殊限定的空間區(qū)域并且受到保護(hù)以抵御功能區(qū)以外不利環(huán)境參數(shù)的作用。固定化細(xì)胞過(guò)程最主要的優(yōu)點(diǎn)之一就是能夠再利用。這就為分批過(guò)程連續(xù)地進(jìn)行提供了一種手段并且進(jìn)一步使得維持有高數(shù)量的細(xì)胞獲得快速的反應(yīng)速率。支持物將微生物保留在生物反應(yīng)器中，允許超過(guò)微生物最大比生長(zhǎng)速率的稀釋速率（這樣克服了連續(xù)系統(tǒng)中的洗出問(wèn)題）。微生物細(xì)胞可以生產(chǎn)許多生物合成反應(yīng)必要的輔因子，這就比分離酶具有優(yōu)越性，分離酶需要供應(yīng)輔因子：輔因子的成本是很高的（prohibitively high）。多酶反應(yīng)的spatial組織更好的在整個(gè)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)，與分離

33、和/或固定化酶相反。但是，利用固定化的整個(gè)細(xì)胞也有一些缺點(diǎn)。細(xì)胞中含有大量的有催化活性的酶，在某些過(guò)程中，酶就會(huì)催化不需要的支鏈反應(yīng)（side reaction）?？梢院?jiǎn)單的通過(guò)加熱或者用堿或膽汁鹽處理來(lái)破壞某些不需要的酶反應(yīng)。固定化也會(huì)造成所想要的催化活性的丟失，但是這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)合適的選擇固定化方法來(lái)減少。催化活性的丟失是由于分散障礙阻止（impeding）了底物的通過(guò)或產(chǎn)物的移除固定化休眠或生長(zhǎng)的細(xì)胞，為了維持細(xì)胞生長(zhǎng)而消耗底物作為碳源和能量的來(lái)源，產(chǎn)物的產(chǎn)量將會(huì)減少；隨著固定化細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)物就會(huì)被從凝膠載體上漏出的細(xì)胞所污染。固定化酶或細(xì)胞生物反應(yīng)器 已經(jīng)在前面的第四章講述了針對(duì)發(fā)酵

34、過(guò)程使用的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和操作。這些生物反應(yīng)器，某些類(lèi)型可以用于固定化酶和細(xì)胞，但是總體上，用于發(fā)酵的反應(yīng)類(lèi)型與那些用于固定化酶和細(xì)胞的是極其不同的。當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)固定化過(guò)程的時(shí)候，首先要考慮是采用分批還是連續(xù)操作。多數(shù)情況下會(huì)選擇連續(xù)過(guò)程。kinetic consideration是選擇生物反應(yīng)器時(shí)一個(gè)重要方面?？傮w上，對(duì)多數(shù)反應(yīng)類(lèi)型，packed bed 反應(yīng)器比連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器具有kinetic 優(yōu)越性。在一個(gè)連續(xù)攪拌生物反應(yīng)器中，平均反應(yīng)速率比packed bed 反應(yīng)器中的低，這是因?yàn)椴煌牟僮鞯孜餄舛?。然而，攪拌生物反?yīng)器更適于需要高的氧傳遞速率的反應(yīng)或者添加堿或酸控制ph。必須考慮

35、處理的液體的體積。對(duì)于一種所想要的化合物單位生產(chǎn)，當(dāng)采用連續(xù)方法的時(shí)候，發(fā)酵broth的體積就要非常小。固定化酶和細(xì)胞所采用的生物反應(yīng)器類(lèi)型見(jiàn)于圖5.3。對(duì)（packed bed）固定床與流動(dòng)床生物反應(yīng)器有特殊的興趣。連續(xù)的固定床生物反應(yīng)器被廣泛使用而且關(guān)于底物流動(dòng)表現(xiàn)出三種可能性，向下流動(dòng)、向上流動(dòng)或者循環(huán)流動(dòng)。當(dāng)反應(yīng)速率受底物利用速率的影響時(shí)，循環(huán)就是所選擇的方法。由于底物的向下流動(dòng)會(huì)引起床的壓迫（compression），所以工業(yè)實(shí)踐中常常選擇向上流動(dòng)的方法。相似的，當(dāng)反應(yīng)過(guò)程中釋放氣體，向上流動(dòng)是所喜歡的（be prefered）。固定化生長(zhǎng)細(xì)胞系統(tǒng)會(huì)是有問(wèn)題的，由于解放的細(xì)胞封阻有效

36、空間（粒子間的空間）導(dǎo)致channelling of 底物。在流動(dòng)床中，當(dāng)跨越床下降的壓力等于床的重量的時(shí)候，微粒處于懸浮狀態(tài)。壓力的減少產(chǎn)生a paked bed，而壓力的上升引起淘析或者系統(tǒng)中微粒的移除。當(dāng)?shù)孜锶芤菏歉唣ざ然蛘邭怏w底物或產(chǎn)物參與連續(xù)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的時(shí)候，流動(dòng)床生物反應(yīng)器有著特殊的價(jià)值。固定化系統(tǒng)中微粒的大小對(duì)形成平整的流動(dòng)床來(lái)說(shuō)是重要的。天然黏附固定化 在這種類(lèi)型的固定化中，細(xì)胞通過(guò)天然黏附機(jī)制和subsequent film growth連接到表面上。一些這種類(lèi)型的生物反應(yīng)器包括：（a）microbial film在固定床生物反應(yīng)器的生長(zhǎng)，例如污水處理過(guò)程中的滲濾和滴流f

37、ilters；（b）film在轉(zhuǎn)動(dòng)表面的生物反應(yīng)器或者轉(zhuǎn)動(dòng)的生物連接器（contactors）進(jìn)行生長(zhǎng)，在這里，微生物或者動(dòng)物細(xì)胞can develop on patially submerged disc which rotate through a reservior of nutrient exposing the film growth to liquid and air in sequence;和（c）film在小支持物上的生長(zhǎng)，存在于攪拌釜式或者流動(dòng)床生物反應(yīng)器中，為微生物克隆創(chuàng)造密集的表面積。微粒間的物理接觸和磨損移走了過(guò)量的表面生長(zhǎng)并維持相對(duì)恒定的film厚度。這種微粒有不同的形狀、大小、porosity和密度而且可以被不同類(lèi)型的細(xì)胞克隆。film growth的現(xiàn)象在不需要的時(shí)候也會(huì)出現(xiàn)，例如在傳統(tǒng)的生物反應(yīng)器中細(xì)胞生長(zhǎng)只在攪拌的液體中進(jìn)行。許多微生物在液體生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)困難，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀赘街椒磻?yīng)器的壁上、i