分子生物學(xué)復(fù)習(xí)提綱

1、分子生物學(xué) 復(fù)習(xí)提綱免責(zé)聲明：本資料僅供臨床醫(yī)學(xué)10級學(xué)習(xí)交流使用，基本覆蓋上課重點(diǎn)。由于課程的特殊性，特列成專題形式，個專題中重復(fù)部分在相應(yīng)專題中都會覆蓋。凡應(yīng)只使用本資料應(yīng)試而造成的一切不良后果，均由使用者承擔(dān)，本人不承擔(dān)任何責(zé)任。 第一講 基因表達(dá)調(diào)控（轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵）分子生物學(xué)：是以生物大分子為研究對象，從分子水平去研究并解釋一切生物學(xué)現(xiàn)象并在分子水平上改造和利用生物的一門新興科學(xué)?；颍壕幋aRNA或蛋白質(zhì)的全部核苷酸序列，包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。基因組：細(xì)胞或生物體中一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和，包括所有的基因和基因間區(qū)。結(jié)構(gòu)基因：編碼RNA或蛋白質(zhì)的核苷酸序列

2、。（原核：多順反子、無內(nèi)含子；真核：單順反子、有內(nèi)含子）轉(zhuǎn)錄單位：從啟動子到轉(zhuǎn)錄終止子之間的DNA節(jié)段?；虮磉_(dá)：是指DNA攜帶的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，mRNA通過翻譯將基因的遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)，合成具有生物功能的各種蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)調(diào)控：是指對基因組中某一基因或一些功能相近的基因表達(dá)開啟、關(guān)閉和表達(dá)強(qiáng)度的直接調(diào)節(jié)。遺傳密碼：mRNA上按5到3方向排列的每三個核苷酸稱遺傳密碼。內(nèi)含子：DNA或RNA中的非編碼序列。外顯子：DNA或RNA中的編碼序列。多順反子：一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條mRNA ,編碼幾條功能相關(guān)的多肽鏈。單順反子：一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條mRNA ,編碼一條

3、多肽鏈的生成。 啟動子：是轉(zhuǎn)錄開始時RNA聚合酶識別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄起始所需的一段DNA序列。終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號的一段DNA序列。增強(qiáng)子：能加強(qiáng)其上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。SD序列：mRNA5端在起始密碼子AUG 上游 311bP處，含A-G 短序列，容易與16S r RNA3-端含U-C 序列互補(bǔ)配對，稱為SD 序列，它對mRNA與核糖體的有效結(jié)合并翻譯至關(guān)重要。開放閱讀框ORF：始于起始密碼子并終于終止密碼子的一串密碼子所組成的核苷酸序列。操縱子operon：是由一組功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因連同其上游的調(diào)控序列共同構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄單位，是原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要模式。順式作用元件：是指能

4、夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合來激活或阻遏基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，包括正調(diào)控作用元件和負(fù)調(diào)控作用元件。順式作用元件包括啟動子、增強(qiáng)子、終止子、隔離子和沉默子。反式作用因子：凡直接或間接與順式作用元件相互作用并能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子，包括正調(diào)控 反式因子和負(fù)調(diào)控反式因子。RNA聚合酶是重要的反式作用因子。1、基因的基本結(jié)構(gòu)包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)基因分為單順反子和多順反子。 原核生物為多順反子，一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條mRNA，一條mRNA編碼幾條功能相關(guān)的多肽鏈，無內(nèi)含子。 真核生物為單順反子，一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多條mRNA，一條mRNA編碼一條功能相關(guān)的多肽鏈，有內(nèi)含子。 真核基因組織結(jié)構(gòu)特

5、征：單順反子、斷裂基因、重復(fù)序列。2、 基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平（最經(jīng)濟(jì)有效的調(diào)控）、翻譯水平（SD序列）、翻譯后水平。其中轉(zhuǎn)錄啟動是控制基因表達(dá)最重要的環(huán)節(jié)。原核生物基因表達(dá)調(diào)控為操縱子模式；真核生物基因表達(dá)調(diào)控為染色質(zhì)基因激活、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯和翻譯后加工。3、乳糖操縱子有正調(diào)控與負(fù)調(diào)控兩種形式，正調(diào)控蛋白是CAP，其激活因子是cAMP；阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)是操縱基因O，通過結(jié)合可抑制轉(zhuǎn)錄。4、試述乳糖操縱子的調(diào)控模式：操縱子中各基因的作用即乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)：操縱子是由一組功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因連同其上游的調(diào)控序列共同構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄單位，分為信息區(qū)和調(diào)控區(qū)。信息區(qū)即結(jié)構(gòu)基因區(qū)Zb-半

6、乳糖苷酶、b-半乳糖苷通透酶和b-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶三個結(jié)構(gòu)基因；調(diào)控區(qū)分為調(diào)節(jié)基因R（編碼調(diào)節(jié)蛋白）；啟動子P（RNA聚合酶識別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄起始所需的一段DNA序列）；操縱基因O（轉(zhuǎn)錄開關(guān)，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)）。乳糖操縱子的負(fù)調(diào)控模式： 當(dāng)無乳糖時，調(diào)節(jié)基因編碼有活性的調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶到達(dá)結(jié)構(gòu)基因。因此，結(jié)構(gòu)基因關(guān)閉，無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； 當(dāng)有乳糖時，小分子代謝產(chǎn)物作為變構(gòu)效應(yīng)劑與調(diào)節(jié)基因結(jié)合，使其發(fā)生變構(gòu)，從而改變其活性，調(diào)節(jié)蛋白從有活性變?yōu)闊o活性，不能與操縱基因結(jié)合。因此，操縱基因開放，RNA聚合酶到達(dá)結(jié)構(gòu)基因區(qū)使結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。乳糖操縱子的正調(diào)控模式： 當(dāng)葡萄糖含量降

7、低時，cAMP含量增加，形成cAMPCAP復(fù)合物，結(jié)合到CAP位點(diǎn)，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論：要使乳糖操縱子模式結(jié)構(gòu)基因高表達(dá)的條件是高乳糖、低葡萄糖。第二講 分子雜交與印記技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)：是用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段（探針）來檢測樣品中未知核酸序列（形成異源雙螺旋），再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置或大小顯示出來的技術(shù)。探針probe：是指能與特定核酸序列發(fā)生特異互補(bǔ)雜交，雜交后又能被特殊方法檢測的已知被標(biāo)記的核苷酸鏈。探針的類型包括cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針。探針標(biāo)記的常用方法有放射性標(biāo)記、半抗原標(biāo)記、酶標(biāo)記等。Southern blotting：以DNA

8、/RNA為探針，檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子的過程/方法，用于基因組作圖、測定基因的拷貝數(shù)。Northern blotting：以DNA為探針，檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子的過程/方法，用于RNA的相對分子質(zhì)量、豐度和基因表達(dá)研究。Western blotting：以抗體作探針來檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的抗原蛋白質(zhì)分子的過程/方法，用于特異蛋白質(zhì)的檢測與半定量分析、蛋白質(zhì)分子之間的相互作用研究。1、 分子雜交：Southern blotting、Northern blotting、Western blotting、斑點(diǎn)雜交、菌落雜交、原位雜交。Southern

9、 blotting：以DNA/RNA為探針，檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子的過程/方法，用于基因組作圖、測定基因的拷貝數(shù)。Northern blotting：以DNA為探針，檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子的過程/方法，用于RNA的相對分子質(zhì)量、豐度和基因表達(dá)研究。Western blotting：以抗體作探針來檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的抗原蛋白質(zhì)分子的過程/方法，用于特異蛋白質(zhì)的檢測與半定量分析、蛋白質(zhì)分子之間的相互作用研究。斑點(diǎn)/狹縫雜交：利用純化的DNA或蛋白質(zhì)直接點(diǎn)樣或真空抽濾將樣品固定在膜上，檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子的過程/方法，用于

10、基因組中特定基因及其表達(dá)的定性分析及定量分析。菌落雜交：利用直接印貼，將菌斑印在膜上，檢測固定在膜上經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放的DNA分子的過程/方法，用于基因組文庫和cDNA文庫的篩選。原位雜交：在細(xì)胞水平直接雜交，檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子的過程/方法，可以對生物大分子進(jìn)行胞內(nèi)定位，用于檢測病毒感染等。2、簡述Southern blotting的基本步驟（檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子的過程/方法） 酶切已純化的待測DNA 探針設(shè)計 凝膠電泳分離、變性 制備探針 轉(zhuǎn)移至固體支持物 標(biāo)記探針 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法 預(yù)雜交封閉非特異位點(diǎn) 純化探針 探針與同源DNA片

11、段雜交 漂洗去除非特異結(jié)合探針 檢測及結(jié)果分析 用于基因組作圖、測定基因的拷貝數(shù)3、簡述Nouthern blotting的基本步驟（檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子的過程/方法）提取待測RNA 探針設(shè)計變性、凝膠電泳分離 制備探針轉(zhuǎn)移至固體支持物 標(biāo)記探針預(yù)雜交封閉非特異位點(diǎn) 純化探針探針與RNA片段雜交檢測與結(jié)果分析 用于RNA的相對分子質(zhì)量、豐度和基因表達(dá)研究4、簡述Western blotting的基本步驟（檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的蛋白質(zhì)的過程/方法）分離蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移至膜上加抗體檢測分析目的信號 用于特異蛋白質(zhì)的檢測與半定量分析、蛋白質(zhì)分子之間的相

12、互作用研究5、 電泳的分類：瓊脂糖凝膠電泳核酸，電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)（相對分子質(zhì)量、分子構(gòu)型），凝膠濃度非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同工酶、單鏈DNA，電泳遷移率、分子篩效應(yīng)（相對分子質(zhì)量、分子構(gòu)型）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白質(zhì)、寡核苷酸，相對分子質(zhì)量6、 一般情況下，電泳遷移率：超螺旋>線性>半開環(huán)。酶切片段、PCR產(chǎn)物主要為線性片段（相對分子質(zhì)量）v EDTA的作用是: 抑制Dnase的活性, 降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性v SDS的作用是: 溶解細(xì)胞膜和核膜, 并使蛋白變性v 酚的作用是: 變性沉淀蛋白,抑制DNase的活性v 氯仿的作用是:加速有機(jī)相和水相分層v

13、異戊醇的作用是：消除因蛋白質(zhì)變性而產(chǎn)生的泡沫，從而穩(wěn)定兩相界面v pH8.0的Tris溶液（TE）的作用是:保證抽提時DNA進(jìn)入水相, pH8.0可防止DNA變性v 無水乙醇作用: (在有鹽的條件下)沉淀核酸v 70%乙醇作用: 去除共沉淀的鹽第三講 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR技術(shù)）DNA復(fù)制：是指DNA母鏈的雙鏈解開雙股單鏈，各自分別為模板指導(dǎo)子代合成新的互補(bǔ)鏈，產(chǎn)生與親代相同的子代群體。引物：與模板DNA3末端互補(bǔ)配對的寡核苷酸序列。逆轉(zhuǎn)錄PCR/RT-PCR：是一種將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA與PCR結(jié)合起來，分析基因表達(dá)的一種快速靈敏的方法，其原理是以RNA為模板，依照RNA中核苷酸序列，

14、以dNTPs為原料，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增兩段引物之間的目的基因，常用于研究真核生物可表達(dá)基因。巢式PCR：是一種先用一對外側(cè)引物擴(kuò)增含目的DNA 的大片段，再以擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用另一對內(nèi)側(cè)引物再進(jìn)行擴(kuò)增的PCR方法，用于提高擴(kuò)增效率和產(chǎn)物的特異性。錨定PCR：是一種單特異引物PCR的方法，用于擴(kuò)增一側(cè)序列已知，而另一側(cè)序列未知的核酸片段，用于解決未知序列的擴(kuò)增。不對稱PCR：使用兩種不同濃度的引物進(jìn)行PCR，生成單鏈DNA用于測序。原位PCR：是一種保證細(xì)胞或組織的完整性，使PCR試劑進(jìn)入細(xì)胞并同靶序列接觸，對DNA和RNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原

15、位擴(kuò)增。然后進(jìn)行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結(jié)果的方法。實時/熒光定量PCR：通過引入熒光標(biāo)記分子，將待檢樣品與一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)對照一起擴(kuò)增，通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測，檢測PCR產(chǎn)物量，從而實現(xiàn)對PCR的初始模板含量（靶序列）的精確計算。循環(huán)閾值/Ct值：是PCR擴(kuò)增過程中,熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性反比關(guān)系，拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 1、 DNA體外復(fù)制的反應(yīng)體系（五要素）：DNA

16、模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液（Mg2+）2、 試比較DNA體內(nèi)復(fù)制與體外復(fù)制的反應(yīng)體系的不同。DNA體內(nèi)復(fù)制：DNA模板、引物酶、dNTP、DNA聚合酶、DNA解鏈解旋酶DNA體外復(fù)制：DNA模板、一對引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液（Mg2+）3、PCR技術(shù)的原理：依據(jù)DNA變性與復(fù)性的原理，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。4、 PCR技術(shù)的小結(jié)：與待擴(kuò)增的DNA兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物，決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長度；耐熱的DNA聚合酶，決定PCR擴(kuò)增的效率和保真性；緩沖液中Mg2+的濃度，影響DNA

17、聚合酶的活性；設(shè)置對照，保證質(zhì)量：陽性對照以陽性模板DNA取代樣品DNA； 陰性/空白對照以去離子水取代樣品DNA。5、簡述PCR技術(shù)的基本步驟/反應(yīng)條件：預(yù)變性：94 25min循環(huán)30次： 變性：94 3060sec循環(huán)次數(shù)取決于擴(kuò)增效率圖退火：55 3060sec 退火溫度取決于引物的長度和GC含量延伸：72 3060sec延伸時間取決于被擴(kuò)增片段的長度和DNA聚合酶的擴(kuò)增效率充分延伸：72 5min（保證延伸完全）產(chǎn)物于4保存，產(chǎn)物檢測常用瓊脂糖凝膠電泳的方法 6、PCR中引物的設(shè)計： 若模板鏈為 5ATGAATGATCGAAGTAGACTTACGATAA3 則相應(yīng)的互補(bǔ)鏈為 3TAC

18、TTACTAGCTTCATCTGAATGCTTATT5兩引物：P1：TTATTCGTAAGTC，P2：ATGAATGATCGAAGTA（兩個5端，1820bp，Tm值大致相當(dāng)）7、退火溫度=Tm-5=4（G+C）+2(A+T)-5當(dāng)引物<20bp，Tm=4（G+C）+2(A+T) 當(dāng)引物>20bp，Tm=69.3+0.41（G+C）%8、 PCR產(chǎn)物的保存與檢測PCR產(chǎn)物為混合物，擴(kuò)增產(chǎn)物為線性雙鏈片段，常于4保存。PCR產(chǎn)物的檢測常用瓊脂糖凝膠電泳法（根據(jù)分子量和構(gòu)象不同）。電泳時用marker對照，marker為已知分子量大小的不同片段的混合物，為線性構(gòu)象。電泳后常用EB或SY

19、BR green染料染色，在紫外光下：EB橙紅色，SYBR green綠色。9、PCR反應(yīng)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快捷。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：高純度的模板、引物的質(zhì)量與特異性、DNA聚合酶的質(zhì)量、PCR循壞條件 10、PCR技術(shù)的應(yīng)用：臨床診斷與治療、用于DNA指紋、個體檢測、親子關(guān)系識別、法醫(yī)物證11、如何避免PCR過程中假陽性和假陰性的出現(xiàn)？ 設(shè)置對照選用高純度的模板，避免模板的交叉污染重新設(shè)計特異性引物選用未失活的酶緩沖液中要由適宜濃度的Mg2+選用正確的退火溫度12、 簡述熒光定量PCR定量DNA原理 通過引入熒光標(biāo)記分子，將待檢樣品與一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)對照一起擴(kuò)增，通過對PCR

20、擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測，檢測PCR產(chǎn)物量，從而實現(xiàn)對PCR的初始模板含量（靶序列）的精確計算，主要用于基因表達(dá)分析、病原體核酸的檢測等。13、熒光定量PCR中的熒光標(biāo)記分子被標(biāo)記分子：DNA或mRNA熒光標(biāo)記分子：熒光探針或熒光信號常用熒光信號的檢測方法：DNA結(jié)合染料技術(shù)、水解探針技術(shù)、雜交探針技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)14、簡述DNA結(jié)合染料技術(shù)的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)PCR反應(yīng)體系中加入SYBR Green I染料，能選擇性地結(jié)合到新合成的雙鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，結(jié)合的熒光信號和DNA含量成正比。 優(yōu)點(diǎn)：成本較低，無須對引物或探針進(jìn)行特殊的熒光標(biāo)記，操作亦比較簡單； 缺點(diǎn)

21、：特異性不夠，染料分子會結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高。15、簡述以TaqMan探針（熒光素標(biāo)記探針）作為熒光標(biāo)記分子定量PCR的原理（水解探針技術(shù)）在PCR反應(yīng)體系中增加一個TaqMan探針，其5´端和3´端分別標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)R和熒光淬滅基團(tuán)Q；當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)R（激發(fā)基因）與淬滅基團(tuán)Q（吸收基因）分別位于探針的二端，Q基團(tuán)抑制R基團(tuán)，使其不能發(fā)射熒光； 隨著PCR的進(jìn)行，Taq DNA聚合酶沿模板移動，其5´3´核酸外切酶活性，可逐個水解脫氧核苷三磷酸，繼而R基團(tuán)與Q基團(tuán)隨之分離，R基團(tuán)不再受Q基

22、團(tuán)的抑制，便發(fā)射熒光；R基團(tuán)信號強(qiáng)弱的程度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的拷貝數(shù)成正比。 第四講 其他分子生物學(xué)常用技術(shù)RNA干擾RNA interference： 即生物體內(nèi)一些小的dsRNA 分子能夠高效、特異性地誘導(dǎo)同源的mRNA 降解，從而關(guān)閉基因表達(dá)或使其沉默，這個過程稱為RNA 干擾。生物芯片biochip：是以微電子系統(tǒng)技術(shù)和生物技術(shù)（微加工技術(shù)和微電子技術(shù)）為依托，在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，根據(jù)分子間特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)研究中的許多不連續(xù)過程(如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測和分析步驟)在一塊幾平方厘米大小的芯片上集成化、連續(xù)化、微型化，以實現(xiàn)對大量細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸及其

23、他生物大分子樣品中各數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、快速、高通量檢測。 基因芯片Gene chip：將不同的寡核苷酸探針有序的、高密度的固化在支持物表面，再與樣品中含有標(biāo)記的各種核酸片段進(jìn)行相應(yīng)雜交，或?qū)泻怂岱肿狱c(diǎn)于固相支持物上，然后與游離的寡核苷酸探針雜交，分析待測樣品中基因的表達(dá)情況。蛋白質(zhì)芯片Protein chip：將蛋白質(zhì)如抗原或抗體等固定在支持物表面，與能同它作用的其他蛋白質(zhì)、核酸相互作用，以研究其相互關(guān)系。轉(zhuǎn)基因技術(shù)：是將外源基因?qū)胧荏w動物染色體基因組內(nèi)，使外源基因穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的技術(shù)。基因轉(zhuǎn)移技術(shù)Gene transfer：將外源基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的方法，以研究該基因在轉(zhuǎn)移后的表達(dá)和功能

24、發(fā)揮情況?；蛱蕹夹g(shù)Gene knockout：即有目的地去除（剔除）實驗動物體內(nèi)某特定基因，以終止某一基因的表達(dá)或引入新基因及引入定點(diǎn)突變，從而達(dá)到基因敲除目的的一種技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物：在其基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合有外源基因，并能遺傳給后代的動物。轉(zhuǎn)基因：將通過基因工程獲得的目的基因?qū)胧芫鸭?xì)胞核內(nèi)獲得具有目的基因遺傳性狀的新品種。1、簡述Sanger雙脫氧鏈末端終止法的測序原理 （試述PCR與測序反映的異同：原理+原料）利用高保真DNA聚合酶I，以單鏈DNA為模板，以含標(biāo)記的dNTP為底物，在四組互相獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的雙脫氧核苷三磷酸ddNTP為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，

25、在測序引物引導(dǎo)下，合成四組有序列梯度的互補(bǔ)DNA鏈，后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后直接識讀待測DNA的序列。2、 RNA干擾、生物芯片、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用RNA干擾：基因功能研究（功能失活策略優(yōu)于反義寡核苷酸等基因沉默和基因敲除技術(shù)）、 基因治療應(yīng)用（特異性地抑制特定基因的表達(dá)，治療常見的感覺性疾病、腫瘤）生物芯片：對大量生物樣品進(jìn)行基因分析、DNA序列分析、基因表達(dá)分析、基因診斷、 基因組分析、后基因組分析、高通量藥物篩選、新藥發(fā)現(xiàn)?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)：研究基因的結(jié)構(gòu)和功能、建立動物模型（動物藥廠、特定疾病的生物模型、新型食用動物）基因剔除技術(shù)

26、：研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制、建立疾病動物模型、疾病的基因治療制備生物活性蛋白、擴(kuò)大移植供體來源、改良動物品種第五講 基因工程DNA重組DNA recombination：不同來源的DNA，通過磷酸二酯鍵將末端連接而重新組合成新的DNA分子的過程。 重組DNA技術(shù)：在基因水平上，將目的基因在體外重組于能自我復(fù)制的載體DNA分子上，然后將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增生，以獲得大量DNA片段的拷貝或得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過程?；蚬こ蘂enetic engineering/分子克隆Molecular cloning：在試管內(nèi)應(yīng)用人工方法進(jìn)行基因重組，并將重組的基因?qū)爰?xì)胞或細(xì)菌進(jìn)行復(fù)制

27、、轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。II型限制性核酸內(nèi)切酶RE：是一類能識別雙鏈DNA分子內(nèi)具有回文結(jié)構(gòu)的特異核酸序列，并在識別位點(diǎn)產(chǎn)生切割作用的核酸水解酶?；匚慕Y(jié)構(gòu)Palindrome：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補(bǔ)序列，常為限制酶所識別。黏性末端Sticky end：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端Blunt end：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。載體Vector：能攜帶外源目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA。多克隆位點(diǎn)MCS：指載體具備多個限制酶的單一識別位點(diǎn)，而在載體的其他部位無這些酶的相同位點(diǎn)?？寺≥d體

28、Cloning vector：能夠攜帶目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量目的DNA的一類DNA分子，用于擴(kuò)增某一DNA片段，為研究提供材料或建立資料庫。表達(dá)載體Expression vector：能夠攜帶目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，獲得目的DNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一類DNA分子，用于表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要被克隆或表達(dá)的基因。cDNA文庫：mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA后，再將這些cDNA裝入載體構(gòu)建成的各種從DNA克隆的克隆群。質(zhì)粒Plasmid：存在于大多數(shù)細(xì)菌和某些真核細(xì)胞的染色體以外，能在宿主細(xì)胞中利用宿主酶獨(dú)立自主復(fù)

29、制并穩(wěn)定遺傳的小型共價閉合雙鏈環(huán)狀DNA分子。 定向連接/定向克?。菏雇庠碊NA片段定向插入到載體分子中的克隆方案。T-A克隆: Taq DNA聚合酶在擴(kuò)增目的DNA的同時，能不依賴模板在擴(kuò)增產(chǎn)物兩端分別加上一個游離的“A”,與切口處人工加上游離的“T”的載體即T載體連接,這種克隆方式稱T-A克隆。感受態(tài)（細(xì)胞）Competent cell：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化Transfer：將質(zhì)?；蛞再|(zhì)粒為載體的重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌，使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過程。1、 II型限制性核酸內(nèi)切酶RE是分子克隆中最重要的工具酶，被譽(yù)為分子手術(shù)刀。大部分II型限制性核

30、酸內(nèi)切酶的識別序列為46個堿基對、具有回文結(jié)構(gòu)的DNA片段。2、 DNA重組技術(shù)中的工具酶及其作用II型限制性核酸內(nèi)切酶識別和切割雙鏈DNA分子特異序列DNA連接酶連接切割后的目的基因和載體的互補(bǔ)末端Klenow片段補(bǔ)平雙鏈DNA片段的3末端Taq-DNA聚合酶不依賴模板，在擴(kuò)增產(chǎn)物3末端加A PCR擴(kuò)增目的DNA片段，用于T-A克隆末端轉(zhuǎn)移酶在DNA片段3末端加上同聚物尾，用于標(biāo)記探針的3末端或人工構(gòu)建黏性末端堿性磷酸酶催化切除多聚核苷酸的5磷酸基團(tuán)，防止載體自連DNA連接酶催化DNA鏈的3羥基基團(tuán)與5磷酸基團(tuán)生成35-磷酸二酯鍵。大腸桿菌DNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶能連接

31、黏性末端或平末端。 Klenow片段（DNA連接酶I大片段）保留了53聚合酶活性和35核酸外切酶活性。 合成雙鏈cDNA的第二條鏈、修復(fù)DNA片段的3片段、標(biāo)記探針的3末端、DNA序列分析。 Taq-DNA聚合酶沒有35的校讀功能。不依賴模板，在擴(kuò)增產(chǎn)物3末端加A，使之成為黏性末端。可用于PCR產(chǎn)物的T-A克隆。 末端轉(zhuǎn)移酶用于在DNA片段3末端加上同聚物尾、用于標(biāo)記探針的3末端或人工構(gòu)建黏性末端。 堿性磷酸酶催化切除多聚核苷酸的5磷酸基團(tuán)，防止載體自連。 在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)記前，從RNA或DNA上切除5磷酸基團(tuán)。3、 載體按其功能可分為克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體。克隆載

32、體按其來源可分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體。表達(dá)載體按其來源可分為原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。穿梭載體：既能在原核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的載體。大腸桿菌表達(dá)載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控元件：啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號 強(qiáng)的原核啟動子且能被調(diào)控（Trc啟動子）； 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴因子）； 具合適的SD序列； 正確的閱讀框架。真核表達(dá)載體（哺乳動物的表達(dá)載體通常是人工改建病毒載體）： 原核生物的序列（質(zhì)粒的復(fù)制起始序列、抗生素抗性標(biāo)志基因）； 真核生物的基因表達(dá)調(diào)控元件（啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止、加polyA信號序列）； 真核細(xì)胞的復(fù)制起始序列、可

33、篩選標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)。4、作為基因工程的載體必須具備的條件 能夠穩(wěn)定自主復(fù)制（Ori位點(diǎn)）；具有多克隆位點(diǎn)（MCS）；具有篩選標(biāo)記（抗藥性、酶基因等）；適當(dāng)大小的分子量（一般小于10Kb）；細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)高（松弛型）；配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的調(diào)控元件（啟動子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列等）。5、簡述DNA重組技術(shù)的基本步驟（分、切、連、轉(zhuǎn)、篩） 目的基因的獲取；從基因文庫中獲??；從cDNA文庫中獲?。孓D(zhuǎn)錄法）；人工合成DNA片段；PCR。載體的選擇；目的基因與載體的酶切與連接；重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；重組體的篩選與鑒定。6、質(zhì)粒的提取常利用堿裂解法，質(zhì)粒的鑒定常利用瓊脂糖凝膠電泳法。7、目的基因與載

34、體的連接的方法 同一限制酶切后的連接；不同限制酶切后的連接（平接法、人工接頭法、同聚物加尾連接）；定向連接。 注：單酶切和平末端連接：需用堿性磷酸酶催化切除多聚核苷酸的5磷酸基團(tuán)，防止載體自連。8、DNA重組體的構(gòu)建方案互補(bǔ)末端直接加DNA連接酶連接：目的基因和載體選用相同的酶切割后的平末端或黏性末端的連接目的基因和載體選用不同的酶切割后的平末端與平末端的連接不能避免載體自連和目的基因的雙向插入T-A連接用于PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增和測序非互補(bǔ)末端處理后連接： 同聚物加尾末端轉(zhuǎn)移酶處理用于目的基因和載體均為平末端或不匹配的黏性末端切平S1核酸酶處理用于目的基因和載體為不匹配的黏性末端人工接頭限制酶切割

35、后加DNA連接酶用于目的基因和載體為不匹配的黏性末端定向克隆雙酶切：兩種連接方案黏-黏（非同源互補(bǔ)）、黏-平。注：S1核酸酶的作用：降解單鏈DNA或RNA，使雙鏈DNA突出端變?yōu)槠蕉?多核苷酸激酶的作用：催化多核苷酸5羥基末端磷酸化，制備末端標(biāo)記探針9、簡述感受態(tài)細(xì)胞的概念，及其制備和鑒別原理。感受態(tài)（細(xì)胞）：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。 CaCl2化學(xué)法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理：將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌懸浮于冰冷CaCl2溶液中。經(jīng)冰浴處理一定時間，使細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞具備了感受態(tài)特性，此時加入外源DNA，經(jīng)42°C短時間熱沖擊處理后，促

36、進(jìn)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后細(xì)菌在富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂繁殖，在被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組質(zhì)粒中的基因得到表達(dá)，因而在選擇性培養(yǎng)基上生長，可以選出陽性克隆細(xì)菌。10、重組體篩選的方法和原理（原理后述） 根據(jù)遺傳學(xué)性狀進(jìn)行篩選（注意選用條件） 抗性標(biāo)記篩選（單抗生素標(biāo)記基因，排除未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞）抗性標(biāo)記插入失活篩選（雙抗生素標(biāo)記基因，多克隆位點(diǎn)位于其一內(nèi)，排除含空載體的宿主細(xì)胞）互補(bǔ)篩選/藍(lán)白斑篩選（載體含有Lac酶標(biāo)記基因，多克隆位點(diǎn)位于其內(nèi)）二氫葉酸還原酶標(biāo)記篩選根據(jù)重組DNA的分子生物學(xué)特征進(jìn)行篩選 電泳（分子量大小鑒定、酶切分析）最常用的方法PCR擴(kuò)增核苷酸探針分子雜交

37、（菌落雜交）核苷酸序列測定蛋白質(zhì)水平（表達(dá)產(chǎn)物）鑒定（Western blotting）11、簡述雙抗生素篩選法/抗生素對照篩選/抗性標(biāo)記插入失活篩選的原理 某些質(zhì)粒載體如PBR322質(zhì)粒中裝有Ampr和Tetr抗性基因，在這兩個基因中裝有幾個常用的多克隆位點(diǎn)，如將外源DNA片段插入BamH I識別序列時，則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)閷λ沫h(huán)素敏感Tets。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素的瓊脂糖平皿上不能生長而在含氨芐青霉素的瓊脂糖平皿上能夠生長。因此，將細(xì)菌放在含四環(huán)素或氨芐青霉素的瓊脂糖平皿上培養(yǎng)：凡在兩種平皿上都能夠生長的細(xì)菌所攜帶的質(zhì)粒是空載體，而在含四環(huán)素的瓊脂糖平皿上不能生長而在

38、含氨芐青霉素的瓊脂糖平皿上能夠生長的細(xì)菌可能是含有外源DNA片段的重組質(zhì)粒。12、簡述互補(bǔ)篩選/藍(lán)白斑篩選的原理 某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼-半乳糖苷酶N端145個氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶（-肽）實現(xiàn)-互補(bǔ)，形成完整的-半乳糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入LacZ基因中多克隆位點(diǎn)使其失活時，Lac-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。 （未轉(zhuǎn)化菌陰性克隆藍(lán)斑陰性，轉(zhuǎn)化菌陽性克隆白斑陽性） 問：若未加誘導(dǎo)劑IPTG，

39、培養(yǎng)所得的菌落均呈白色，可能的原因是什么？、 基因不完整（陽性克?。┗蛲暾槐磉_(dá)（陰性克?。?3、簡述根據(jù)重組DNA的分子生物學(xué)特征進(jìn)行篩選各方法的原理 電泳分子量大小鑒定：分別將轉(zhuǎn)化后得到的菌落中的質(zhì)粒DNA提取出來，觀察電泳結(jié)果，可檢測有無外源DNA片段的插入以及插入片段的大小。 電泳酶切分析：分別將轉(zhuǎn)化后得到的菌落中的質(zhì)粒DNA提取出來，用12種限制酶消化質(zhì)粒DNA，觀察電泳結(jié)果，可檢測有無外源DNA片段的插入以及插入片段的大小，也可判斷插入片段的方向。PCR擴(kuò)增：根據(jù)外源DNA片段兩側(cè)的序列設(shè)計上下游引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化

40、細(xì)菌就可能含有目的基因。核苷酸探針分子雜交（菌落雜交）：根據(jù)目的基因的核苷酸序列，設(shè)計寡核苷酸探針并進(jìn)行標(biāo)記，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可直接篩選和設(shè)計目的基因克隆。Western blotting：分別將轉(zhuǎn)化后得到的菌落中表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物提取出來，以蛋白質(zhì)產(chǎn)物的特異性抗體作探針，利用抗原抗體免疫反應(yīng)，觀察電泳結(jié)果，可檢測有無外源DNA片段的插入。核苷酸序列測定：可檢測有無外源DNA片段的插入以及插入片段的大小，也可判斷插入片段的方向，是最確鑿的證據(jù)。第六講 基因診斷與基因治療基因診斷Gene diagnosis：就是利用分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，從DNA或RNA水平檢測分析基因的存

41、在和結(jié)構(gòu)、變異和表達(dá)狀態(tài)，從而對疾病做出診斷的一種方法?；蛑委烥ene therapy：以基因轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)，將某種遺傳物質(zhì)導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮作用，從而達(dá)到治療疾病目的的一種方法。DNA指紋：在人類基因組DNA非編碼區(qū)中存在高度可變的小衛(wèi)星DNA，在同一酶解物的Southern印記圖上同一個體的不同組織來源的DNA譜帶完全一致，而不同個體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋高度個體特異性一樣，這種Southern印記圖被稱為DNA指紋。1、基因診斷的內(nèi)容包括檢測基因結(jié)構(gòu)異常和基因表達(dá)異常。 結(jié)構(gòu)異常：點(diǎn)突變、片段突變、基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性變異、前病毒插入 表達(dá)異常：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

42、的結(jié)構(gòu)或表達(dá)量的異常2、“基因”診斷的方法 DNA：核酸分子雜交（Southern blotting、斑點(diǎn)雜交、菌落雜交、原位雜交、ASO探針雜交）PCR（DNA PCR、PCR-SSCP、多重PCR、原位PCR）、RFLP、限制酶酶切圖譜分析、DNA測序 RNA：Northern blotting、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、基因芯片 蛋白質(zhì)：Western blotting、蛋白免疫組化染色、ELISA、蛋白質(zhì)芯片Southern blotting：以DNA/RNA為探針，檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子的過程/方法，用于檢測基因組中特定基因或序列、鑒定克隆DNA的特殊序

43、列。（大片段缺失）斑點(diǎn)/狹縫雜交：利用純化的DNA或蛋白質(zhì)直接點(diǎn)樣或真空抽濾將樣品固定在膜上，檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子的過程/方法，用于檢測特定基因的存在或表達(dá)情況。原位雜交：在細(xì)胞水平直接雜交，檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子的過程/方法，可以對生物大分子進(jìn)行胞內(nèi)定位，用于檢測特定基因的存在或表達(dá)情況、判斷基因的定位。差異顯示-逆轉(zhuǎn)錄-PCR/DD- RT-PCR：將RT-PCR和測序凝膠電泳結(jié)合起來，對不同類型、不同分化時期細(xì)胞的基因和基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，以獲得對整個細(xì)胞生命過程進(jìn)行分析的有用信息。（點(diǎn)突變、小片段突變）RFLP：由于基因的突變導(dǎo)致某一限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列產(chǎn)生（或消失），酶切后經(jīng)電泳分離出大小不同的片段，包括點(diǎn)多態(tài)性和序列多態(tài)性，用于檢測點(diǎn)突變、突變的純合子和雜合子。（點(diǎn)突變、小片段突變）DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)/PCR